In Vitro Zinc Transport Assay를 사용한 포유류 아연 수송체 특성 분석

요약

아연 수송은 단백질 기능에 대한 인과 관계가 약하고 시간적 분해능이 낮기 때문에 측정하기 어려운 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 Zn 2+ 민감한 형광 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 높은 시간 분해능으로 Zn 2+ 압출을 모니터링하여 Zn²⁺ 유출을 직접 측정하는 방법을 설명합니다.

초록

Zn²⁺ 이온과 같은 전이 금속은 세포 독성으로 인해 엄격하게 조절되어야 합니다. 이전에는, Zn2+ 수송체의 활성은^Zn2+의 상이한 농도 하에서 수송체의 발현 수준을 결정함으로써 간접적으로 측정되었다. 이는 면역조직화학을 이용하거나, 조직 내 mRNA를 측정하거나, 세포 Zn²⁺ 수준을 측정하여 수행되었습니다. 세포 내 Zn 2+ 센서의 개발로 아연 수송체의 활성은 현재 형광 프로브를 사용하여 검출된 세포 내 Zn 2+의 변화와 Zn²⁺ 수송체의 발현을 연관시킴으로써 주로 결정됩니다. 그러나 오늘날에도 세포 내 Zn²⁺의 동적 변화를 모니터링하고 이를 사용하여 아연 수송체의 활성을 직접 측정하는 실험실은 소수에 불과합니다. 문제의 일부는 ZnT10(망간 수송)을 제외한 ZnT 계열의 10개 아연 수송체 중 아연 수송체 1(ZnT1)만 원형질막에 국한되어 있다는 것입니다. 따라서 수송 활성을 세포 내 Zn²⁺ 농도의 변화와 연결하는 것은 어렵습니다. 이 글에서는 아연 특이적 형광 염료인 FluoZin-3을 기반으로 하는 분석을 사용하여 아연 수송 역학을 측정하는 직접적인 방법을 설명합니다. 이 염료는 에스테르 형태로 포유류 세포에 로드된 다음 세포 디에스테라제 활성으로 인해 세포질에 갇히게 됩니다. 세포는 Zn 2+ ionophore pyrithione을 사용하여 Zn²⁺로 로드됩니다. ZnT1 활성은 세포 세척 후 형광 감소의 선형 부분에서 평가됩니다. 470nm의 여기와 520nm의 방출에서 측정된 형광은 유리 세포 내 Zn²⁺에 비례합니다. mCherry 형광단으로 태그된 ZnT1을 발현하는 세포를 선택하면 수송체를 발현하는 세포만 모니터링할 수 있습니다. 이 분석법은 세포에서 과잉 아연을 압출하는 진핵 세포막 관통 단백질인 인간 ZnT1의 수송 메커니즘에 대한 ZnT1 단백질의 다양한 영역의 기여도를 조사하는 데 사용됩니다.

서문

아연은 세포 환경에서 필수적인 미량 원소입니다. 그것은 모든 단백질의 1/3을 포함하며 촉매^{작용 1}, 전사² 및 구조 모티프³와 같은 다양한 세포 과정에 관여합니다. 그러나 산화 환원 불활성임에도 불구하고 높은 아연 농도는 세포에 독성이 있기 때문에 아연 항상성을 조절하는 메커니즘이 없으면 포유류 유기체가 생존하지 못했습니다. 포유류에서는 세 가지 메커니즘이 이 과정을 담당합니다: (1) 높은 친화력으로 아연과 결합하여 과도한 유리 세포질 아연을 방지하는 세포질 시스테인이 풍부한 단백질인 메탈로티오닌⁴; (2) Zrt/Irt 유사 단백질(ZIP)은 원형질막 또는 세포 내 소기관을 통해 세포질로 아연 유입을 담당하는 아연 수송체입니다 4,5,6,7,8; (3) ZnT는 유비쿼터스 양이온 확산 촉진제(CDF) 계열의 포유류 하위 집합이며 ....

프로토콜

1. 세포 transfection

1. 10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민 및 1x 페니실린/스트렙토마이신( 재료 표 참조)이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 세포를 37°C/5%_CO2 의 가습 인큐베이터에서 10cm 플레이트(8.8 x 10 총⁶ 개 세포)에 합류할 때까지 HEK293T배양합니다.
2. 13웰 플레이트의 각 웰에 12mm 커버슬립을 하나씩 놓습니다. 1.1단계의 0.44 x 10⁶ 트립신 세포를 12mL의 완전한 DMEM에 희석합니다. 피펫팅을 3-5회 위아래로 하여 잘 섞습니다. 각 웰에 1mL의 혼합 용액을 채웁니다. 37 °C / 5 % CO₂ 의 가습 인큐베이터에서 밤새 성장합니다.
3. 각 웰의 전체 DMEM을 각 웰의 1mL의 무혈청 DMEM( 재료 표 참조)으로 교체합니다. 12웰 플레이트를 1.1단계와 같이 가습 인큐베이터로 되돌립니다.
4. 각 transfection well에 대해 mCherry 형광 단백질(보충 파일 1)로 태그된 관심 단백질을 포함하는 pAAV2....

토론

상술한 방법은 높은 시간적 분해능으로 세포내 아연 농도를 직접 측정할 수 있게 한다. 다른 방법과 비교하여, 세포 내^Zn2+의 변화를 모니터링하는 이 방법은 배경 소음을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 또한, 아연에 대한 염료의 선택성은 다른 금속 양이온과의 잠재적인 교차 상호작용을 제거한다^(18,19). 마지막으로, 즉각적인 세포 독성이 없기 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm plate	greiner bio-one	664160
12-well cell culture plate	greiner bio-one	665180
13 mm coverslips	Superior Marienfeld	111530
22 mm cover slides	Superior Marienfeld	101050
6-well culture plate	greiner bio-one	657160
Bovine serum albumin	bioWorld	22070008
Calcium chloride anhydrous, granular	Sigma Aldrich	C1016	Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose	Glentham Life Science	GC6947	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope	Nikon	TI-DH	Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30088.03
Fine tweezers	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution	Cytiva	SV30010
LED illumination system	CoolLED	pE-4000
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	1.05833	Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software	Nikon	AR
Pluronic acid F-127	Millipore	540025
Pottasium chloride	Bio-Lab	163823	Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione	Sigma Aldrich	H3261	Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit	Warner Instruments	W4 64-0378
Sodium chloride	Bio-Lab	190305	Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate			Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
	Sigma Aldrich	31665