אפיון מובילי אבץ של יונקים באמצעות בדיקת הובלת אבץ חוץ גופית

Summary

הובלת אבץ הוכחה כמאתגרת למדידה בשל הקשרים הסיבתיים החלשים לתפקוד החלבונים והרזולוציה הטמפורלית הנמוכה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניטור, ברזולוציה טמפורלית גבוהה, של שחול Zn 2+ מתאים חיים על ידי שימוש בצבע פלואורסצנטי רגיש Zn 2+, ובכך מספק מדד ישיר של Zn²⁺ efflux.

Abstract

מתכות מעבר כגון יוני Zn²⁺ חייבות להיות מווסתות היטב בשל רעילותן התאית. בעבר, הפעילות של מובילי Zn 2+ נמדדה בעקיפין על ידי קביעת רמת הביטוי של הטרנספורטר בריכוזים שונים של Zn²⁺. זה נעשה על ידי שימוש באימונוהיסטוכימיה, מדידת mRNA ברקמה, או קביעת רמות Zn²⁺ תאי. עם התפתחותם של חיישני Zn²+ תוך-תאיים, פעילותם של מובילי אבץ נקבעת כיום בעיקר על ידי מתאם שינויים בטרנספורטרים תוך-תאיים Zn 2+, שזוהו באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות, עם הביטוי של מובילי Zn²⁺. עם זאת, אפילו כיום, רק מעבדות מעטות מנטרות שינויים דינמיים ב-Zn²⁺ תוך-תאי ומשתמשות בו כדי למדוד ישירות את הפעילות של מובילי אבץ. חלק מהבעיה היא שמתוך 10 מובילי אבץ ממשפחת ZnT, למעט ZnT10 (מוביל מנגן), רק טרנספורטר אבץ 1 (ZnT1) ממוקם בקרום הפלזמה. לכן, קשה לקשר את פעילות ההובלה לשינויים בריכוז Zn²⁺ התוך-תאי. מאמר זה מתאר דרך ישירה לקבוע את קינטיקה של הובלת אבץ באמצעות בדיקה המבוססת על צבע פלואורסצנטי ספציפי לאבץ, FluoZin-3. צבע זה נטען לתוך תאי יונקים בצורתו אסטר ולאחר מכן נלכד בציטוזול עקב פעילות די-אסטראז תאית. התאים נטענים ב-Zn 2+ על ידי שימוש בפיריתיון היונופור Zn²⁺. פעילות ZnT1 מוערכת מהחלק הליניארי של הפחתת הפלואורסצנטיות בעקבות שטיפת התא. הפלואורסצנטיות הנמדדת בעירור של 470 ננומטר ופליטה של 520 ננומטר פרופורציונלית ל-Zn²⁺ התוך-תאי החופשי. בחירת התאים המבטאים ZnT1 המתויגים עם mCherry fluorophore מאפשרת ניטור רק של התאים המבטאים את הטרנספורטר. בדיקה זו משמשת לחקר תרומתם של תחומים שונים של חלבון ZnT1 למנגנון ההובלה של ZnT1 אנושי, חלבון טרנסממברנה אאוקריוטי המוציא עודפי אבץ מהתא.

Introduction

אבץ הוא יסוד קורט חיוני בסביבה התאית. הוא משלב שליש מכלל החלבונים ומעורב בתהליכים תאיים שונים, כגון קטליזה¹, שעתוק² ומוטיבים מבניים³. עם זאת, למרות היותו אינרטי חמצון-חיזור, ריכוזי אבץ גבוהים רעילים לתא, ולכן אף אורגניזם יונקים לא שרד ללא נוכחות מנגנונים המווסתים את הומאוסטזיס האבץ. ביונקים, שלושה מנגנונים אחראים לתהליך זה: (1) מטלותיונינים, שהם חלבונים עשירים בציסטאין ציטוסולי הקושרים אבץ בזיקה גבוהה, ובכך מונעים עודף אבץ ציטוסולי חופשי⁴; (2) חלבונים דמויי Zrt/Irt (ZIPs), שהם מובילי אבץ האחראים לזרימת אבץ לתוך הציטוזול דרך קרום הפלזמה או מאברונים תוך-תאיים

Protocol

1. טרנספקציה של תאים

1. תרבית HEK293T תאים בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 2 מילימטר L-גלוטמין ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים) באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C/5% CO₂ עד למפגש על צלחת של 10 ס"מ (8.8 x 10⁶ תאים בסך הכל).
2. מניחים מכסה אחד בקוטר 13 מ"מ בכל אחת מהבארות של צלחת בת 12 בארות. לדלל 0.44 x 10⁶ תאים טריפסיניים משלב 1.1 ב 12 מ"ל של DMEM מלא. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים. מלא כל באר עם 1 מ"ל של פתרון מעורב. לגדול באינקובטור לח ב 37 ° C / 5% CO₂ בן לילה.
3. החלף את ה-DMEM המלא בכל באר ב-1 ....

תוצאות

ZnT1 הוא טרנספורטר אבץ יונקים הממוקם על קרום פלזמה התא¹³. הוא חבר במשפחת החלבונים CDF (cation diffusion facilitator) המזרים אבץ מהציטוזול למילייה¹⁴ החוץ-תאי. ל-ZnT1 ארכיטקטורה דו-תחומית: תחום טרנסממברנה, המוביל את היונים על פני הממברנה, ותחום C-terminal¹⁴. שלא כמו חלבוני CDF ידוע?.......

Discussion

השיטה המתוארת לעיל מאפשרת מדידה ישירה של ריכוז האבץ התוך תאי ברזולוציה טמפורלית גבוהה. בהשוואה לשיטות אחרות, שיטה זו הכוללת ניטור שינויים ב- Zn²⁺ תוך תאי יכולה להפחית באופן משמעותי את רעשי הרקע. בנוסף, הסלקטיביות של הצבע עבור אבץ מבטלת אינטראקציות צולבות פוטנציאליות עם קטיונים מתכתיי?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm plate	greiner bio-one	664160
12-well cell culture plate	greiner bio-one	665180
13 mm coverslips	Superior Marienfeld	111530
22 mm cover slides	Superior Marienfeld	101050
6-well culture plate	greiner bio-one	657160
Bovine serum albumin	bioWorld	22070008
Calcium chloride anhydrous, granular	Sigma Aldrich	C1016	Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose	Glentham Life Science	GC6947	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope	Nikon	TI-DH	Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30088.03
Fine tweezers	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution	Cytiva	SV30010
LED illumination system	CoolLED	pE-4000
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	1.05833	Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software	Nikon	AR
Pluronic acid F-127	Millipore	540025
Pottasium chloride	Bio-Lab	163823	Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione	Sigma Aldrich	H3261	Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit	Warner Instruments	W4 64-0378
Sodium chloride	Bio-Lab	190305	Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate			Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
	Sigma Aldrich	31665