توصيف ناقلات الزنك في الثدييات باستخدام مقايسة نقل الزنك في المختبر

Summary

ثبت أن نقل الزنك يمثل صعوبة في القياس بسبب ضعف الروابط السببية لوظيفة البروتين والدقة الزمنية المنخفضة. يصف هذا البروتوكول طريقة للمراقبة ، بدقة زمنية عالية ، قذف Zn 2+ من الخلايا الحية باستخدام صبغة فلورية حساسة ل Zn 2+ ، وبالتالي توفير قياس مباشر لتدفق Zn²⁺.

Abstract

يجب تنظيم المعادن الانتقالية مثل أيونات Zn²⁺ بإحكام بسبب سميتها الخلوية. في السابق ، تم قياس نشاط ناقلات Zn 2+ بشكل غير مباشر عن طريق تحديد مستوى تعبير الناقل تحت تركيزات مختلفة من Zn²⁺. تم ذلك عن طريق استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، أو قياس mRNA في الأنسجة ، أو تحديد مستويات Zn²⁺ الخلوية. مع تطور مستشعرات Zn 2+ داخل الخلايا ، يتم تحديد أنشطة ناقلات الزنك حاليا بشكل أساسي من خلال ربط التغييرات في Zn 2+ داخل الخلايا ، والتي تم اكتشافها باستخدام مجسات الفلورسنت ، مع التعبير عن ناقلات Zn²⁺. ومع ذلك ، حتى اليوم ، هناك عدد قليل فقط من المختبرات التي تراقب التغيرات الديناميكية في Zn²⁺ داخل الخلايا وتستخدمها لقياس نشاط ناقلات الزنك مباشرة. جزء من المشكلة هو أنه من بين 10 ناقلات الزنك من عائلة ZnT ، باستثناء ZnT10 (ينقل المنغنيز) ، يتم توطين ناقل الزنك 1 (ZnT1) فقط في غشاء البلازما. لذلك ، من الصعب ربط نشاط النقل بالتغيرات في تركيز Zn²⁺ داخل الخلايا. توضح هذه المقالة طريقة مباشرة لتحديد حركية نقل الزنك باستخدام مقايسة تعتمد على صبغة فلورية خاصة بالزنك ، FluoZin-3. يتم تحميل هذه الصبغة في خلايا الثدييات في شكل استر ثم يتم احتجازها في السيتوسول بسبب نشاط ثنائي الإستراز الخلوي. يتم تحميل الخلايا ب Zn 2⁺ باستخدام بيريثيون الأيونوفور Zn²⁺. يتم تقييم نشاط ZnT1 من الجزء الخطي من الانخفاض في التألق بعد غسل الخلية. يتناسب التألق المقاس عند إثارة 470 نانومتر وانبعاث 520 نانومتر مع Zn²⁺ الحر داخل الخلايا. يسمح اختيار الخلايا التي تعبر عن ZnT1 الموسومة بفلوروفور mCherry بمراقبة الخلايا التي تعبر عن الناقل فقط. يستخدم هذا الفحص للتحقيق في مساهمة المجالات المختلفة لبروتين ZnT1 في آلية نقل ZnT1 البشري ، وهو بروتين عبر غشاء حقيقي النواة يقذف الزنك الزائد من الخلية.

Introduction

الزنك هو عنصر تتبع أساسي في الوسط الخلوي. وهو يشتمل على ثلث جميع البروتينات ويشارك في عمليات خلوية مختلفة ، مثل الحفز¹ والنسخ² والزخارف الهيكلية³. ومع ذلك ، على الرغم من كونها خاملة الأكسدة والاختزال ، فإن تركيزات الزنك العالية سامة للخلية ، وهذا هو السبب في عدم بقاء أي كائن حي في الثدييات دون وجود آليات تنظم توازن الزنك. في الثدييات ، هناك ثلاث آليات مسؤولة عن هذه العملية: (1) ميتالوثيونين ، وهي بروتينات غنية بالسيستين الخلوي تربط الزنك بتقارب عال ، وبالتالي تمنع الزنك الخلوي الحر^{الزائد 4} ؛ (2) البروتينات الشبيهة ب Zrt / IRT (ZIPs) ، وهي ناقلات الزنك المسؤولة عن تدفق الزنك....

Protocol

1. نقل الخلايا

1. HEK293T الخلايا المستنبتة في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، و 2 mM L-glutamine ، و 1x البنسلين / الستربتومايسين (انظر جدول المواد) في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO₂ حتى التقائه على صفيحة 10 سم (8.8 × 10⁶ خلايا إجمالية).
2. ضع غطاء واحد 13 مم في كل بئر من آبار صفيحة 12 بئرا. تمييع 0.44 × 10⁶ خلايا تربسين من الخطوة 1.1 في 12 مل من DMEM الكامل. تخلط جيدا عن طريق سحب اللأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات. املأ كل بئر ب 1 مل من المحلول المختلط. تنمو في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO₂ بين عشية وضحاها.

النتائج

ZnT1 هو ناقل زنك للثدييات يقع على غشاء بلازما الخلية¹³. وهو عضو في عائلة بروتين ميسر الانتشار الكاتيوني (CDF) الذي يقذف الزنك من السيتوسول إلى ميليو¹⁴ خارج الخلية. يحتوي ZnT1 على بنية ذات مجالين: المجال عبر الغشاء ، الذي ينقل الأيونات عبر الغشاء ، والمجال الطرفي C

Discussion

تسمح الطريقة الموصوفة أعلاه بالقياس المباشر لتركيز الزنك داخل الخلايا بدقة زمنية عالية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، يمكن لهذه الطريقة التي تتضمن مراقبة التغييرات في Zn²⁺ داخل الخلايا أن تقلل بشكل كبير من ضوضاء الخلفية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن انتقائية الصبغة للزنك تقضي على التفاعلات ا.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm plate	greiner bio-one	664160
12-well cell culture plate	greiner bio-one	665180
13 mm coverslips	Superior Marienfeld	111530
22 mm cover slides	Superior Marienfeld	101050
6-well culture plate	greiner bio-one	657160
Bovine serum albumin	bioWorld	22070008
Calcium chloride anhydrous, granular	Sigma Aldrich	C1016	Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose	Glentham Life Science	GC6947	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope	Nikon	TI-DH	Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30088.03
Fine tweezers	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution	Cytiva	SV30010
LED illumination system	CoolLED	pE-4000
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	1.05833	Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software	Nikon	AR
Pluronic acid F-127	Millipore	540025
Pottasium chloride	Bio-Lab	163823	Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione	Sigma Aldrich	H3261	Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit	Warner Instruments	W4 64-0378
Sodium chloride	Bio-Lab	190305	Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate			Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
	Sigma Aldrich	31665