In Vitro Zinc Transport Assay를 사용한 포유류 아연 수송체 특성 분석

요약

아연 수송은 단백질 기능에 대한 인과 관계가 약하고 시간적 분해능이 낮기 때문에 측정하기 어려운 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 Zn 2+ 민감한 형광 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 높은 시간 분해능으로 Zn 2+ 압출을 모니터링하여 Zn²⁺ 유출을 직접 측정하는 방법을 설명합니다.

초록

Zn²⁺ 이온과 같은 전이 금속은 세포 독성으로 인해 엄격하게 조절되어야 합니다. 이전에는, Zn2+ 수송체의 활성은^Zn2+의 상이한 농도 하에서 수송체의 발현 수준을 결정함으로써 간접적으로 측정되었다. 이는 면역조직화학을 이용하거나, 조직 내 mRNA를 측정하거나, 세포 Zn²⁺ 수준을 측정하여 수행되었습니다. 세포 내 Zn 2+ 센서의 개발로 아연 수송체의 활성은 현재 형광 프로브를 사용하여 검출된 세포 내 Zn 2+의 변화와 Zn²⁺ 수송체의 발현을 연관시킴으로써 주로 결정됩니다. 그러나 오늘날에도 세포 내 Zn²⁺의 동적 변화를 모니터링하고 이를 사용하여 아연 수송체의 활성을 직접 측정하는 실험실은 소수에 불과합니다. 문제의 일부는 ZnT10(망간 수송)을 제외한 ZnT 계열의 10개 아연 수송체 중 아연 수송체 1(ZnT1)만 원형질막에 국한되어 있다는 것입니다. 따라서 수송 활성을 세포 내 Zn²⁺ 농도의 변화와 연결하는 것은 어렵습니다. 이 글에서는 아연 특이적 형광 염료인 FluoZin-3을 기반으로 하는 분석을 사용하여 아연 수송 역학을 측정하는 직접적인 방법을 설명합니다. 이 염료는 에스테르 형태로 포유류 세포에 로드된 다음 세포 디에스테라제 활성으로 인해 세포질에 갇히게 됩니다. 세포는 Zn 2+ ionophore pyrithione을 사용하여 Zn²⁺로 로드됩니다. ZnT1 활성은 세포 세척 후 형광 감소의 선형 부분에서 평가됩니다. 470nm의 여기와 520nm의 방출에서 측정된 형광은 유리 세포 내 Zn²⁺에 비례합니다. mCherry 형광단으로 태그된 ZnT1을 발현하는 세포를 선택하면 수송체를 발현하는 세포만 모니터링할 수 있습니다. 이 분석법은 세포에서 과잉 아연을 압출하는 진핵 세포막 관통 단백질인 인간 ZnT1의 수송 메커니즘에 대한 ZnT1 단백질의 다양한 영역의 기여도를 조사하는 데 사용됩니다.

서문

아연은 세포 환경에서 필수적인 미량 원소입니다. 그것은 모든 단백질의 1/3을 포함하며 촉매^{작용 1}, 전사² 및 구조 모티프³와 같은 다양한 세포 과정에 관여합니다. 그러나 산화 환원 불활성임에도 불구하고 높은 아연 농도는 세포에 독성이 있기 때문에 아연 항상성을 조절하는 메커니즘이 없으면 포유류 유기체가 생존하지 못했습니다. 포유류에서는 세 가지 메커니즘이 이 과정을 담당합니다: (1) 높은 친화력으로 아연과 결합하여 과도한 유리 세포질 아연을 방지하는 세포질 시스테인이 풍부한 단백질인 메탈로티오닌⁴; (2) Zrt/Irt 유사 단백질(ZIP)은 원형질막 또는 세포 내 소기관을 통해 세포질로 아연 유입을 담당하는 아연 수송체입니다 4,5,6,7,8; (3) ZnT는 유비쿼터스 양이온 확산 촉진제(CDF) 계열의 포유류 하위 집합이며 세포질에서 원형질막을 가로질러 또는 세포 내 소기관으로 아연을 압출할 때 아연 수송체입니다(4,5,6,7,8,9). 세포 대사에 대한 아연의 중요성으로 인해 세포 아연의 역학을 이해하는 것이 중요합니다.

