In Vitro亜鉛輸送アッセイを用いた哺乳類亜鉛トランスポーターの特性評価(英語)

要約

亜鉛輸送は、タンパク質機能との因果関係が弱く、時間分解能が低いため、測定が困難であることが証明されています。従ってこのプロトコルは高い時間分解能と、Zn 2+敏感な蛍光染料の利用によって生きているセルからのZn 2+の放出を、監視するための方法を記述し、Zn²⁺の流出の直接測定を提供する。

要約

^Zn2+イオンなどの遷移金属は、細胞毒性があるため、厳密に制御する必要があります。以前は、Zn2+トランスポーターの活性は、異なる濃度の^Zn2+下でのトランスポーターの発現レベルを決定することによって間接的に測定されていました。これは、免疫組織化学を利用したり、組織内のmRNAを測定したり、細胞の^Zn2+レベルを決定したりすることによって行われました。細胞内^Zn2+センサーの開発により、亜鉛トランスポーターの活性は、現在、主に蛍光プローブを使用して検出される細胞内Zn2+の変化と^Zn2+トランスポーターの発現を相関させることによって決定されています。しかし、今日でも、細胞内のZn²⁺の動的変化をモニターし、それを使用して亜鉛トランスポーターの活性を直接測定しているラボはごくわずかです。問題の一部は、ZnTファミリーの10個の亜鉛トランスポーターのうち、ZnT10(マンガンを輸送する)を除いて、亜鉛トランスポーター1(ZnT1)のみが原形質膜に局在していることである。したがって、輸送活性を細胞内の^Zn2+濃度の変化に結びつけることは困難です。本稿では、亜鉛特異的蛍光色素であるFluoZin-3に基づくアッセイを用いて、亜鉛輸送速度を直接測定する方法について解説します。この色素は、エステルの形で哺乳類細胞にロードされ、細胞のジエステラーゼ活性によりサイトゾルに閉じ込められます。細胞は、Zn²+イオノフォアピリチオンを利用してZn²⁺をロードします。ZnT1活性は、細胞ウォッシュアウト後の蛍光の減少の直線部分から評価されます。470 nmの励起と520 nmの発光で測定された蛍光は、遊離細胞内Zn²⁺に比例します。mCherry蛍光色素でタグ付けされたZnT1を発現する細胞を選択することで、トランスポーターを発現する細胞のみをモニタリングすることができます。このアッセイは、細胞から過剰な亜鉛を押し出す真核生物の膜貫通タンパク質であるヒトZnT1の輸送メカニズムに対するZnT1タンパク質のさまざまなドメインの寄与を調査するために使用されます。

概要

亜鉛は、細胞環境において不可欠な微量元素です。全タンパク質の3分の1を包含し、触媒作用¹、転写²、構造モチーフ³など、さまざまな細胞プロセスに関与しています。しかし、酸化還元不活性であるにもかかわらず、高濃度の亜鉛は細胞に有毒であるため、亜鉛の恒常性を調節するメカニズムの存在なしには哺乳類は生き残れませんでした。哺乳類では、3つのメカニズムがこのプロセスに関与しています:(1)メタロチオネインは、細胞質システインに富むタンパク質であり、亜鉛に高い親和性で結合し、過剰な遊離細胞質亜鉛を防ぎ^ます4;(2)Zrt / Irt様タンパク質(ZIP)は、原形質膜を介して、または細胞内オルガネラ4,5,6,7,8から細胞質への亜鉛流入に関与する亜鉛トランスポーターです。(3)ZnTは、ユビキタス陽イオン拡散促進剤(CDF)ファミリーの哺乳類サブセットであり、細胞質膜を横切って細胞質膜または細胞内オルガネラ4,5,6,7,8,9に亜鉛を押し出すため、亜鉛輸送体です。細胞の代謝には亜鉛が重要であるため、細胞の亜鉛動態を理解することは不可欠です。

亜鉛動態を評価する以前の方法は、固定組織または細胞の細胞亜鉛測定値と相関させることにより、異なる亜鉛条件下でのmRNAの発現レベルを評価することに依存していました10,11,12。これらの方法には、化学的検出および免疫組織化学染色が含まれます。しかし、これらの方法では間接的な測定しか得られないため、細胞内亜鉛濃度と亜鉛トランスポーターの発現との間のオフラインの相関関係しか決定できません。したがって、これらの方法では、高い時間分解能を必要とするパラメーターを推測することはできません。

Zn²⁺ 輸送のより直接的な測定には、亜鉛¹³の放射性同位体を使用します。この方法は、放射性標識されたZn²⁺ の測定に依存して、亜鉛輸送とその速度論をモニターします。しかし、亜鉛は細胞の恒常性にとって重要であるため、複数の細胞プロセスが細胞内の亜鉛濃度を調節しています。これらの中には、細胞外結合と、細胞内の^Zn2+ レベルの厳密な制御を維持するために協調して機能するいくつかの輸送システムがあります。これらのプロセスが組み合わさると、かなりのバックグラウンドノイズが発生し、個々の亜鉛関連の輸送機能をテストすることが困難になります。

