Caratterizzazione dei trasportatori di zinco nei mammiferi mediante un saggio di trasporto dello zinco in vitro

Riepilogo

Il trasporto dello zinco si è dimostrato difficile da misurare a causa dei deboli legami causali con la funzione proteica e della bassa risoluzione temporale. Questo protocollo descrive un metodo per monitorare, con alta risoluzione temporale, l'estrusione di Zn 2+ da cellule viventi utilizzando un colorante fluorescente sensibile allo Zn 2+, fornendo così una misura diretta dell'efflusso di Zn²⁺.

Abstract

I metalli di transizione come gli ioni Zn²⁺ devono essere strettamente regolamentati a causa della loro tossicità cellulare. In precedenza, l'attività dei trasportatori di Zn 2+ veniva misurata indirettamente determinando il livello di espressione del trasportatore sotto diverse concentrazioni di Zn²⁺. Ciò è stato fatto utilizzando l'immunoistochimica, misurando l'mRNA nel tessuto o determinando i livelli cellulari di Zn²⁺. Con lo sviluppo di sensori intracellulari di Zn 2+, le attività dei trasportatori di zinco sono attualmente determinate principalmente correlando i cambiamenti intracellulari di Zn 2+, rilevati utilizzando sonde fluorescenti, con l'espressione dei trasportatori di Zn²⁺. Tuttavia, ancora oggi, solo pochi laboratori monitorano i cambiamenti dinamici nello Zn²⁺ intracellulare e lo utilizzano per misurare direttamente l'attività dei trasportatori di zinco. Parte del problema è che dei 10 trasportatori di zinco della famiglia ZnT, ad eccezione di ZnT10 (trasporta manganese), solo il trasportatore di zinco 1 (ZnT1) è localizzato sulla membrana plasmatica. Pertanto, è difficile collegare l'attività di trasporto ai cambiamenti nella concentrazione intracellulare di Zn²⁺. Questo articolo descrive un modo diretto per determinare la cinetica di trasporto dello zinco utilizzando un saggio basato su un colorante fluorescente specifico per lo zinco, FluoZin-3. Questo colorante viene caricato nelle cellule di mammifero nella sua forma estere e quindi intrappolato nel citosol a causa dell'attività della diesterasi cellulare. Le cellule sono caricate con Zn 2+ utilizzando lo ionoforo Zn²⁺ piritione. L'attività di ZnT1 è valutata dalla parte lineare della riduzione della fluorescenza a seguito del washout cellulare. La fluorescenza misurata ad un'eccitazione di 470 nm e un'emissione di 520 nm è proporzionale allo Zn²⁺ intracellulare libero. La selezione delle cellule che esprimono ZnT1 marcate con il fluoroforo mCherry consente di monitorare solo le cellule che esprimono il trasportatore. Questo saggio viene utilizzato per studiare il contributo di diversi domini della proteina ZnT1 al meccanismo di trasporto della ZnT1 umana, una proteina eucariotica transmembrana che estrude lo zinco in eccesso dalla cellula.

Introduzione

Lo zinco è un oligoelemento essenziale nell'ambiente cellulare. Incorpora un terzo di tutte le proteine ed è coinvolto in vari processi cellulari, come la catalisi¹, la trascrizione² e i motivi strutturali³. Tuttavia, nonostante sia redox-inerte, alte concentrazioni di zinco sono tossiche per la cellula, motivo per cui nessun organismo di mammifero è sopravvissuto senza la presenza di meccanismi che regolano l'omeostasi dello zinco. Nei mammiferi, tre meccanismi sono responsabili di questo processo: (1) metallotioneine, che sono proteine citosoliche ricche di cisteina che legano lo zinco ad un'elevata affinità, prevenendo così l'eccesso di zinco citosolico libero⁴; (2) Proteine Zrt/Irt-like (ZIPs), che sono trasportatori di zinco responsabili dell'afflusso di zinco nel citosol attraverso la membrana plasmatica o dagli organelli intracellulari 4,5,6,7,8; e (3) ZnT, che sono un sottoinsieme di mammiferi della famiglia dei facilitatori di diffusione cationica ubiquitaria (CDF) e sono trasportatori di zinco, in quanto estrudono lo zinco dal citosol attraverso la membrana plasmatica o negli organelli intracellulari 4,5,6,7,8,9. A causa dell'importanza dello zinco per il metabolismo cellulare, è fondamentale comprendere le dinamiche cellulari dello zinco.

