Caractérisation des transporteurs de zinc chez les mammifères à l’aide d’un test in vitro de transport du zinc

Résumé

Le transport du zinc s’est avéré difficile à mesurer en raison des faibles liens de causalité avec la fonction des protéines et de la faible résolution temporelle. Ce protocole décrit une méthode de surveillance, avec une haute résolution temporelle, de l’extrusion de Zn 2+ à partir de cellules vivantes en utilisant un colorant fluorescent sensible au Zn 2+, fournissant ainsi une mesure directe de l’efflux de Zn²⁺.

Résumé

Les métaux de transition tels que les ions Zn²⁺ doivent être étroitement réglementés en raison de leur toxicité cellulaire. Auparavant, l’activité des transporteurs de Zn 2+ était mesurée indirectement en déterminant le niveau d’expression du transporteur sous différentes concentrations de Zn²⁺. Cela a été fait en utilisant l’immunohistochimie, en mesurant l’ARNm dans les tissus ou en déterminant les niveaux cellulaires de Zn²⁺. Avec le développement des capteurs intracellulaires de Zn 2+, les activités des transporteurs de zinc sont actuellement principalement déterminées en corrélant les changements dans le Zn 2+ intracellulaire, détectés à l’aide de sondes fluorescentes, avec l’expression des transporteurs de Zn²⁺. Cependant, même aujourd’hui, seuls quelques laboratoires surveillent les changements dynamiques du Zn²⁺ intracellulaire et l’utilisent pour mesurer directement l’activité des transporteurs de zinc. Une partie du problème est que sur les 10 transporteurs de zinc de la famille ZnT, à l’exception du ZnT10 (transport du manganèse), seul le transporteur de zinc 1 (ZnT1) est localisé à la membrane plasmique. Par conséquent, il est difficile d’établir un lien entre l’activité de transport et les changements de la concentration intracellulaire de Zn²⁺. Cet article décrit un moyen direct de déterminer la cinétique de transport du zinc à l’aide d’un test basé sur un colorant fluorescent spécifique au zinc, FluoZin-3. Ce colorant est chargé dans les cellules de mammifères sous sa forme d’ester, puis piégé dans le cytosol en raison de l’activité cellulaire de la di-estérase. Les cellules sont chargées en Zn 2+ en utilisant l’ionophore pyrithione Zn²⁺. L’activité de ZnT1 est évaluée à partir de la partie linéaire de la réduction de la fluorescence après le lessivage cellulaire. La fluorescence mesurée à une excitation de 470 nm et à une émission de 520 nm est proportionnelle au Zn²⁺ intracellulaire libre. La sélection des cellules exprimant ZnT1 marquées avec le fluorophore mCherry permet de ne surveiller que les cellules exprimant le transporteur. Ce test est utilisé pour étudier la contribution de différents domaines de la protéine ZnT1 au mécanisme de transport de la ZnT1 humaine, une protéine transmembranaire eucaryote qui extrude l’excès de zinc de la cellule.

Introduction

Le zinc est un oligo-élément essentiel dans le milieu cellulaire. Il incorpore un tiers de toutes les protéines et est impliqué dans divers processus cellulaires, tels que la catalyse¹, la transcription² et les motifs structurels³. Cependant, bien qu’elles soient inertes en matière d’oxydoréduction, des concentrations élevées de zinc sont toxiques pour la cellule, c’est pourquoi aucun organisme mammifère n’a survécu sans la présence de mécanismes régulant l’homéostasie du zinc. Chez les mammifères, trois mécanismes sont responsables de ce processus : (1) les métallothionéines, qui sont des protéines cytosoliques riches en cystéine qui se lient au zinc à haute affinité, empêchant ainsi l’excès de zinc cytosolique libre⁴ ; (2) les protéines de type Zrt/Irt (ZIPs), qui sont des transporteurs de zinc responsables de l’afflux de zinc dans le cytosol à travers la membrane plasmique ou à partir d’organites intracellulaires 4,5,6,7,8 ; et (3) les ZnT, qui sont un sous-ensemble de mammifères de la famille des facilitateurs de diffusion cationique (CDF) omniprésents et sont des transporteurs de zinc, car ils extrudent le zinc du cytosol à travers la membrane plasmique ou dans les organites intracellulaires 4,5,6,7,8,9. En raison de l’importance du zinc pour le métabolisme cellulaire, il est essentiel de comprendre la dynamique cellulaire du zinc.