本稿では、亜鉛特異的蛍光色素であるFluoZin-3を用いて細胞内の遊離亜鉛濃度を測定することにより、亜鉛輸送速度を直接モニターする方法を紹介します。この色素は、Zn²⁺ に対する特異性が高く、カルシウムなどの他の二価陽イオンからの干渉がほとんどありません。さらに、そのエステル形態では、非イオン性拡散によって細胞内に侵入し、細胞内ジエステラーゼの活性により捕捉されます。したがって、その蛍光は主に遊離細胞質亜鉛濃度と相関しています。これらの実験は、ZnTファミリーの一員である亜鉛トランスポーター1(ZnT1)の構造と機能の関係を調べるために行われました。

プロトコル

1. 細胞トランスフェクション

1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、および1xペニシリン/ストレプトマイシン( 材料表を参照)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で細胞を、加湿インキュベーターで37°C/5%CO₂ で10cmプレート(8.8 x 10⁶ 細胞)に合流するまでHEK293T培養します。
2. 12ウェルプレートの各ウェルに13 mmのカバーガラスを1枚ずつ置きます。ステップ 1.1 の 0.44 x 10⁶ 個のトリプシン処理細胞を 12 mL の完全 DMEM で希釈します。ピペッティングで3〜5回上下させてよく混ぜます。各ウェルに1 mLの混合溶液を充填します。加湿したインキュベーターで37°C/5%_CO2 で一晩培養します。
3. 各ウェルの完全 DMEM を、各ウェルの 1 mL の無血清 DMEM( 材料表を参照)と交換します。ステップ1.1と同様に、12ウェルプレートを加湿したインキュベーターに戻します。
4. 各トランスフェクションウェルについて、mCherry蛍光タンパク質(補足ファイル1)でタグ付けされた目的タンパク質を含むpAAV2プラスミド1 μgを、1.5 mLチューブ内の無血清DMEM100 μLで希釈します。
5. トランスフェクションごとに3 μgのポリエチレンイミン(PEI、 材料表を参照)を100 μLの無血清DMEMに添加し、トランスフェクションごとに異なる1.5 mLチューブに入れます。プラスミド:PEI 比は 1:3(μg:μg)である必要があります。
6. ステップ1.4とステップ1.5の両方のチューブを10秒間ボルテックスし、室温で少なくとも5分間休ませます。
7. ステップ 1.4 の DNA 溶液 1 部(ウェルあたり 100 μL)と、ステップ 1.5 の PEI 溶液 1 部(ウェルあたり 100 μL)を混合します。最終溶液を10秒間ボルテックスし、室温で少なくとも20分間、最大6時間休置します。
8. インキュベーターから12ウェルプレートを取り出します。ステップ 1.7 の最終溶液をボルテックスし、ステップ 1.3 の 12 ウェルプレートの各ウェルに 200 μL を添加します。12ウェルプレートを加湿したインキュベーターに戻します(ステップ1.1)。
9. 3時間後、各ウェルの培地を1 mLの完全DMEMと交換します。ステップ1.1と同様に、12ウェルプレートを加湿したインキュベーターに戻します。
10. 2日後、37°C/5%_CO2 インキュベーターからトランスフェクションした細胞培養液を取り出し、倍率10倍の倒立蛍光顕微鏡に置きます。
11. 顕微鏡のフォーカスホイールを使用して、明視野光を使用しながら細胞に焦点を合わせます。
12. 蛍光mCherry励起波長(587 nm)と発光波長(610 nm)に切り替え、明視野光をオフにします。細胞の蛍光をチェックして、ZnT1 mCherryの発現を確認します。
13. 染料ローディング溶液を調製します。
    1. -20°Cの冷凍庫に保管された遮光ストックから、DMSOに溶解したアセトキシメチル(AM)エステル形態の亜鉛特異的蛍光色素4 μL( 材料表を参照)を採取します(1 μg/μL)。この形態により、色素は単純な拡散によって原形質膜を通って細胞に入ることができます。
    2. ステップ 1.13.1 のアリコートに 4 μL の 10% プルロン酸 (または 20% プルロン酸 2 μL、 材料表を参照) を加えます。ピペッティングで上下に3回回繰り返して溶液をよく混合し、8 μLすべてを1.5 mLチューブに加えます。
    3. 1 mg/mL(~0.1%)のウシ血清アルブミンを添加したリンゲル溶液750 μL(社内調製、組成については 材料表 を参照)をステップ1.13.2のチューブに加え、激しくボルテックスします。同じ溶液をさらに750 μL添加し、再びボルテックスして最大混合を確保します。
14. ステップ 1.13.3 の最終溶液 750 μL を、新しい 6 ウェル培養プレートの 2 つのウェルに加えます。アルミホイルで覆います。
    注:漂白を避けるために、6ウェルプレートは、このステップから常にアルミホイルで覆われています。
15. 細かいピンセットを使用して、トランスフェクションした細胞培養プレートから最大4枚の複製カバーガラスを取り出し、ステップ1.14の新しい6ウェルプレートの最初の充填ウェル(ウェルあたり最大4枚のスライド)に入れます。このプロセスを 2 番目の充填ウェルに対して繰り返します。
    注意: 同じ充填ウェル内のすべてのカバーガラスは、同じ状態のものでなければなりません。ただし、各ウェルには異なる条件を含めることができます。
16. アルミホイルで覆い、15〜20分間静かに振ってください。
17. 染料ローディング溶液を取り除き、ステップ1.13.3で使用したリンガープラスアルブミンの新しい洗浄溶液と交換します。アルミホイルで覆います。もう一度20分間振っておきます。これにより、細胞内エステラーゼによるAMエステルの切断が可能になります。