I metodi precedenti per valutare la dinamica dello zinco dipendevano dalla valutazione dei livelli di espressione dell'mRNA in diverse condizioni di zinco, correlandoli con le misurazioni cellulari dello zinco di tessuti o cellule fisse^10,11,12. Questi metodi includono il rilevamento chimico e la colorazione immunoistochimica. Tuttavia, questi metodi forniscono solo misure indirette e, quindi, determinano solo una correlazione offline tra la concentrazione intracellulare di zinco e l'espressione dei trasportatori di zinco. Di conseguenza, questi metodi non possono dedurre alcun parametro che richieda un'elevata risoluzione temporale.

Una misurazione più diretta del trasporto di Zn²⁺ utilizza isotopi radioattivi dello zinco¹³. Questo metodo si basa sulla misurazione dello Zn²⁺ radiomarcato per monitorare il trasporto dello zinco e la sua cinetica. Tuttavia, a causa dell'importanza dello zinco per l'omeostasi cellulare, molteplici processi cellulari regolano la concentrazione intracellulare di zinco. Tra questi ci sono il legame extracellulare e diversi sistemi di trasporto che lavorano di concerto per mantenere uno stretto controllo dei livelli intracellulari di Zn²⁺ . La combinazione di questi processi crea un notevole rumore di fondo, che rende difficile testare le singole funzioni di trasporto legate allo zinco.

Questo articolo illustra un metodo per monitorare direttamente la velocità di trasporto dello zinco misurando la concentrazione intracellulare di zinco libero utilizzando un colorante fluorescente specifico per lo zinco, FluoZin-3. Il colorante ha un'elevata specificità per Zn²⁺ e poca interferenza da altri cationi bivalenti, come il calcio. Inoltre, nella sua forma estere, entra nelle cellule per diffusione non ionica e viene quindi intrappolato a causa dell'attività della diesterasi intracellulare. Pertanto, la sua fluorescenza è correlata principalmente con la concentrazione di zinco citosolico libero. Questi esperimenti sono stati condotti per studiare la relazione struttura-funzione del trasportatore di zinco 1 (ZnT1), un membro della famiglia ZnT.

