אפיון מובילי אבץ של יונקים באמצעות בדיקת הובלת אבץ חוץ גופית

Summary

הובלת אבץ הוכחה כמאתגרת למדידה בשל הקשרים הסיבתיים החלשים לתפקוד החלבונים והרזולוציה הטמפורלית הנמוכה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניטור, ברזולוציה טמפורלית גבוהה, של שחול Zn 2+ מתאים חיים על ידי שימוש בצבע פלואורסצנטי רגיש Zn 2+, ובכך מספק מדד ישיר של Zn²⁺ efflux.

Abstract

מתכות מעבר כגון יוני Zn²⁺ חייבות להיות מווסתות היטב בשל רעילותן התאית. בעבר, הפעילות של מובילי Zn 2+ נמדדה בעקיפין על ידי קביעת רמת הביטוי של הטרנספורטר בריכוזים שונים של Zn²⁺. זה נעשה על ידי שימוש באימונוהיסטוכימיה, מדידת mRNA ברקמה, או קביעת רמות Zn²⁺ תאי. עם התפתחותם של חיישני Zn²+ תוך-תאיים, פעילותם של מובילי אבץ נקבעת כיום בעיקר על ידי מתאם שינויים בטרנספורטרים תוך-תאיים Zn 2+, שזוהו באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות, עם הביטוי של מובילי Zn²⁺. עם זאת, אפילו כיום, רק מעבדות מעטות מנטרות שינויים דינמיים ב-Zn²⁺ תוך-תאי ומשתמשות בו כדי למדוד ישירות את הפעילות של מובילי אבץ. חלק מהבעיה היא שמתוך 10 מובילי אבץ ממשפחת ZnT, למעט ZnT10 (מוביל מנגן), רק טרנספורטר אבץ 1 (ZnT1) ממוקם בקרום הפלזמה. לכן, קשה לקשר את פעילות ההובלה לשינויים בריכוז Zn²⁺ התוך-תאי. מאמר זה מתאר דרך ישירה לקבוע את קינטיקה של הובלת אבץ באמצעות בדיקה המבוססת על צבע פלואורסצנטי ספציפי לאבץ, FluoZin-3. צבע זה נטען לתוך תאי יונקים בצורתו אסטר ולאחר מכן נלכד בציטוזול עקב פעילות די-אסטראז תאית. התאים נטענים ב-Zn 2+ על ידי שימוש בפיריתיון היונופור Zn²⁺. פעילות ZnT1 מוערכת מהחלק הליניארי של הפחתת הפלואורסצנטיות בעקבות שטיפת התא. הפלואורסצנטיות הנמדדת בעירור של 470 ננומטר ופליטה של 520 ננומטר פרופורציונלית ל-Zn²⁺ התוך-תאי החופשי. בחירת התאים המבטאים ZnT1 המתויגים עם mCherry fluorophore מאפשרת ניטור רק של התאים המבטאים את הטרנספורטר. בדיקה זו משמשת לחקר תרומתם של תחומים שונים של חלבון ZnT1 למנגנון ההובלה של ZnT1 אנושי, חלבון טרנסממברנה אאוקריוטי המוציא עודפי אבץ מהתא.

Introduction

אבץ הוא יסוד קורט חיוני בסביבה התאית. הוא משלב שליש מכלל החלבונים ומעורב בתהליכים תאיים שונים, כגון קטליזה¹, שעתוק² ומוטיבים מבניים³. עם זאת, למרות היותו אינרטי חמצון-חיזור, ריכוזי אבץ גבוהים רעילים לתא, ולכן אף אורגניזם יונקים לא שרד ללא נוכחות מנגנונים המווסתים את הומאוסטזיס האבץ. ביונקים, שלושה מנגנונים אחראים לתהליך זה: (1) מטלותיונינים, שהם חלבונים עשירים בציסטאין ציטוסולי הקושרים אבץ בזיקה גבוהה, ובכך מונעים עודף אבץ ציטוסולי חופשי⁴; (2) חלבונים דמויי Zrt/Irt (ZIPs), שהם מובילי אבץ האחראים לזרימת אבץ לתוך הציטוזול דרך קרום הפלזמה או מאברונים תוך-תאיים 4,5,6,7,8; ו-(3) ZnTs, שהם תת-קבוצה של יונקים ממשפחת CDF (cation diffusion facilitator) הנמצאים בכל מקום, והם מובילי אבץ, מכיוון שהם מפיצים אבץ מהציטוזול דרך קרום הפלזמה או לתוך האברונים התוך-תאיים 4,5,6,7,8,9. בשל חשיבותו של אבץ לחילוף החומרים בתאים, חיוני להבין את הדינמיקה של אבץ בתאים.

שיטות קודמות להערכת דינמיקת אבץ התמקדו בהערכת רמות הביטוי של mRNA בתנאי אבץ שונים, על-ידי קורלציה שלהן למדידות אבץ בתאים של רקמות קבועות או תאים^10,11,12. שיטות אלה כוללות זיהוי כימי וצביעה אימונוהיסטוכימית. עם זאת, שיטות אלה מניבות רק מדדים עקיפים, ולכן קובעות רק מתאם לא מקוון בין ריכוז אבץ תוך-תאי לבין ביטוי מובילי אבץ. כתוצאה מכך, שיטות אלה אינן יכולות להסיק פרמטרים הדורשים רזולוציה זמנית גבוהה.

מדידה ישירה יותר של הובלת Zn²⁺ משתמשת באיזוטופים רדיואקטיביים של אבץ¹³. שיטה זו מסתמכת על מדידה של Zn²⁺ המסומן ברדיו כדי לנטר את הובלת האבץ ואת הקינטיקה שלו. עם זאת, בשל חשיבותו של אבץ להומאוסטזיס תאי, תהליכים תאיים מרובים מווסתים את ריכוז האבץ התוך-תאי. בין אלה קשירה חוץ-תאית ומספר מערכות תחבורה הפועלות בתיאום כדי לשמור על שליטה הדוקה ברמות Zn²⁺ תוך תאי. השילוב של תהליכים אלה יוצר רעשי רקע ניכרים, מה שמקשה על בדיקת פונקציות הובלה בודדות הקשורות לאבץ.

מאמר זה מדגים שיטה לניטור ישיר של קצב העברת האבץ על-ידי מדידת ריכוז האבץ החופשי התוך-תאי באמצעות צבע פלואורסצנטי ספציפי לאבץ, FluoZin-3. לצבע יש סגוליות גבוהה עבור Zn²⁺ והפרעה מועטה מקטיונים דו-ערכיים אחרים, כגון סידן. בנוסף, בצורתו אסטר, הוא נכנס לתאים על ידי דיפוזיה nonionic ולאחר מכן הוא לכוד עקב הפעילות של di-esterase תאי. לפיכך, הפלואורסצנטיות שלו מתואמת בעיקר עם ריכוז האבץ הציטוסולי החופשי. ניסויים אלה נערכו כדי לחקור את הקשר מבנה-פונקציה של טרנספורטר אבץ 1 (ZnT1), חבר במשפחת ZnT.

Protocol

1. טרנספקציה של תאים

1. תרבית HEK293T תאים בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 2 מילימטר L-גלוטמין ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים) באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C/5% CO₂ עד למפגש על צלחת של 10 ס"מ (8.8 x 10⁶ תאים בסך הכל).
2. מניחים מכסה אחד בקוטר 13 מ"מ בכל אחת מהבארות של צלחת בת 12 בארות. לדלל 0.44 x 10⁶ תאים טריפסיניים משלב 1.1 ב 12 מ"ל של DMEM מלא. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים. מלא כל באר עם 1 מ"ל של פתרון מעורב. לגדול באינקובטור לח ב 37 ° C / 5% CO₂ בן לילה.
3. החלף את ה-DMEM המלא בכל באר ב-1 מ"ל DMEM ללא סרום (ראה טבלת חומרים) בכל באר. החזירו את צלחת 12 הקידוחים לאינקובטור הלח כמו בשלב 1.1.
4. עבור כל באר טרנספקציה, לדלל 1 מיקרוגרם של פלסמיד pAAV2 המכיל את החלבון של עניין מתויג עם חלבון פלואורסצנטי mCherry (קובץ משלים 1) ב 100 μL של DMEM ללא סרום בצינור 1.5 מ"ל.
5. הוסף 3 מיקרוגרם של פוליאתילנאימין (PEI, ראה טבלת חומרים) ל- 100 מיקרוליטר DMEM ללא סרום לכל טרנספקציה, כאשר כל טרנספקציה בצינור אחר של 1.5 מ"ל. יחס פלסמיד:PEI צריך להיות 1:3 (מיקרוגרם:מיקרוגרם).
6. מערבלים את שני הצינורות משלב 1.4 ושלב 1.5 למשך 10 שניות, ומשאירים לנוח בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לפחות.
7. ערבב חלק אחד (100 μL לכל באר) של תמיסת ה- DNA משלב 1.4 עם חלק אחד (100 μL לכל באר) של תמיסת PEI משלב 1.5. מערבול את הפתרון הסופי במשך 10 שניות, ולהשאיר אותו לנוח בטמפרטורת החדר לפחות 20 דקות עד 6 שעות.
8. קח את צלחת 12 בארות מהאינקובטור. מערבלים את הפתרון הסופי משלב 1.7, ומוסיפים 200 μL לכל אחת מהבארות בלוח 12 הקידוחים משלב 1.3. החזירו את צלחת 12 הקידוחים לאינקובטור הלח (שלב 1.1).
9. לאחר 3 שעות, להחליף את המדיום בכל באר עם 1 מ"ל של DMEM מלא. החזירו את צלחת 12 הקידוחים לאינקובטור הלח כמו בשלב 1.1.
10. לאחר יומיים, קח את תרבית התאים הנגועים מאינקובטור 37 ° C / 5% CO₂ , והנח אותה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך באמצעות הגדלה פי 10.
11. באמצעות גלגל המיקוד של המיקרוסקופ, התמקדו בתאים תוך שימוש באור שדה בהיר.
12. עברו לעירור פלואורסצנטי של דובדבן (587 ננומטר) ולאורכי גל של פליטה (610 ננומטר), וכבו את אור השדה הבהיר. בדוק את הפלואורסצנטיות של התאים כדי לאשר את הביטוי של ZnT1 mCherry.
13. הכינו את תמיסת העמסת הצבע.
    1. קח aliquot של 4 μL של צבע פלואורסצנטי ספציפי אבץ (ראה טבלה של חומרים) בצורת אסטר אצטוקסימתיל (AM) שלה, מומס DMSO (1 מיקרוגרם / μL), ממלאי מוגן אור מאוחסן במקפיא -20 ° C. צורה זו מאפשרת לצבע להיכנס לתא דרך קרום הפלזמה על ידי דיפוזיה פשוטה.
    2. הוסף 4 μL של 10% חומצה פלורונית (או 2 μL של 20% חומצה פלורונית, ראה טבלת חומרים) לאליציטוט משלב 1.13.1. מערבבים היטב את התמיסה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה שלוש פעמים, ולאחר מכן להוסיף את כל 8 μL לצינור 1.5 מ"ל.
    3. הוסף 750 μL של תמיסה של רינגר (מוכן בבית, ראה טבלה של חומרים להרכב) בתוספת 1 מ"ג / מ"ל (~ 0.1%) אלבומין בסרום בקר לצינור משלב 1.13.2, ומערבל במרץ. מוסיפים עוד 750 μL של אותה תמיסה, ומערבלים שוב כדי להבטיח ערבוב מקסימלי.
14. הוסף 750 μL של הפתרון הסופי משלב 1.13.3 לשתי בארות בלוח תרבית חדש בן 6 בארות. מכסים ברדיד אלומיניום.
    הערה: כדי למנוע הלבנה, צלחת 6 הבארות מכוסה תמיד ברדיד אלומיניום משלב זה.
15. בעזרת טוויטר עדין, קחו עד ארבע כיסויים משוכפלים מצלחת תרבית התאים הנגועה, והניחו אותם בבאר המלאה הראשונה (עד ארבע שקופיות לכל באר) של הצלחת החדשה בעלת 6 הקידוחים משלב 1.14. חזור על תהליך זה עבור השני מלא היטב.
    הערה: כל הכיסויים באותה באר מלאה חייבים להיות מאותו מצב. עם זאת, כל באר יכולה להכיל תנאים שונים.
16. מכסים ברדיד אלומיניום ומנערים בעדינות במשך 15-20 דקות.
17. הסר את תמיסת העמסת הצבע והחלף אותה בתמיסת כביסה חדשה של אלבומין פלוס של רינגר, כפי שנעשה בו שימוש בשלב 1.13.3. מכסים ברדיד אלומיניום. השאירו לנער שוב למשך 20 דקות. זה מאפשר את המחשוף של אסטר AM על ידי אסטרזות תאיות.

2. הכנת מיקרוסקופ

1. סדרו את הכלים הדרושים (ראו טבלת חומרים) כאמור: מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המסוגל לזהות פלואורופורים מסוג GFP ו-mCherry, מערכת זילוח המאפשרת מעבר בין שתי תמיסות לפחות, מערכת יניקה ותא זילוח.
2. הפעל את המיקרוסקופ, את מקור האור שלו ואת המצלמה. הפעל את מערכת היניקה.
3. לשטוף את מערכת זילוח. שטפו את התא הראשון בתמיסת רינגר ואת התא השני בתמיסת רינגר המכילה תמיסת אבץ 7 מיקרומטר בתוספת פיריתיון 7 מיקרומטר (יונופור אבץ, ראו טבלת חומרים). כדי למנוע בועות אוויר או רווחים, השאירו מעט נוזלים בכל חדר.
   הערה: מכיוון ששני המיכלים מחוברים לאותו צינור המחובר לתא הזילוח, יש לוודא תמיד שהמקטע המשותף נשטף בתמיסת רינגר.
4. סגרו את הברזים, ומלאו את התאים המתאימים בתמיסת רינגר ותמיסת אבץ של רינגר, כמו בשלב 2.3.

3. הכנת מדגם

1. קחו את תא הזילוח והניחו אותו כשהצד הצר של החריץ פונה כלפי מעלה.
   הערה: החריץ הוא חור באמצע תא הזלוף. זה מאפשר לנוזל הזלוף גישה לתאים. צד אחד של החריץ צר, והצד הנגדי רחב.
2. יש למרוח סיליקון איטום (ראו טבלת חומרים) סביב החריץ. נקו כל סיליקון איטום מהחריץ בעזרת קצה פיפטה.
   הערה: ודא שיש מספיק אטם סיליקון סביב החריץ כדי לאטום כיסוי בקוטר 22 מ"מ.
3. בעזרת טוויטר עדין, קחו פתק כיסוי מתמיסת הכביסה, והניחו אותו על גבי החריץ כשהתאים פונים כלפי מטה. בדרך זו, התאים ייחשפו לתמיסה המנקבת את החריץ במהלך הניסוי.
4. הניחו מכסה בקוטר 22 מ"מ על גבי הכיסוי בקוטר 13 מ"מ, והדקו אותו באמצעות הטוויטר. היזהרו לא לפצח את הכיסויים.
5. הפוך את התא, ולחץ עליו כדי לשחרר את כל הנוזלים הנוכחיים. מלאו את החריץ ב-100 מיקרוליטר של תמיסת הכביסה של רינגר ולחצו שוב כדי לוודא שאין דליפה.
   הערה: אם מתגלה נזילה, יש למרוח חומר איטום במקום הנזילה ולבצע בדיקה חוזרת.
6. הרכיבו את תא הזילוח על הרציף, ואבטחו אותו. הניחו את צינורות הזילוח והיניקה כדי לאפשר זילוח על התאים בחריץ.
7. שנו את קצב הזילוח לכ-2 מ"ל/דקה, והפעילו את הזלוף של תמיסת הצלצול. ודא שמערכת הזילוח פועלת ללא דליפה או זליגה.

4. הכנת מדידה

1. פתח את תוכנת ההדמיה (ראה רשימת חומרים) על-ידי לחיצה כפולה על הסמל. התחבר עם האישורים הרלוונטיים. בחר את המצלמה המצורפת ולחץ על אישור.
2. הגדר את הגדלת המיקרוסקופ ל -10x באמצעות הלחצן בצד שמאל של המיקרוסקופ.
3. בחירת תצוגה חיה ושימוש בג'ויסטיק, הזז את הפלטפורמה כדי להתמקד בתאים בחריץ.
4. בזמן שהזילוח דולק, כבה את האורות ושנה את אורך הגל ל- mCherry על ידי לחיצה על הכפתור הייעודי בממשק. כוונן את המיקוד באמצעות גלגל המיקוד של המיקרוסקופ.
5. ברגע שהמיקרוסקופ מתמקד בתאים, הזיזו את הפלטפורמה באמצעות הג'ויסטיק כדי לאפשר בחירה של טלאי התאים המתאימים.
   הערה: אזור מתאים נחשב לאזור עם לפחות 10 תאים עבור החזר השקעה ואזור ריק עבור רקע.
6. בחר בתפריט הנפתח הפעלה/כיבוי של החזר השקעה ובחר צייר החזר השקעה מעגלי.
7. צייר ROI של אשכולות תאים עם התאים המבטאים mCherry (מציין את הביטוי של ZnT1).
8. מאותו סרגל כלים כמו שלב 4.6, לחץ על לחצן הפעלה/כיבוי של החזר השקעה ברקע והתאם את המיקום והגודל של החזר ההשקעה על הרקע לאזור ללא תאים כלל.
   1. בדוק עם אורכי הגל mCherry ו- EGFP כדי לוודא שאין תאים בהחזר ההשקעה על הרקע שנבחר.
      הערה: אורכי הגל הותאמו כך ש-mCherry השתמש באורך גל עירור של 520 ננומטר ובאורך גל פליטה של 610 ננומטר ו-EGFP השתמש באורך גל עירור של 470 ננומטר ובאורך גל פליטה של 520 ננומטר.
9. בחר בכרטיסיית המשנה אורך גל (λ). סמן את תיבת הסימון שלו וודא שאורך הגל של GFP קיים ותיבת הסימון שלו מסומנת. אם לא, הוסף וסמן אותו.
10. בחר בכרטיסיה המשנה משך . הגדר את מרווח המדידה כ- 5 שניות, ושנה את מספר המרווחים כך שיתאימו למשך הניסוי.
11. באזור פוקוס בלוח המיקרוסקופ מתחת לעינית, לחץ על כפתור מופעל כדי להפעיל את מערכת המיקוד המושלם (PFS).
12. באמצעות גלגל המיקוד של PFS, התאם את המיקוד. בממשק התוכנה, תחת ND Acquisition, ודא ש - PFS מופעל מסומן.
13. לחץ על הפעל כעת.