Les méthodes précédentes d’évaluation de la dynamique du zinc reposaient sur l’évaluation des niveaux d’expression de l’ARNm dans différentes conditions de zinc en les corrélant avec les mesures cellulaires du zinc de tissus ou de cellules fixes^10,11,12. Ces méthodes comprennent la détection chimique et la coloration immunohistochimique. Cependant, ces méthodes ne donnent que des mesures indirectes et, par conséquent, ne déterminent qu’une corrélation hors ligne entre la concentration intracellulaire de zinc et l’expression des transporteurs de zinc. Par conséquent, ces méthodes ne peuvent pas déduire de paramètres nécessitant une résolution temporelle élevée.

Une mesure plus directe du transport du Zn²⁺ utilise des isotopes radioactifs du zinc¹³. Cette méthode s’appuie sur la mesure du Zn²⁺ radiomarqué pour suivre le transport du zinc et sa cinétique. Cependant, en raison de l’importance du zinc pour l’homéostasie cellulaire, de multiples processus cellulaires régulent la concentration intracellulaire de zinc. Parmi ceux-ci figurent la liaison extracellulaire et plusieurs systèmes de transport qui fonctionnent de concert pour maintenir un contrôle étroit des niveaux intracellulaires de Zn²⁺ . La combinaison de ces processus crée un bruit de fond considérable, ce qui rend difficile le test des différentes fonctions de transport liées au zinc.

Cet article présente une méthode permettant de surveiller directement la vitesse de transport du zinc en mesurant la concentration intracellulaire de zinc libre à l’aide d’un colorant fluorescent spécifique au zinc, le FluoZin-3. Le colorant a une spécificité élevée pour le Zn²⁺ et peu d’interférences avec d’autres cations divalents, tels que le calcium. De plus, sous sa forme d’ester, il pénètre dans les cellules par diffusion non ionique et est ensuite piégé en raison de l’activité de la di-estérase intracellulaire. Ainsi, sa fluorescence est principalement corrélée à la concentration de zinc cytosolique libre. Ces expériences ont été menées pour étudier la relation structure-fonction du transporteur de zinc 1 (ZnT1), un membre de la famille ZnT.