2. 顕微鏡の準備

1. GFPおよびmCherry蛍光色素を検出できる倒立蛍光顕微鏡、少なくとも2つの溶液を切り替えることができる灌流システム、吸引システム、および灌流チャンバーなど、必要なツール( 材料表を参照)を配置します。
2. 顕微鏡、その光源、およびカメラの電源を入れます。吸引システムをオンにします。
3. 灌流システムを洗浄します。第1チャンバーをリンゲル溶液で洗浄し、第2チャンバーを7 μMのピリチオン(亜鉛イオノフォア、 材料表を参照)を添加した7 μM亜鉛溶液を含むリンゲル溶液で洗浄します。気泡や隙間を避けるために、各チャンバーに液体を残してください。
   注意: 両方の容器は灌流チャンバーに引っ掛けられた同じチューブに接続されているため、共有セグメントがリンガーの溶液で洗浄されていることを常に確認してください。
4. 蛇口を閉じ、ステップ2.3と同様に、適切なチャンバーにリンゲル溶液とリンゲル亜鉛溶液を入れます。

3. サンプル調製

1. 灌流チャンバーを取り、溝の狭い側を上に向けて置きます。
   注:溝は灌流チャンバーの中央にある穴です。これにより、灌流液が細胞にアクセスできるようになります。溝の片側は狭く、反対側は広いです。
2. 溝の周りにシーリングシリコン( 材料表を参照)を塗布します。ピペットチップを使用して、溝からシーリングシリコンを取り除きます。
   注意: 22mmのカバーガラスをシールするのに十分なシリコンシールが溝の周りにあることを確認してください。
3. 細かいピンセットを使用して、洗浄液からカバーガラスを取り出し、セルを下に向けて溝の上に置きます。このようにして、細胞は実験中に溝を浸透させる溶液にさらされます。
4. 13mmのカバーガラスの上に22mmのカバーガラスを置き、ピンセットで締めます。カバーガラスにひびが入らないように注意してください。
5. チャンバーをひっくり返し、それを押して現在のすべての液体を放出します。溝にリンガーの洗浄液100μLを入れ、漏れないようにもう一度押します。
   注意: 漏れが検出された場合は、漏れのある場所にシーリング剤を塗布し、再テストしてください。
6. 灌流チャンバーをプラットフォームに取り付け、固定します。灌流チューブと吸引チューブを配置して、溝内の細胞に灌流できるようにします。
7. 灌流速度を約 2 mL/分に変更し、リンガー溶液の灌流をオンにします。灌流システムが漏れや波及効果なく機能していることを確認してください。

