A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הובלת אבץ הוכחה כמאתגרת למדידה בשל הקשרים הסיבתיים החלשים לתפקוד החלבונים והרזולוציה הטמפורלית הנמוכה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניטור, ברזולוציה טמפורלית גבוהה, של שחול Zn 2+ מתאים חיים על ידי שימוש בצבע פלואורסצנטי רגיש Zn 2+, ובכך מספק מדד ישיר של Zn2+ efflux.

Abstract

מתכות מעבר כגון יוני Zn2+ חייבות להיות מווסתות היטב בשל רעילותן התאית. בעבר, הפעילות של מובילי Zn 2+ נמדדה בעקיפין על ידי קביעת רמת הביטוי של הטרנספורטר בריכוזים שונים של Zn2+. זה נעשה על ידי שימוש באימונוהיסטוכימיה, מדידת mRNA ברקמה, או קביעת רמות Zn2+ תאי. עם התפתחותם של חיישני Zn2+ תוך-תאיים, פעילותם של מובילי אבץ נקבעת כיום בעיקר על ידי מתאם שינויים בטרנספורטרים תוך-תאיים Zn 2+, שזוהו באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות, עם הביטוי של מובילי Zn2+. עם זאת, אפילו כיום, רק מעבדות מעטות מנטרות שינויים דינמיים ב-Zn2+ תוך-תאי ומשתמשות בו כדי למדוד ישירות את הפעילות של מובילי אבץ. חלק מהבעיה היא שמתוך 10 מובילי אבץ ממשפחת ZnT, למעט ZnT10 (מוביל מנגן), רק טרנספורטר אבץ 1 (ZnT1) ממוקם בקרום הפלזמה. לכן, קשה לקשר את פעילות ההובלה לשינויים בריכוז Zn2+ התוך-תאי. מאמר זה מתאר דרך ישירה לקבוע את קינטיקה של הובלת אבץ באמצעות בדיקה המבוססת על צבע פלואורסצנטי ספציפי לאבץ, FluoZin-3. צבע זה נטען לתוך תאי יונקים בצורתו אסטר ולאחר מכן נלכד בציטוזול עקב פעילות די-אסטראז תאית. התאים נטענים ב-Zn 2+ על ידי שימוש בפיריתיון היונופור Zn2+. פעילות ZnT1 מוערכת מהחלק הליניארי של הפחתת הפלואורסצנטיות בעקבות שטיפת התא. הפלואורסצנטיות הנמדדת בעירור של 470 ננומטר ופליטה של 520 ננומטר פרופורציונלית ל-Zn2+ התוך-תאי החופשי. בחירת התאים המבטאים ZnT1 המתויגים עם mCherry fluorophore מאפשרת ניטור רק של התאים המבטאים את הטרנספורטר. בדיקה זו משמשת לחקר תרומתם של תחומים שונים של חלבון ZnT1 למנגנון ההובלה של ZnT1 אנושי, חלבון טרנסממברנה אאוקריוטי המוציא עודפי אבץ מהתא.

Introduction

אבץ הוא יסוד קורט חיוני בסביבה התאית. הוא משלב שליש מכלל החלבונים ומעורב בתהליכים תאיים שונים, כגון קטליזה1, שעתוק2 ומוטיבים מבניים3. עם זאת, למרות היותו אינרטי חמצון-חיזור, ריכוזי אבץ גבוהים רעילים לתא, ולכן אף אורגניזם יונקים לא שרד ללא נוכחות מנגנונים המווסתים את הומאוסטזיס האבץ. ביונקים, שלושה מנגנונים אחראים לתהליך זה: (1) מטלותיונינים, שהם חלבונים עשירים בציסטאין ציטוסולי הקושרים אבץ בזיקה גבוהה, ובכך מונעים עודף אבץ ציטוסולי חופשי4; (2) חלבונים דמויי Zrt/Irt (ZIPs), שהם מובילי אבץ האחראים לזרימת אבץ לתוך הציטוזול דרך קרום הפלזמה או מאברונים תוך-תאיים

Protocol

1. טרנספקציה של תאים

  1. תרבית HEK293T תאים בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 2 מילימטר L-גלוטמין ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים) באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C/5% CO2 עד למפגש על צלחת של 10 ס"מ (8.8 x 106 תאים בסך הכל).
  2. מניחים מכסה אחד בקוטר 13 מ"מ בכל אחת מהבארות של צלחת בת 12 בארות. לדלל 0.44 x 106 תאים טריפסיניים משלב 1.1 ב 12 מ"ל של DMEM מלא. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים. מלא כל באר עם 1 מ"ל של פתרון מעורב. לגדול באינקובטור לח ב 37 ° C / 5% CO2 בן לילה.
  3. החלף את ה-DMEM המלא בכל באר ב-1 ....

תוצאות

ZnT1 הוא טרנספורטר אבץ יונקים הממוקם על קרום פלזמה התא13. הוא חבר במשפחת החלבונים CDF (cation diffusion facilitator) המזרים אבץ מהציטוזול למילייה14 החוץ-תאי. ל-ZnT1 ארכיטקטורה דו-תחומית: תחום טרנסממברנה, המוביל את היונים על פני הממברנה, ותחום C-terminal14. שלא כמו חלבוני CDF ידוע?.......

Discussion

השיטה המתוארת לעיל מאפשרת מדידה ישירה של ריכוז האבץ התוך תאי ברזולוציה טמפורלית גבוהה. בהשוואה לשיטות אחרות, שיטה זו הכוללת ניטור שינויים ב- Zn2+ תוך תאי יכולה להפחית באופן משמעותי את רעשי הרקע. בנוסף, הסלקטיביות של הצבע עבור אבץ מבטלת אינטראקציות צולבות פוטנציאליות עם קטיונים מתכתיי?.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

רז זריבך נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק מס' 163/22). תומר אלי בן יוסף ואריה מורן נתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק מס' 2047/20). ברצוננו להודות לדניאל גיטלר ולקבוצתו באוניברסיטת בן-גוריון על שיתוף הפעולה, התמיכה והמומחיות.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm plategreiner bio-one664160
12-well cell culture plategreiner bio-one665180
13 mm coverslipsSuperior Marienfeld111530
22 mm cover slidesSuperior Marienfeld101050
6-well culture plategreiner bio-one657160
Bovine serum albuminbioWorld22070008
Calcium chloride anhydrous, granularSigma AldrichC1016Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-GlucoseGlentham Life ScienceGC6947Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) Sartorius01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscopeNikonTI-DHDiscontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)CytivaSH30088.03
Fine tweezersDumont0203-55-PS
Fluozin-3AMInvitrogenF24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solutionCytivaSV30010 
LED illumination systemCoolLEDpE-4000
L-glutamineBiological Industries03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrateMerck1.05833Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)FormediumHEPES10Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS cameraANDORDC-152Q-FI
NIS-Elements imaging softwareNikonAR
Pluronic acid F-127Millipore540025
Pottasium chlorideBio-Lab163823Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
PyrithioneSigma AldrichH3261Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease KitWarner InstrumentsW4 64-0378
Sodium chlorideBio-Lab190305Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfateConcentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Sigma Aldrich31665

References

  1. Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
  2. Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron,....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Zn2MRNAZn2Zn2Zn2ZnTZn2FluoZin 3Zn2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved