In Vitro亜鉛輸送アッセイを用いた哺乳類亜鉛トランスポーターの特性評価(英語)

要約

亜鉛輸送は、タンパク質機能との因果関係が弱く、時間分解能が低いため、測定が困難であることが証明されています。従ってこのプロトコルは高い時間分解能と、Zn 2+敏感な蛍光染料の利用によって生きているセルからのZn 2+の放出を、監視するための方法を記述し、Zn²⁺の流出の直接測定を提供する。

要約

^Zn2+イオンなどの遷移金属は、細胞毒性があるため、厳密に制御する必要があります。以前は、Zn2+トランスポーターの活性は、異なる濃度の^Zn2+下でのトランスポーターの発現レベルを決定することによって間接的に測定されていました。これは、免疫組織化学を利用したり、組織内のmRNAを測定したり、細胞の^Zn2+レベルを決定したりすることによって行われました。細胞内^Zn2+センサーの開発により、亜鉛トランスポーターの活性は、現在、主に蛍光プローブを使用して検出される細胞内Zn2+の変化と^Zn2+トランスポーターの発現を相関させることによって決定されています。しかし、今日でも、細胞内のZn²⁺の動的変化をモニターし、それを使用して亜鉛トランスポーターの活性を直接測定しているラボはごくわずかです。問題の一部は、ZnTファミリーの10個の亜鉛トランスポーターのうち、ZnT10(マンガンを輸送する)を除いて、亜鉛トランスポーター1(ZnT1)のみが原形質膜に局在していることである。したがって、輸送活性を細胞内の^Zn2+濃度の変化に結びつけることは困難です。本稿では、亜鉛特異的蛍光色素であるFluoZin-3に基づくアッセイを用いて、亜鉛輸送速度を直接測定する方法について解説します。この色素は、エステルの形で哺乳類細胞にロードされ、細胞のジエステラーゼ活性によりサイトゾルに閉じ込められます。細胞は、Zn²+イオノフォアピリチオンを利用してZn²⁺をロードします。ZnT1活性は、細胞ウォッシュアウト後の蛍光の減少の直線部分から評価されます。470 nmの励起と520 nmの発光で測定された蛍光は、遊離細胞内Zn²⁺に比例します。mCherry蛍光色素でタグ付けされたZnT1を発現する細胞を選択することで、トランスポーターを発現する細胞のみをモニタリングすることができます。このアッセイは、細胞から過剰な亜鉛を押し出す真核生物の膜貫通タンパク質であるヒトZnT1の輸送メカニズムに対するZnT1タンパク質のさまざまなドメインの寄与を調査するために使用されます。

概要

亜鉛は、細胞環境において不可欠な微量元素です。全タンパク質の3分の1を包含し、触媒作用¹、転写²、構造モチーフ³など、さまざまな細胞プロセスに関与しています。しかし、酸化還元不活性であるにもかかわらず、高濃度の亜鉛は細胞に有毒であるため、亜鉛の恒常性を調節するメカニズムの存在なしには哺乳類は生き残れませんでした。哺乳類では、3つのメカニズムがこのプロセスに関与しています:(1)メタロチオネインは、細胞質システインに富むタンパク質であり、亜鉛に高い親和性で結合し、過剰な遊離細胞質亜鉛を防ぎ^ます4;(2)Zrt / Irt様タンパク質(ZIP)は、原形質膜を介して、または細胞内オルガネラ4,5,6,7,8から細胞質への亜鉛流入に関与する亜鉛トランスポーターです。(3)ZnTは、ユビキタス陽イオン拡散促進剤(CDF)ファミリーの哺乳類サブセットであり、細胞質膜を横切って細胞質膜ま....

プロトコル

1. 細胞トランスフェクション

1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、および1xペニシリン/ストレプトマイシン( 材料表を参照)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で細胞を、加湿インキュベーターで37°C/5%CO₂ で10cmプレート(8.8 x 10⁶ 細胞)に合流するまでHEK293T培養します。
2. 12ウェルプレートの各ウェルに13 mmのカバーガラスを1枚ずつ置きます。ステップ 1.1 の 0.44 x 10⁶ 個のトリプシン処理細胞を 12 mL の完全 DMEM で希釈します。ピペッティングで3〜5回上下させてよく混ぜます。各ウェルに1 mLの混合溶液を充填します。加湿したインキュベーターで37°C/5%_CO2 で一晩培養します。
3. 各ウェルの完全 DMEM を、各ウェルの 1 mL の無血清 DMEM( 材料表を参照)と交換します。ステップ1.1と同様に、12ウェルプレートを加湿したインキュベーターに戻します。
4. 各トランスフェクションウェルについて、mCherry蛍光タンパク質(補足ファイル1)でタグ付けされた目的タンパク質を含むpAAV2プラスミド1 μgを、1.5 mLチューブ内の無血清....

ディスカッション

上述した方法により、高い時間分解能で細胞内亜鉛濃度を直接測定することができます。他の方法と比較して、細胞内^Zn2+の変化をモニタリングするこの方法は、バックグラウンドノイズを大幅に低減することができます。さらに、亜鉛に対する色素の選択性は、他の金属陽イオンとの潜在的な相互相互作用を排除します^18,19。最後に、即時.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm plate	greiner bio-one	664160
12-well cell culture plate	greiner bio-one	665180
13 mm coverslips	Superior Marienfeld	111530
22 mm cover slides	Superior Marienfeld	101050
6-well culture plate	greiner bio-one	657160
Bovine serum albumin	bioWorld	22070008
Calcium chloride anhydrous, granular	Sigma Aldrich	C1016	Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose	Glentham Life Science	GC6947	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope	Nikon	TI-DH	Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30088.03
Fine tweezers	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution	Cytiva	SV30010
LED illumination system	CoolLED	pE-4000
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	1.05833	Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software	Nikon	AR
Pluronic acid F-127	Millipore	540025
Pottasium chloride	Bio-Lab	163823	Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione	Sigma Aldrich	H3261	Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit	Warner Instruments	W4 64-0378
Sodium chloride	Bio-Lab	190305	Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate			Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
	Sigma Aldrich	31665