아연 역학을 평가하는 이전 방법은 고정 조직 또는 세포의 세포 아연 측정과 상관 관계를 맺어 다양한 아연 조건에서 mRNA의 발현 수준을 평가하는 데 의존했습니다^10,11,12. 이러한 방법에는 화학적 검출 및 면역조직화학 염색이 포함됩니다. 그러나 이러한 방법은 간접적인 측정만 수행하므로 세포 내 아연 농도와 아연 수송체의 발현 사이의 오프라인 상관관계만 결정합니다. 따라서 이러한 방법은 높은 시간 분해능이 필요한 매개 변수를 유추할 수 없습니다.

Zn²⁺ 수송에 대한 보다 직접적인 측정은 아연¹³의 방사성 동위원소를 사용합니다. 이 방법은 아연 수송 및 그 반응 속도를 모니터링하기 위해 방사성 표지된 Zn²⁺ 의 측정에 의존합니다. 그러나 세포 항상성에 대한 아연의 중요성으로 인해 여러 세포 과정이 세포 내 아연 농도를 조절합니다. 이 중에는 세포 외 결합과 세포 내 Zn²⁺ 수준의 엄격한 제어를 유지하기 위해 함께 작동하는 여러 수송 시스템이 있습니다. 이러한 공정의 조합은 상당한 배경 소음을 발생시켜 개별 아연 관련 수송 기능을 테스트하기 어렵게 만듭니다.

이 기사에서는 아연 특이적 형광 염료인 FluoZin-3을 사용하여 세포 내 유리 아연 농도를 측정하여 아연 수송 속도를 직접 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 염료는 Zn²⁺ 에 대한 특이성이 높고 칼슘과 같은 다른 2가 양이온의 간섭이 거의 없습니다. 또한 에스테르 형태에서는 비이온성 확산에 의해 세포에 들어간 다음 세포 내 디에스테라아제의 활성으로 인해 갇히게 됩니다. 따라서 형광은 주로 유리 세포질 아연 농도와 관련이 있습니다. 이 실험은 ZnT 계열의 구성원인 아연 수송체 1(ZnT1)의 구조-기능 관계를 연구하기 위해 수행되었습니다.