Protocollo

1. Trasfezione cellulare

1. Coltura di cellule HEK293T in terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di L-glutammina e 1x penicillina/streptomicina (vedi Tabella dei materiali) in un incubatore umidificato a 37 °C/5% CO₂ fino alla confluenza su una piastra di 10 cm (8,8 x 10⁶ cellule totali).
2. Posizionare un vetrino coprioggetto da 13 mm in ciascuno dei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti. Diluire 0,44 x 10⁶ cellule tripsinizzate del passaggio 1,1 in 12 mL di DMEM completo. Mescolare bene pipettando su e giù da tre a cinque volte. Riempire ogni pozzetto con 1 mL della soluzione miscelata. Coltiva in un'incubatrice umidificata a 37 °C/5% di CO₂ per una notte.
3. Sostituire il DMEM completo in ciascun pozzetto con 1 mL di DMEM senza siero (vedere la tabella dei materiali) in ciascun pozzetto. Rimettere la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore umidificato come al punto 1.1.
4. Per ogni pozzetto di trasfezione, diluire 1 μg di plasmide pAAV2 contenente la proteina di interesse marcata con la proteina fluorescente mCherry (File supplementare 1) in 100 μL di DMEM esente da siero in una provetta da 1,5 mL.
5. Aggiungere 3 μg di polietilenimmina (PEI, vedere la tabella dei materiali) a 100 μL di DMEM esente da siero per trasfezione, ad ogni trasfezione in una diversa provetta da 1,5 mL. Il rapporto plasmide:PEI dovrebbe essere 1:3 (μg:μg).
6. Agitare entrambi i tubi dal punto 1.4 e dal punto 1.5 per 10 s e lasciare riposare a temperatura ambiente per almeno 5 min.
7. Miscelare una parte (100 μL per pozzetto) della soluzione di DNA della fase 1.4 con una parte (100 μL per pozzetto) della soluzione di PEI della fase 1.5. Agitare la soluzione finale per 10 s e lasciarla riposare a temperatura ambiente per almeno 20 min e per un massimo di 6 h.
8. Prendere la piastra a 12 pozzetti dall'incubatrice. Eseguire il vortice della soluzione finale dal passaggio 1.7 e aggiungere 200 μL a ciascuno dei pozzetti nella piastra a 12 pozzetti dal passaggio 1.3. Rimettere la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore umidificato (passaggio 1.1).
9. Dopo 3 ore, sostituire il terreno in ciascun pozzetto con 1 mL di DMEM completo. Rimettere la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore umidificato come al punto 1.1.
10. Dopo 2 giorni, prelevare la coltura cellulare trasfettata dall'incubatore a 37 °C/5% di CO₂ e posizionarla su un microscopio a fluorescenza invertito utilizzando un ingrandimento 10x.
11. Utilizzando la rotella di messa a fuoco del microscopio, mettere a fuoco le cellule mentre si utilizza la luce in campo chiaro.
12. Passare alle lunghezze d'onda di eccitazione fluorescente mCherry (587 nm) ed emissione (610 nm) e spegnere la luce in campo chiaro. Verificare la fluorescenza delle cellule per confermare l'espressione di ZnT1 mCherry.
13. Preparare la soluzione di caricamento del colorante.
    1. Prelevare un'aliquota di 4 μL di colorante fluorescente zinco-specifico (vedere Tabella dei materiali) nella sua forma estere di acetossimetile (AM), disciolto in DMSO (1 μg/μL), da una carta protetta dalla luce conservata in un congelatore a −20 °C. Questa forma consente al colorante di entrare nella cellula attraverso la membrana plasmatica per semplice diffusione.
    2. Aggiungere 4 μL di acido pluronico al 10% (o 2 μL di acido pluronico al 20%, vedere la tabella dei materiali) all'aliquota del passaggio 1.13.1. Mescolare bene la soluzione pipettando su e giù tre volte, quindi aggiungere tutti gli 8 μL in una provetta da 1,5 mL.
    3. Aggiungere 750 μL di soluzione di Ringer (preparata internamente, vedere la tabella dei materiali per la composizione) integrata con 1 mg/mL (~0,1%) di albumina sierica bovina nella provetta dal passaggio 1.13.2 e vorticare vigorosamente. Aggiungere altri 750 μL della stessa soluzione e vorticare di nuovo per garantire la massima miscelazione.
14. Aggiungere 750 μL della soluzione finale del passaggio 1.13.3 a due pozzetti in una nuova piastra di coltura a 6 pozzetti. Coprire con un foglio di alluminio.
    NOTA: Per evitare lo sbiancamento, la piastra a 6 pozzetti viene sempre coperta con un foglio di alluminio da questo passaggio.
15. Utilizzando una pinzetta fine, prelevare fino a quattro vetrini coprioggetti replicati dalla piastra di coltura cellulare trasfettata e posizionarli nel primo pozzetto riempito (fino a quattro vetrini per pozzetto) della nuova piastra a 6 pozzetti del passaggio 1.14. Ripeti questo processo per il secondo pozzetto riempito.
    NOTA: Tutti i vetrini coprioggetti nello stesso pozzetto riempito devono essere nelle stesse condizioni. Tuttavia, ogni pozzo può contenere condizioni diverse.
16. Coprire con un foglio di alluminio e agitare delicatamente per 15-20 minuti.
17. Rimuovere la soluzione di caricamento del colorante e sostituirla con una nuova soluzione di lavaggio di Ringer's più albumina, come utilizzato nel passaggio 1.13.3. Coprire con un foglio di alluminio. Lasciare agitare nuovamente per 20 min. Ciò consente la scissione dell'estere AM da parte delle esterasi intracellulari.

2. Preparazione del microscopio

1. Disporre gli strumenti necessari (vedi Tabella dei Materiali) come detto: un microscopio a fluorescenza invertita in grado di rilevare i fluorofori GFP e mCherry, un sistema di perfusione che consenta di passare tra almeno due soluzioni, un sistema di aspirazione e una camera di perfusione.
2. Accendere il microscopio, la sua fonte di luce e la fotocamera. Accendere il sistema di aspirazione.
3. Lavare il sistema di perfusione. Lavare la prima camera con la soluzione di Ringer e la seconda camera con la soluzione di Ringer contenente una soluzione di zinco di 7 μM integrata con 7 μM di piritione (ionoforo di zinco, vedere la tabella dei materiali). Per evitare bolle d'aria o spazi vuoti, lasciare un po' di liquido in ogni camera.
   NOTA: Poiché entrambi i contenitori sono collegati allo stesso tubo agganciato alla camera di perfusione, assicurarsi sempre che il segmento condiviso sia lavato con la soluzione di Ringer.
4. Chiudere i rubinetti e riempire le camere appropriate con la soluzione di Ringer e la soluzione di zinco di Ringer, come al punto 2.3.