5. הליך ניסיוני

1. התחל במדידת תקופת הבסיס של 90 שניות באמצעות זילוח הפתרון של Ringer.
2. לאחר סיום תקופת ההתחלה, כבה את זילוח התמיסת של הצלצול ולאחר מכן הפעל את זילוח תמיסת האבץ של הצלצול. סמן את החלפת הפתרון על ידי לחיצה על הדגל האדום בפינה השמאלית התחתונה של לוח הממשק הראשי. צפויה להופיע עלייה בפלואורסצנטיות.
3. ברגע שעליית הפלואורסצנטיות מתחילה להרוות, החליפו בחזרה לזילוח עם התמיסה של רינגר. כבו את זילוח תמיסת האבץ של הצלצול ולאחר מכן הפעילו את זילוח התמיסה של הצלצול.
4. המתן עד שזמן הניסוי יפוג. צפויה ירידה ניכרת אך יציבה בפלואורסצנטיות אם ה-ZnT1 פועל כראוי.

6. ייצוא נתונים

1. כדי לייצא את הנתונים עם חיסור בסיסי, לחץ על הלחצן Subtract Baseline והצג את השינויים בחלון הרכישה ND.
2. לחץ על כפתור ייצוא בממשק התוכנה בחלון "רכישת ND". גליון נתונים של Excel ייפתח. שמור במיקום הרצוי.

7. ניתוח נתונים

1. עבור כל החזר השקעה, צור פלואורסצנטיות בסיסית ממוצעת בין 90 ל-100 השניות הראשונות.
2. בטא את הפלואורסצנטיות המחושבת עבור כל החזר השקעה כאחוז מהרקע עבור החזר השקעה זה.
3. צור ממוצע שורה של כל החזר ההשקעה והתווה את התוצאה כתרשים קווי. זה יוצר ממוצע של כל ה- ROI כפונקציה של זמן.
4. באמצעות פונקציית ההתאמה הליניארית, בחר את הקצב ההתחלתי לירידה בפלואורסצנטיות לאחר השטיפה עם תמיסת רינגר. ערך השיפוע של המשוואה מתואם עם קצב ההובלה.

תוצאות

ZnT1 הוא טרנספורטר אבץ יונקים הממוקם על קרום פלזמה התא¹³. הוא חבר במשפחת החלבונים CDF (cation diffusion facilitator) המזרים אבץ מהציטוזול למילייה¹⁴ החוץ-תאי. ל-ZnT1 ארכיטקטורה דו-תחומית: תחום טרנסממברנה, המוביל את היונים על פני הממברנה, ותחום C-terminal¹⁴. שלא כמו חלבוני CDF ידוע?...

Discussion

השיטה המתוארת לעיל מאפשרת מדידה ישירה של ריכוז האבץ התוך תאי ברזולוציה טמפורלית גבוהה. בהשוואה לשיטות אחרות, שיטה זו הכוללת ניטור שינויים ב- Zn²⁺ תוך תאי יכולה להפחית באופן משמעותי את רעשי הרקע. בנוסף, הסלקטיביות של הצבע עבור אבץ מבטלת אינטראקציות צולבות פוטנציאליות עם קטיונים מתכתיי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm plate	greiner bio-one	664160
12-well cell culture plate	greiner bio-one	665180
13 mm coverslips	Superior Marienfeld	111530
22 mm cover slides	Superior Marienfeld	101050
6-well culture plate	greiner bio-one	657160
Bovine serum albumin	bioWorld	22070008
Calcium chloride anhydrous, granular	Sigma Aldrich	C1016	Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose	Glentham Life Science	GC6947	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope	Nikon	TI-DH	Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30088.03
Fine tweezers	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution	Cytiva	SV30010
LED illumination system	CoolLED	pE-4000
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	1.05833	Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software	Nikon	AR
Pluronic acid F-127	Millipore	540025
Pottasium chloride	Bio-Lab	163823	Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione	Sigma Aldrich	H3261	Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit	Warner Instruments	W4 64-0378
Sodium chloride	Bio-Lab	190305	Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate			Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
	Sigma Aldrich	31665