프로토콜

1. 세포 transfection

1. 10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민 및 1x 페니실린/스트렙토마이신( 재료 표 참조)이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 세포를 37°C/5%_CO2 의 가습 인큐베이터에서 10cm 플레이트(8.8 x 10 총⁶ 개 세포)에 합류할 때까지 HEK293T배양합니다.
2. 13웰 플레이트의 각 웰에 12mm 커버슬립을 하나씩 놓습니다. 1.1단계의 0.44 x 10⁶ 트립신 세포를 12mL의 완전한 DMEM에 희석합니다. 피펫팅을 3-5회 위아래로 하여 잘 섞습니다. 각 웰에 1mL의 혼합 용액을 채웁니다. 37 °C / 5 % CO₂ 의 가습 인큐베이터에서 밤새 성장합니다.
3. 각 웰의 전체 DMEM을 각 웰의 1mL의 무혈청 DMEM( 재료 표 참조)으로 교체합니다. 12웰 플레이트를 1.1단계와 같이 가습 인큐베이터로 되돌립니다.
4. 각 transfection well에 대해 mCherry 형광 단백질(보충 파일 1)로 태그된 관심 단백질을 포함하는 pAAV2 플라스미드 1μg을 1.5mL 튜브에 있는 100μL의 무혈청 DMEM에 희석합니다.
5. transfection당 3μg의 폴리에틸렌이민(PEI, 재료 표 참조)을 100μL의 무혈청 DMEM에 추가하고, 각 transfection을 다른 1.5mL 튜브에 넣습니다. 플라스미드:PEI 비율은 1:3 (μg:μg)이어야 합니다.
6. 1.4단계와 1.5단계에서 두 튜브를 10초 동안 소용돌이치고 실온에서 최소 5분 동안 그대로 둡니다.
7. 1.4단계의 DNA 용액 1부(웰당 100μL)와 1.5단계의 PEI 용액 1부(웰당 100μL)를 혼합합니다. 최종 용액을 10초 동안 소용돌이치고 실온에서 최소 20분, 최대 6시간 동안 그대로 둡니다.
8. 인큐베이터에서 12웰 플레이트를 꺼냅니다. 1.7 단계의 최종 용액을 소용돌이 치고, 1.3 단계의 12 웰 플레이트의 각 웰에 200 μL를 추가합니다. 12웰 플레이트를 가습 인큐베이터로 되돌립니다(1.1단계).
9. 3시간 후 각 웰의 배지를 1mL의 완전한 DMEM으로 교체합니다. 12웰 플레이트를 1.1단계와 같이 가습 인큐베이터로 되돌립니다.
10. 2일 후 37°C/5%_CO2 인큐베이터에서 형질주입된 세포 배양을 10배 배율로 도립 형광 현미경에 놓습니다.
11. 현미경 초점 휠을 사용하여 명시야광을 사용하면서 세포에 초점을 맞춥니다.
12. 형광 mCherry 여기(587nm) 및 방출(610nm) 파장으로 전환하고 명시야광을 끕니다. ZnT1 mCherry의 발현을 확인하기 위해 세포의 형광을 확인합니다.
13. 염료 로딩 용액을 준비합니다.
    1. −20 °C 냉동고에 보관된 차광 스톡에서 DMSO(1 μg/μL)에 용해된 아세톡시메틸(AM) 에스테르 형태의 아연 특이적 형광 염료 4μL( 재료 표 참조)의 부분 표본을 채취합니다. 이 형태는 염료가 단순 확산을 통해 원형질막을 통해 세포로 들어갈 수 있도록 합니다.
    2. 4 μL의 10% 플루론산(또는 2μL의 20% 플루론산, 재료 표 참조)을 단계 1.13.1의 부분 표본에 추가합니다. 피펫팅을 위아래로 세 번 하여 용액을 잘 섞은 다음 8μL를 모두 1.5mL 튜브에 넣습니다.
    3. 1.13.2단계에서 1mg/mL(~0.1%)의 소 혈청 알부민이 보충된 750μL의 링거 용액(사내 준비, 조성은 재료 표 참조)을 튜브에 넣고 세게 소용돌이칩니다. 동일한 용액 750 μL를 더 추가하고 다시 와류하여 최대 혼합을 보장합니다.
14. 1.13.3단계의 최종 용액 750μL를 새로운 6웰 배양 플레이트의 두 웰에 추가합니다. 알루미늄 호일로 덮으십시오.
    알림: 표백을 방지하기 위해 6웰 플레이트는 항상 이 단계에서 알루미늄 호일로 덮여 있습니다.
15. 미세한 핀셋을 사용하여 transfection된 세포 배양 플레이트에서 최대 4개의 복제 커버슬립을 가져와서 1.14단계에서 새로운 6웰 플레이트의 첫 번째 채워진 웰(웰당 최대 4개의 슬라이드)에 놓습니다. 두 번째로 채워진 웰에 대해 이 과정을 반복합니다.
    알림: 동일한 충전 우물의 모든 커버슬립은 동일한 상태여야 합니다. 그러나 각 우물에는 서로 다른 조건이 포함될 수 있습니다.
16. 알루미늄 호일로 덮고 15-20분 동안 부드럽게 흔듭니다.
17. 염료 로딩 용액을 제거하고 1.13.3단계에서 사용한 대로 Ringer's plus 알부민의 새 세척 용액으로 교체합니다. 알루미늄 호일로 덮으십시오. 20분 동안 다시 흔들어 줍니다. 이것은 세포 내 에스테라아제에 의한 AM 에스테르의 절단을 허용합니다.

2. 현미경 준비

1. GFP 및 mCherry 형광단을 검출할 수 있는 도립 형광 현미경, 최소 두 개의 용액 사이를 전환할 수 있는 관류 시스템, 흡입 시스템 및 관류 챔버 등 필요한 도구( 재료 표 참조)를 준비합니다.
2. 현미경, 현미경 광원 및 카메라를 켭니다. 흡입 시스템을 켭니다.
3. 관류 시스템을 세척하십시오. 첫 번째 챔버를 Ringer 용액으로 세척하고 두 번째 챔버를 7μM 피리티온(아연 이온단, 재료 표 참조)이 보충된 7μM 아연 용액을 포함하는 Ringer 용액으로 세척합니다. 기포나 틈을 방지하려면 각 챔버에 약간의 액체를 남겨 두십시오.
   알림: 두 용기 모두 관류 챔버에 연결된 동일한 튜브에 연결되어 있으므로 항상 공유 세그먼트가 Ringer 용액으로 세척되었는지 확인하십시오.
4. 탭을 닫고 2.3단계에서와 같이 적절한 챔버를 Ringer의 용액과 Ringer의 아연 용액으로 채웁니다.