Protocole

1. Transfection cellulaire

1. Cultiver des cellules HEK293T dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine et 1x pénicilline/streptomycine (voir le tableau des matériaux) dans un incubateur humidifié à 37 °C/5 % de CO₂ jusqu’à la confluence sur une plaque de 10 cm (8,8 x 10⁶ cellules au total).
2. Placez une lamelle de 13 mm dans chacun des puits d’une plaque à 12 puits. Diluer 0,44 x 10⁶ cellules trypsinisées de l’étape 1.1 dans 12 mL de DMEM complet. Bien mélanger en pipetant de haut en bas trois à cinq fois. Remplir chaque puits avec 1 mL de la solution mélangée. Cultivez dans un incubateur humidifié à 37 °C/5 % de CO₂ pendant la nuit.
3. Remplacer le DMEM complet dans chaque puits par 1 mL de DMEM sans sérum (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits. Remettez la plaque à 12 puits dans l’incubateur humidifié comme à l’étape 1.1.
4. Pour chaque puits de transfection, diluer 1 μg de plasmide pAAV2 contenant la protéine d’intérêt marquée avec la protéine fluorescente mCherry (Fichier supplémentaire 1) dans 100 μL de DMEM sans sérum dans un tube de 1,5 mL.
5. Ajouter 3 μg de polyéthylèneimine (PEI, voir le tableau des matériaux) à 100 μL de DMEM sans sérum par transfection, chaque transfection étant effectuée dans un tube différent de 1,5 mL. Le rapport plasmide/PEI doit être de 1 :3 (μg :μg).
6. Faire tourner les deux tubes de l’étape 1.4 et de l’étape 1.5 pendant 10 s et laisser reposer à température ambiante pendant au moins 5 min.
7. Mélanger une partie (100 μL par puits) de la solution d’ADN de l’étape 1.4 avec une partie (100 μL par puits) de la solution PEI de l’étape 1.5. Faire tourner la solution finale pendant 10 s et laisser reposer à température ambiante pendant au moins 20 min et jusqu’à 6 h.
8. Prenez la plaque à 12 puits de l’incubateur. Vortex la solution finale de l’étape 1.7 et ajouter 200 μL à chacun des puits de la plaque à 12 puits de l’étape 1.3. Remettez la plaque à 12 puits dans l’incubateur humidifié (étape 1.1).
9. Après 3 h, remplacer le milieu dans chaque puits par 1 mL de DMEM complet. Remettez la plaque à 12 puits dans l’incubateur humidifié comme à l’étape 1.1.
10. Après 2 jours, prélevez la culture cellulaire transfectée de l’incubateur à 37 °C/5 % de CO₂ et placez-la sur un microscope à fluorescence inversée en utilisant un grossissement de 10x.
11. À l’aide de la molette de mise au point du microscope, faites la mise au point sur les cellules tout en utilisant la lumière à fond clair.
12. Passez aux longueurs d’onde fluorescentes d’excitation mCherry (587 nm) et d’émission (610 nm) et éteignez la lumière à fond clair. Vérifiez la fluorescence des cellules pour confirmer l’expression de ZnT1 mCherry.
13. Préparez la solution de charge du colorant.
    1. Prélever une aliquote de 4 μL de colorant fluorescent spécifique du zinc (voir Tableau des matériaux) sous forme d’ester d’acétoxyméthyle (AM), dissous dans du DMSO (1 μg/μL), provenant d’un stock à l’abri de la lumière stocké dans un congélateur à −20 °C. Cette forme permet au colorant de pénétrer dans la cellule à travers la membrane plasmique par simple diffusion.
    2. Ajouter 4 μL d’acide pluronique à 10 % (ou 2 μL d’acide pluronique à 20 %, voir le tableau des matériaux) à l’aliquote de l’étape 1.13.1. Mélangez bien la solution en pipetant trois fois de haut en bas, puis ajoutez les 8 μL dans un tube de 1,5 mL.
    3. Ajouter 750 μL de solution de Ringer (préparée à l’interne, voir le tableau des matériaux pour la composition) complétée par 1 mg/mL (~0,1 %) d’albumine sérique bovine dans le tube à partir de l’étape 1.13.2, et tourbillonner vigoureusement. Ajouter 750 μL supplémentaires de la même solution, puis tourbillonner à nouveau pour assurer un mélange maximal.
14. Ajouter 750 μL de la solution finale de l’étape 1.13.3 à deux puits dans une nouvelle plaque de culture à 6 puits. Couvrir de papier d’aluminium.
    REMARQUE : Pour éviter le blanchiment, la plaque à 6 puits est toujours recouverte de papier d’aluminium à partir de cette étape.
15. À l’aide d’une pince à épiler fine, prélevez jusqu’à quatre lamelles de répétition de la plaque de culture cellulaire transfectée et placez-les dans le premier puits rempli (jusqu’à quatre lames par puits) de la nouvelle plaque à 6 puits de l’étape 1.14. Répétez ce processus pour le deuxième puits rempli.
    REMARQUE : Toutes les lamelles dans le même puits rempli doivent être du même état. Cependant, chaque puits peut contenir des conditions différentes.
16. Couvrir de papier d’aluminium et agiter doucement pendant 15 à 20 minutes.
17. Retirez la solution de charge de colorant et remplacez-la par une nouvelle solution de lavage de Ringer’s plus albumine, comme utilisé à l’étape 1.13.3. Couvrir de papier d’aluminium. Laisser agiter à nouveau pendant 20 min. Cela permet le clivage de l’ester AM par les estérases intracellulaires.

2. Préparation du microscope

1. Disposer les outils nécessaires (voir tableau des matériaux) comme mentionné : un microscope à fluorescence inversé capable de détecter les fluorophores GFP et mCherry, un système de perfusion qui permet de basculer entre au moins deux solutions, un système d’aspiration et une chambre de perfusion.
2. Allumez le microscope, sa source de lumière et l’appareil photo. Allumez le système d’aspiration.
3. Lavez le système de perfusion. Laver la première chambre avec la solution de Ringer et la deuxième chambre avec la solution de Ringer contenant une solution de zinc de 7 μM complétée par 7 μM de pyrithione (ionophore de zinc, voir le tableau des matériaux). Pour éviter les bulles d’air ou les interstices, laissez un peu de liquide dans chaque chambre.
   REMARQUE : Étant donné que les deux récipients sont connectés au même tube accroché à la chambre de perfusion, assurez-vous toujours que le segment partagé est lavé avec la solution de Ringer.
4. Fermez les robinets et remplissez les chambres appropriées avec la solution de Ringer et la solution de zinc de Ringer, comme à l’étape 2.3.