4. 測定準備

1. アイコンをダブルクリックして、イメージングソフトウェア( 材料表を参照)を開きます。関連する資格情報でログインします。接続されているカメラを選択し、[ OK]を押します。
2. 顕微鏡の左側にあるボタンを使用して、顕微鏡の倍率を10倍に設定します。
3. ライブビューを選択し、ジョイスティックを使用して、プラットフォームを動かして溝のセルに焦点を合わせます。
4. 灌流がオンの状態で、ライトを消し、インターフェースの専用ボタンを押して波長をmCherryに変更します。顕微鏡のフォーカスホイールを使用してピントを調整します。
5. 顕微鏡が細胞に焦点を合わせたら、ジョイスティックを使用してプラットフォームを動かし、適切な細胞パッチを選択できるようにします。
   注: 適切な領域は、ROI 用に少なくとも 10 個のセルがあり、背景用に空の領域がある領域と見なされます。
6. [ROI のオン/オフの切り替え] ドロップダウン メニューを選択し、[円形 ROI の描画] を選択します。
7. mCherry発現細胞(ZnT1の発現を示す)で細胞クラスターのROIを描きます。
8. 手順 4.6 と同じツールバーで、[ 背景 ROI のオン/オフの切り替え ] ボタンをクリックし、背景 ROI の位置とサイズをセルがまったくない領域に調整します。
   1. mCherry 波長と EGFP 波長で、選択したバックグラウンド ROI に細胞がないことを確認します。
      注:波長は、mCherryが励起波長520nm、発光波長610nm、EGFPが励起波長470nm、発光波長520nmを使用するように調整しました。
9. Wavelength (λ)サブタブを選択します。チェックボックスにチェックを入れ、GFP波長が存在し、チェックボックスにチェックが入っていることを確認します。そうでない場合は、追加してマークします。
10. 「 期間 」サブタブを選択します。測定間隔を 5 秒ごと定義し、実験期間に合わせて間隔の数を変更します。
11. 接眼レンズの下にある顕微鏡パネルの フォーカス セクションで、 オン ボタンをクリックしてパーフェクトフォーカスシステム(PFS)を有効にします。
12. PFSフォーカスホイールを使用して、フォーカスを調整します。ソフトウェア インターフェイスの [ND Acquisition] で、[ PFS on ] にチェックが入っていることを確認します。
13. [ 今すぐ実行]をクリックします。

5. 実験手順

1. リンガーの溶液灌流を使用した90秒のベースライン周期測定から始めます。
2. ベースライン期間が終了したら、リンガーの溶液灌流をオフにしてから、リンガーの亜鉛溶液灌流をオンにします。.メインインターフェイスパネルの右下にある赤いフラグをクリックして、ソリューションの切り替えをマークします。蛍光の上昇が予想されます。
3. 蛍光の上昇が飽和し始めたら、リンゲル溶液による灌流に戻します。リンガーの亜鉛溶液灌流をオフにしてから、リンガーの溶液灌流をオンにします。
4. 実験時間が終了するまで待ちます。ZnT1が正常に機能していれば、蛍光の顕著かつ着実な減少が予想されます。

6. データのエクスポート

1. ベースライン減算でデータをエクスポートするには、[ 基線の減算 ]ボタンを押して、[ND取得ウィンドウ]で変更を確認します。
2. 「ND取得ウィンドウ」のソフトウェアインターフェースにある [エクスポート ]ボタンをクリックします。Excel データシートが開きます。目的の場所に保存します。

7. データ分析

1. 各ROIについて、最初の90〜100秒からの平均ベースライン蛍光を作成します。
2. 各ROIについて計算された蛍光を、そのROIのバックグラウンドのパーセンテージとして表します。
3. すべての ROI の行平均を作成し、結果を折れ線グラフとしてプロットします。これにより、時間の関数としてすべてのROIの平均が作成されます。
4. 線形フィット関数を使用して、リンガー溶液による洗浄後の蛍光の減少の初期速度を選択します。方程式の傾き値は、輸送速度と相関しています。

結果

ZnT1は、細胞原形質膜¹³上に位置する哺乳類の亜鉛トランスポーターである。これは、細胞質から細胞外ミ^リュー14に亜鉛を押し出す陽イオン拡散促進剤(CDF)タンパク質ファミリーのメンバーです。ZnT1は、イオンを膜を横切って輸送する膜貫通ドメインと、C末端ドメイン¹⁴の2つのドメイン構造を有する。他の既知のCDFタンパク質とは異なり?...

ディスカッション

上述した方法により、高い時間分解能で細胞内亜鉛濃度を直接測定することができます。他の方法と比較して、細胞内^Zn2+の変化をモニタリングするこの方法は、バックグラウンドノイズを大幅に低減することができます。さらに、亜鉛に対する色素の選択性は、他の金属陽イオンとの潜在的な相互相互作用を排除します^18,19。最後に、即時...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm plate	greiner bio-one	664160
12-well cell culture plate	greiner bio-one	665180
13 mm coverslips	Superior Marienfeld	111530
22 mm cover slides	Superior Marienfeld	101050
6-well culture plate	greiner bio-one	657160
Bovine serum albumin	bioWorld	22070008
Calcium chloride anhydrous, granular	Sigma Aldrich	C1016	Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose	Glentham Life Science	GC6947	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope	Nikon	TI-DH	Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30088.03
Fine tweezers	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution	Cytiva	SV30010
LED illumination system	CoolLED	pE-4000
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	1.05833	Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software	Nikon	AR
Pluronic acid F-127	Millipore	540025
Pottasium chloride	Bio-Lab	163823	Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione	Sigma Aldrich	H3261	Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit	Warner Instruments	W4 64-0378
Sodium chloride	Bio-Lab	190305	Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate			Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
	Sigma Aldrich	31665