3. 샘플 준비

1. 관류 챔버를 가져 와서 홈의 좁은면이 위를 향하도록 놓습니다.
   알림: 홈은 관류 챔버 중간에 있는 구멍입니다. 관류액이 세포에 접근할 수 있습니다. 홈의 한쪽은 좁고 반대쪽은 넓습니다.
2. 홈 주위에 밀봉 실리콘( 재료 표 참조)을 바릅니다. 피펫 팁을 사용하여 홈에서 밀봉 실리콘을 청소합니다.
   알림: 홈 주위에 22mm 커버슬립을 밀봉하기에 충분한 실리콘 씰이 있는지 확인하십시오.
3. 미세한 핀셋을 사용하여 세척액에서 커버슬립을 꺼내 셀이 아래를 향하도록 홈 위에 놓습니다. 이렇게 하면 세포가 실험 중에 홈을 관류하는 용액에 노출됩니다.
4. 22mm 커버슬립 위에 13mm 커버슬립을 놓고 핀셋을 사용하여 조입니다. 커버슬립이 깨지지 않도록 주의하십시오.
5. 챔버를 뒤집고 눌러 현재의 모든 액체를 방출합니다. 홈에 100μL의 링거 세척액을 채우고 누출이 없도록 다시 누릅니다.
   알림: 누출이 감지되면 누출 부위에 밀봉제를 도포하고 다시 테스트하십시오.
6. 관류 챔버를 플랫폼에 장착하고 고정합니다. 관류 및 흡입 튜브를 배치하여 홈의 세포 위에 관류를 허용합니다.
7. 관류 속도를 약 2mL/분으로 변경하고 링거 용액의 관류를 켭니다. 관류 시스템이 누출이나 유출 없이 작동하는지 확인하십시오.

4. 측정 준비

1. 아이콘을 두 번 클릭하여 이미징 소프트웨어( 재료 표 참조)를 엽니다. 관련 자격 증명으로 로그인합니다. 부착된 카메라를 선택하고 OK를 누릅니다.
2. 현미경 왼쪽에 있는 버튼을 사용하여 현미경 배율을 10배로 설정합니다.
3. 라이브 뷰를 선택하고 조이스틱을 사용하여 플랫폼을 이동하여 홈의 셀에 초점을 맞춥니다.
4. 관류가 켜져 있는 동안 조명을 끄고 인터페이스의 전용 버튼을 눌러 파장을 mCherry로 변경합니다. 현미경 초점 휠을 사용하여 초점을 조정합니다.
5. 현미경이 세포에 초점을 맞추면 조이스틱을 사용하여 플랫폼을 움직여 적절한 세포 패치를 선택할 수 있습니다.
   참고: 적합한 영역은 ROI를 위한 최소 10개의 셀과 배경을 위한 빈 영역이 있는 영역으로 간주됩니다.
6. ROI 켜기/끄기(Turn ROIs On/Off) 드롭다운 메뉴를 선택하고 순환 ROI 그리기(Draw Circular ROIs)를 선택합니다.
7. mCherry 발현 세포를 사용하여 세포 클러스터의 ROI를 그립니다(ZnT1의 발현을 나타냄).
8. 4.6단계와 동일한 도구 모음에서 배경 ROI 켜기/끄기 버튼을 클릭하고 배경 ROI 의 위치와 크기를 셀이 전혀 없는 영역으로 조정합니다.
   1. mCherry 및 EGFP 파장을 확인하여 선택한 배경 ROI에 세포가 없는지 확인합니다.
      참고: mCherry는 520nm의 여기 파장과 610nm의 방출 파장을 사용하고 EGFP는 470nm의 여기 파장과 520nm의 방출 파장을 사용하도록 파장을 조정했습니다.
9. 파장(λ) 하위 탭을 선택합니다. 확인란을 선택하고 GFP 파장이 있고 확인란이 표시되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 추가하고 표시하십시오.
10. 기간 하위 탭을 선택합니다. 측정 구간을 5초마다로 정의하고, 실험 기간에 맞게 구간 수를 변경합니다.
11. 접안렌즈 아래 현미경 패널의 초점 섹션에서 켜기 버튼을 클릭하여 완벽한 초점 시스템(PFS)을 활성화합니다.
12. PFS 초점 휠을 사용하여 초점을 조정합니다. 소프트웨어 인터페이스의 ND Acquisition( ND 획득)에서 PFS on(PFS 켜기) 이 선택되어 있는지 확인합니다.
13. Run now(지금 실행)를 클릭합니다.