3. Préparation de l’échantillon

1. Prenez la chambre de perfusion et placez-la avec le côté étroit de la rainure vers le haut.
   REMARQUE : La rainure est un trou au milieu de la chambre de perfusion. Il permet au liquide de perfusion d’accéder aux cellules. Un côté de la rainure est étroit et le côté opposé est large.
2. Appliquez un silicone d’étanchéité (voir tableau des matériaux) autour de la rainure. Nettoyez le silicone d’étanchéité de la rainure à l’aide d’une pointe de pipette.
   REMARQUE : Assurez-vous qu’il y a suffisamment de joint en silicone autour de la rainure pour sceller une lamelle de 22 mm.
3. À l’aide d’une pince à épiler fine, prenez une lamelle de la solution de lavage et placez-la sur le dessus de la rainure avec les cellules vers le bas. De cette façon, les cellules seront exposées à la solution perfusant le sillon pendant l’expérience.
4. Placez une lamelle de 22 mm sur la lamelle de 13 mm et serrez-la à l’aide de la pince à épiler. Veillez à ne pas fissurer les lamelles.
5. Retournez la chambre et appuyez dessus pour libérer tous les liquides présents. Remplissez la rainure avec 100 μL de solution de lavage Ringer et appuyez à nouveau pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuite.
   REMARQUE : Si une fuite est détectée, appliquez un agent d’étanchéité sur le site de la fuite et refaites le test.
6. Montez la chambre de perfusion sur la plate-forme et fixez-la. Placez les tubes de perfusion et d’aspiration pour permettre la perfusion sur les cellules dans le sillon.
7. Modifiez le débit de perfusion à environ 2 mL/min et activez la perfusion de la solution de Ringer. Assurez-vous que le système de perfusion fonctionne sans fuite ni débordement.

4. Préparation de la mesure

1. Ouvrez le logiciel d’imagerie (voir Table des matériaux) en double-cliquant sur l’icône. Connectez-vous avec les informations d’identification appropriées. Choisissez la caméra connectée, puis appuyez sur OK.
2. Réglez le grossissement du microscope sur 10x à l’aide du bouton situé sur le côté gauche du microscope.
3. En choisissant l’affichage en direct et en utilisant le joystick, déplacez la plate-forme pour vous concentrer sur les cellules du sillon.
4. Pendant que la perfusion est allumée, éteignez les lumières et changez la longueur d’onde en mCherry en appuyant sur le bouton dédié dans l’interface. Ajustez la mise au point à l’aide de la molette de mise au point du microscope.
5. Une fois que le microscope est focalisé sur les cellules, déplacez la plate-forme à l’aide du joystick pour permettre la sélection des patchs cellulaires appropriés.
   REMARQUE : Une zone appropriée est considérée comme une zone avec au moins 10 cellules pour un ROI et une zone vide pour l’arrière-plan.
6. Sélectionnez le menu déroulant Activer/désactiver les ROI , puis choisissez Dessiner des ROI circulaires.
7. Dessinez les ROI des groupes de cellules avec les cellules exprimant mCherry (indique l’expression de ZnT1).
8. Dans la même barre d’outils qu’à l’étape 4.6, cliquez sur le bouton Activer/désactiver les ROI en arrière-plan et ajustez l’emplacement et la taille du retour sur investissement en arrière-plan sur une zone sans aucune cellule.
   1. Vérifiez avec les longueurs d’onde mCherry et EGFP pour vous assurer qu’aucune cellule n’est dans le retour sur investissement d’arrière-plan sélectionné.
      REMARQUE : Les longueurs d’onde ont été ajustées de manière à ce que mCherry utilise une longueur d’onde d’excitation de 520 nm et une longueur d’onde d’émission de 610 nm et que l’EGFP utilise une longueur d’onde d’excitation de 470 nm et une longueur d’onde d’émission de 520 nm.
9. Sélectionnez le sous-onglet Longueur d’onde (λ). Cochez sa case et assurez-vous que la longueur d’onde GFP est présente et que sa case est cochée. Si ce n’est pas le cas, ajoutez-le et marquez-le.
10. Sélectionnez le sous-onglet Durée . Définissez l’intervalle de mesure toutes les 5 s et modifiez le nombre d’intervalles en fonction de la durée de l’expérience.
11. Dans la section Mise au point du panneau du microscope sous l’oculaire, cliquez sur le bouton Activé pour activer le système de mise au point parfaite (PFS).
12. À l’aide de la molette de mise au point PFS, réglez la mise au point. Dans l’interface du logiciel, sous ND Acquisition, assurez-vous que PFS on est coché.
13. Cliquez sur Exécuter maintenant.