3. Preparazione del campione

1. Prendi la camera di perfusione e posizionala con il lato stretto della scanalatura rivolto verso l'alto.
   NOTA: La scanalatura è un foro al centro della camera di perfusione. Permette al fluido di perfusione di accedere alle cellule. Un lato della scanalatura è stretto e il lato opposto è largo.
2. Applicare un silicone sigillante (vedere la tabella dei materiali) attorno alla scanalatura. Pulire il silicone sigillante dalla scanalatura utilizzando un puntale per pipetta.
   NOTA: Assicurarsi che ci sia una guarnizione in silicone sufficiente attorno alla scanalatura per sigillare un vetrino coprioggetti da 22 mm.
3. Usando una pinzetta fine, prendi un vetrino coprioggetti dalla soluzione di lavaggio e posizionalo sopra la scanalatura con le celle rivolte verso il basso. In questo modo, le cellule saranno esposte alla soluzione che perfonde il solco durante l'esperimento.
4. Posizionare un vetrino coprioggetto da 22 mm sopra il vetrino coprioggetto da 13 mm e serrarlo con la pinzetta. Fare attenzione a non rompere i vetrini coprioggetti.
5. Capovolgere la camera e premere su di essa per rilasciare tutti i liquidi presenti. Riempire la scanalatura con 100 μL di soluzione di lavaggio Ringer e premere nuovamente per assicurarsi che non vi siano perdite.
   NOTA: Se viene rilevata una perdita, applicare un sigillante nel sito della perdita e ripetere il test.
6. Montare la camera di perfusione sulla piattaforma e fissarla. Posizionare i tubi di perfusione e di aspirazione per consentire la perfusione sulle cellule nella scanalatura.
7. Modificare la velocità di perfusione a circa 2 mL/min e attivare la perfusione della soluzione di Ringer. Assicurarsi che il sistema di perfusione funzioni senza perdite o fuoriuscite.

4. Preparazione della misurazione

1. Aprire il software di imaging (vedere Tabella dei materiali) facendo doppio clic sull'icona. Accedi con le relative credenziali. Scegli la fotocamera collegata e premi Ok.
2. Impostare l'ingrandimento del microscopio su 10x utilizzando il pulsante sul lato sinistro del microscopio.
3. Scegliendo la visualizzazione live e utilizzando il joystick, sposta la piattaforma per concentrarti sulle celle nel solco.
4. Mentre la perfusione è attiva, spegni le luci e cambia la lunghezza d'onda in mCherry premendo il pulsante dedicato nell'interfaccia. Regolare la messa a fuoco utilizzando la rotella di messa a fuoco del microscopio.
5. Una volta che il microscopio è focalizzato sulle cellule, spostare la piattaforma utilizzando il joystick per consentire la selezione dei cerotti cellulari appropriati.
   NOTA: un'area adatta è considerata un'area con almeno 10 celle per un ROI e un'area vuota per lo sfondo.
6. Seleziona il menu a discesa Attiva/disattiva ROI e scegli Disegna ROI circolari.
7. Disegna le ROI dei cluster di cellule con le cellule che esprimono mCherry (indica l'espressione di ZnT1).
8. Dalla stessa barra degli strumenti del passaggio 4.6, fare clic sul pulsante Attiva/disattiva ROI in background e regolare la posizione e le dimensioni della ROI in background su un'area senza celle.
   1. Verificare con le lunghezze d'onda mCherry ed EGFP per assicurarsi che non vi siano celle nel ROI di fondo selezionato.
      NOTA: Le lunghezze d'onda sono state regolate in modo che mCherry utilizzasse una lunghezza d'onda di eccitazione di 520 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 610 nm e EGFP utilizzasse una lunghezza d'onda di eccitazione di 470 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 520 nm.
9. Selezionare la sottoscheda Lunghezza d'onda (λ). Selezionare la casella di controllo e assicurarsi che la lunghezza d'onda GFP sia presente e che la casella di controllo sia contrassegnata. In caso contrario, aggiungilo e contrassegnalo.
10. Selezionare la sottoscheda Durata . Definire l'intervallo di misurazione ogni 5 s e modificare il numero di intervalli in base alla durata dell'esperimento.
11. Nella sezione Messa a fuoco del pannello del microscopio sotto l'oculare, fare clic sul pulsante On per abilitare il sistema di messa a fuoco perfetta (PFS).
12. Utilizzando la rotella di messa a fuoco PFS, regolare la messa a fuoco. Nell'interfaccia del software, in ND Acquisition, verificare che PFS on sia selezionato.
13. Fare clic su Esegui ora.