5. 실험 절차

1. Ringer의 용액 관류를 사용하여 90초 기준 주기 측정으로 시작합니다.
2. 기준선 기간이 끝나면 Ringer's solution perfusion을 끈 다음 Ringer's zinc solution perfusion을 켭니다. 기본 인터페이스 패널의 오른쪽 하단에 있는 빨간색 플래그를 클릭하여 솔루션 전환을 표시합니다. 형광의 상승이 나타날 것으로 예상됩니다.
3. 형광 상승이 포화되기 시작하면 Ringer의 용액을 사용하여 관류로 다시 변경합니다. Ringer의 아연 용액 관류를 끈 다음 Ringer의 용액 관류를 켭니다.
4. 실험 시간이 만료될 때까지 기다립니다. ZnT1이 제대로 작동하는 경우 형광이 눈에 띄지만 꾸준히 감소할 것으로 예상됩니다.

6. 데이터 내보내기

1. 기준선 빼기로 데이터를 내보내려면 기준선 빼기 버튼을 누르고 "ND 획득 창"에서 변경 사항을 확인합니다.
2. "ND acquisition window"의 소프트웨어 인터페이스에서 Export 버튼을 클릭합니다. Excel 데이터시트가 열립니다. 원하는 위치에 저장합니다.

7. 데이터 분석

1. 각 ROI에 대해 처음 90-100초의 평균 기준 형광을 생성합니다.
2. 각 ROI에 대해 계산된 형광을 해당 ROI에 대한 배경의 백분율로 표현합니다.
3. 모든 ROI의 행 평균을 만들고 결과를 선 그래프로 플로팅합니다. 이렇게 하면 모든 ROI의 평균이 시간 함수로 생성됩니다.
4. 선형 맞춤 기능을 사용하여 Ringer의 용액으로 세척한 후 형광 감소에 대한 초기 속도를 선택합니다. 방정식의 기울기 값은 전송 속도와 상관 관계가 있습니다.

결과

ZnT1은 세포 원형질막(¹³) 상에 위치한 포유류 아연 수송체이다. 이는 세포질에서 세포외 밀리유(extracellular millieu)로 아연을 압출하는 양이온 확산 촉진제(cation diffusion facilitator, CDF) 단백질군의 일원이다¹⁴. ZnT1은 막을 가로질러 이온을 운반하는 막관통 도메인과 C-말단 도메인(¹⁴)의 두 가지 영역 아키텍처를 가지고 있습니다. 다른 알려진 CDF 단백...

토론

상술한 방법은 높은 시간적 분해능으로 세포내 아연 농도를 직접 측정할 수 있게 한다. 다른 방법과 비교하여, 세포 내^Zn2+의 변화를 모니터링하는 이 방법은 배경 소음을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 또한, 아연에 대한 염료의 선택성은 다른 금속 양이온과의 잠재적인 교차 상호작용을 제거한다^(18,19). 마지막으로, 즉각적인 세포 독성이 없기 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm plate	greiner bio-one	664160
12-well cell culture plate	greiner bio-one	665180
13 mm coverslips	Superior Marienfeld	111530
22 mm cover slides	Superior Marienfeld	101050
6-well culture plate	greiner bio-one	657160
Bovine serum albumin	bioWorld	22070008
Calcium chloride anhydrous, granular	Sigma Aldrich	C1016	Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose	Glentham Life Science	GC6947	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope	Nikon	TI-DH	Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30088.03
Fine tweezers	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution	Cytiva	SV30010
LED illumination system	CoolLED	pE-4000
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	1.05833	Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software	Nikon	AR
Pluronic acid F-127	Millipore	540025
Pottasium chloride	Bio-Lab	163823	Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione	Sigma Aldrich	H3261	Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit	Warner Instruments	W4 64-0378
Sodium chloride	Bio-Lab	190305	Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate			Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
	Sigma Aldrich	31665