5. Procédure expérimentale

1. Commencez par une mesure de la période de référence de 90 s à l’aide de la perfusion de solution de Ringer.
2. Une fois la période de référence terminée, éteignez la perfusion de la solution de Ringer, puis activez la perfusion de la solution de zinc de Ringer. Marquez le changement de solution en cliquant sur le drapeau rouge en bas à droite du panneau d’interface principal. On s’attend à ce qu’une augmentation de la fluorescence apparaisse.
3. Une fois que l’élévation de fluorescence commence à saturer, revenez à la perfusion avec la solution de Ringer. Désactivez la perfusion de la solution de zinc du Ringer, puis activez la perfusion de la solution du Ringer.
4. Patientez jusqu’à l’expiration du délai d’expérimentation. Une diminution notable mais constante de la fluorescence est attendue si le ZnT1 fonctionne correctement.

6. Exportation des données

1. Pour exporter les données avec soustraction de la ligne de base, appuyez sur le bouton Soustraire la ligne de base et affichez les modifications dans la « fenêtre d’acquisition ND ».
2. Cliquez sur le bouton Exporter dans l’interface du logiciel dans la « fenêtre d’acquisition ND ». Une fiche technique Excel s’ouvre. Enregistrez à l’emplacement souhaité.

7. Analyse des données

1. Pour chaque retour sur investissement, créez une fluorescence de base moyenne à partir des 90 à 100 premières secondes.
2. Exprimez la fluorescence calculée pour chaque retour sur investissement sous forme de pourcentage de l’arrière-plan pour ce retour sur investissement.
3. Créez une moyenne linéaire de tous les ROI et tracez le résultat sous la forme d’un graphique linéaire. Cela crée une moyenne de tous les retours sur investissement en fonction du temps.
4. À l’aide de la fonction d’ajustement linéaire, sélectionnez le taux initial de diminution de la fluorescence après le lavage avec la solution de Ringer. La valeur de pente de l’équation est corrélée avec le taux de transport.

Résultats

ZnT1 est un transporteur de zinc de mammifère situé sur la membrane plasmique cellulaire¹³. C’est un membre de la famille des protéines facilitatrices de diffusion cationique (CDF) qui extrudent le zinc du cytosol vers le millieu¹⁴ extracellulaire. ZnT1 a une architecture à deux domaines : le domaine transmembranaire, qui transporte les ions à travers la membrane, et un domaine C-terminal¹⁴. Contrairement à d’autres protéines CDF connues, ...

Discussion

La méthode décrite ci-dessus permet de mesurer directement la concentration intracellulaire de zinc avec une haute résolution temporelle. Comparée à d’autres méthodes, cette méthode impliquant la surveillance des changements dans le Zn²⁺ intracellulaire peut réduire considérablement le bruit de fond. De plus, la sélectivité du colorant pour le zinc élimine les interactions croisées potentielles avec d’autres cations métalliques^18,19. ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm plate	greiner bio-one	664160
12-well cell culture plate	greiner bio-one	665180
13 mm coverslips	Superior Marienfeld	111530
22 mm cover slides	Superior Marienfeld	101050
6-well culture plate	greiner bio-one	657160
Bovine serum albumin	bioWorld	22070008
Calcium chloride anhydrous, granular	Sigma Aldrich	C1016	Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose	Glentham Life Science	GC6947	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope	Nikon	TI-DH	Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30088.03
Fine tweezers	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution	Cytiva	SV30010
LED illumination system	CoolLED	pE-4000
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	1.05833	Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software	Nikon	AR
Pluronic acid F-127	Millipore	540025
Pottasium chloride	Bio-Lab	163823	Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione	Sigma Aldrich	H3261	Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit	Warner Instruments	W4 64-0378
Sodium chloride	Bio-Lab	190305	Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate			Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
	Sigma Aldrich	31665