5. Procedura sperimentale

1. Iniziare con una misurazione del periodo di base di 90 s utilizzando la perfusione della soluzione di Ringer.
2. Al termine del periodo di riferimento, disattivare la perfusione della soluzione di Ringer, quindi attivare la perfusione della soluzione di zinco di Ringer. Contrassegnare il passaggio della soluzione facendo clic sulla bandiera rossa in basso a destra nel pannello principale dell'interfaccia. Si prevede un aumento della fluorescenza.
3. Una volta che l'aumento della fluorescenza inizia a saturarsi, tornare alla perfusione con la soluzione di Ringer. Disattivare la perfusione della soluzione di zinco della suoneria, quindi attivare la perfusione della soluzione della suoneria.
4. Attendere la scadenza del tempo dell'esperimento. Ci si aspetta una notevole ma costante diminuzione della fluorescenza se lo ZnT1 funziona correttamente.

6. Esportazione dei dati

1. Per esportare i dati con la sottrazione della linea di base, premere il pulsante Sottrai linea di base e visualizzare le modifiche nella "finestra di acquisizione ND".
2. Fare clic sul pulsante Esporta nell'interfaccia del software nella "finestra di acquisizione ND". Si aprirà un foglio dati excel. Salvare nella posizione desiderata.

7. Analisi dei dati

1. Per ogni ROI, creare una fluorescenza di base media dai primi 90-100 s.
2. Esprimere la fluorescenza calcolata per ogni ROI come percentuale dello sfondo per tale ROI.
3. Crea una media di righe di tutti i ROI e traccia il risultato come grafico a linee. Questo crea una media di tutti i ROI in funzione del tempo.
4. Utilizzando la funzione di adattamento lineare, selezionare il tasso iniziale per la diminuzione della fluorescenza dopo il lavaggio con la soluzione di Ringer. Il valore della pendenza dell'equazione è correlato alla velocità di trasporto.

Risultati

ZnT1 è un trasportatore di zinco dei mammiferi situato sulla membrana plasmatica cellulare¹³. È un membro della famiglia delle proteine facilitatore della diffusione cationica (CDF) che estrude lo zinco dal citosol al millieu¹⁴ extracellulare. ZnT1 ha un'architettura a due domini: il dominio transmembrana, che trasporta gli ioni attraverso la membrana, e un dominio C-terminale¹⁴. A differenza di altre proteine CDF conosciute, ZnT1 ha un dominio C-t...

Discussione

Il metodo sopra descritto consente la misurazione diretta della concentrazione intracellulare di zinco con un'elevata risoluzione temporale. Rispetto ad altri metodi, questo metodo che prevede il monitoraggio dei cambiamenti nello Zn²⁺ intracellulare può ridurre sostanzialmente il rumore di fondo. Inoltre, la selettività del colorante per lo zinco elimina le potenziali interazioni incrociate con altri cationi metallici^18,19. Infine, la sua mancanza d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm plate	greiner bio-one	664160
12-well cell culture plate	greiner bio-one	665180
13 mm coverslips	Superior Marienfeld	111530
22 mm cover slides	Superior Marienfeld	101050
6-well culture plate	greiner bio-one	657160
Bovine serum albumin	bioWorld	22070008
Calcium chloride anhydrous, granular	Sigma Aldrich	C1016	Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose	Glentham Life Science	GC6947	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope	Nikon	TI-DH	Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30088.03
Fine tweezers	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution	Cytiva	SV30010
LED illumination system	CoolLED	pE-4000
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	1.05833	Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software	Nikon	AR
Pluronic acid F-127	Millipore	540025
Pottasium chloride	Bio-Lab	163823	Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione	Sigma Aldrich	H3261	Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit	Warner Instruments	W4 64-0378
Sodium chloride	Bio-Lab	190305	Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate			Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
	Sigma Aldrich	31665