إجراء للتشريح بالتبريد لجذر الجذر الظهري للفأر

Summary

يظهر هنا التطوير للحصول باستمرار على أقسام تبريد العقدة الجذرية الظهرية عالية الجودة.

Abstract

تعد أقسام العقدة الجذرية الظهرية للفأر (DRG) عالية الجودة ضرورية لتلطيخ الكيمياء المناعية المناسبة ودراسات RNAscope في البحث عن الألم الالتهابي والاعتلال العصبي والحكة بالإضافة إلى الحالات العصبية الطرفية الأخرى. ومع ذلك ، لا يزال من الصعب الحصول باستمرار على أقسام كريوستات عالية الجودة وسليمة ومسطحة على شرائح زجاجية بسبب حجم العينة الصغير لأنسجة DRG. حتى الآن ، لا توجد مقالة تصف البروتوكول الأمثل للتشريح بالتبريد DRG. يقدم هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لحل الصعوبات التي تواجهها بشكل متكرر والمرتبطة بالتقسيم بالتبريد DRG. تشرح المقالة المقدمة كيفية إزالة السائل المحيط من عينات أنسجة DRG ، ووضع أقسام DRG على الشريحة التي تواجه نفس الاتجاه ، وتسطيح الأقسام الموجودة على الشريحة الزجاجية دون التقويس. على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم تطويره للتشريح بالتبريد لعينات DRG ، إلا أنه يمكن تطبيقه على التشريح بالتبريد للعديد من الأنسجة الأخرى ذات حجم العينة الصغير.

Introduction

تحتوي العقدة الجذرية الظهرية (DRG) على الخلايا العصبية الحسية الأولية ، والبلاعم النسيجية ، والخلايا الساتلية التي تحيط بالخلايا العصبية الحسية الأولية¹،²،^3،4. إنه هيكل تشريحي رئيسي في معالجة الإشارات غير الضارة والضارة ، ويلعب أدوارا حاسمة في الألم والحكة واضطرابات الأعصاب الطرفية المختلفة⁵،⁶،⁷،⁸،⁹،^10،11،^12،13. على الرغم من تطوير عدة طرق لتشريح أنسجة DRG من الحبل الشوكي للفأر¹⁴،¹⁵،¹⁶ ، إلا أن التشريح بالتبريد لأنسجة DRG لا يزال يمثل تحديا لأن أنسجة DRG صغيرة جدا ، وتميل أقسام cryostat من عينات DRG إلى الانحناء إلى لفات ^، مما يجعل من الصعب نقل أقسام cryostat بشكل صحيح إلى شرائح زجاجية. ومع ذلك ، فإن التشريح بالتبريد المناسب لأنسجة DRG أمر بالغ الأهمية لدراسات الكيمياء الهيستولوجية المناعية وهيكل الخلايا العصبية الحسية DRG¹⁷،¹⁸،¹⁹،^{20،21،22،23}. علاوة على ذلك ، نظرا لأن نتائج تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية قد كشفت عن عدم التجانس الملحوظ للخلايا العصبية الحسية DRG في كل من البشر²⁴ والفئران²⁵ ، فإن التقسيم بالتبريد المناسب لأنسجة DRG أمر بالغ الأهمية للتحقيق في الدور الوظيفي لخلايا DRG المختلفة في مختلف الحالات الفسيولوجية والمرضية.

على الرغم من أن تقنية إزالة الأنسجة قد تم تطبيقها للتحقيق في إعادة بناء 3D ل DRG²⁶ كتقنية بديلة للتشريح بالتبريد DRG ، فإن تقنية إزالة الأنسجة تستغرق وقتا طويلا وعمالة. وبالمقارنة ، فإن التقسيم بالتبريد ل DRG سريع وسهل الأداء نسبيا ، وبالتالي يظل تقنية رئيسية للكيمياء المناعية ودراسات بنية DRG ومناطق أخرى من الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن الحصول على أقسام كريوستات عالية الجودة وسليمة ومسطحة على شرائح زجاجية لا يزال يمثل تحديا في أبحاث علم الأعصاب بسبب حجم العينة الصغير للأنسجة ، مثل DRG وبعض مناطق الدماغ ، ولا توجد مقالة تصف البروتوكول الأمثل في هذه المرحلة للتشريح بالتبريد لعينات الأنسجة صغيرة الحجم ، مثل DRGs الفأر.

يوفر هذا البروتوكول تقنية سهلة خطوة بخطوة لتقسيم cryostat للماوس DRG للحصول بشكل موثوق على أكبر عدد ممكن من أقسام DRG عالية الجودة على الشرائح لدراسات DRG اللاحقة. في حين أن هذه التقنية مصممة خصيصا للتشريح بالتبريد لعينات DRG ، إلا أنه يمكن استخدامها للتشريح بالتبريد لمختلف الأنسجة الأخرى ذات حجم العينة الصغير.

Protocol

بالنسبة للدراسة الحالية ، تمت الموافقة على التجارب على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو وتم إجراؤها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تم استخدام الفئران البالغة من العمر 8-12 أسبوعا C57BL / 6 من الذكور والإناث (المرباة في المنزل) هنا.

1. إعداد عينة DRG

1. تخدير الفئران بنسبة 2.5٪ Avertin (انظر جدول المواد). ضمان التخدير الكافي من خلال عدم الاستجابة للتحفيز المؤلم. قم بتغذية عبر القلب بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) متبوعا ب 4٪ فورمالديهايد ، كما هو موضح سابقا¹⁴،^15،16.
2. تشريح أنسجة DRG من الحبل الشوكي ، كما هو موضح سابقا¹⁴،^15،16.
3. بعد إصلاح DRGs تشريح في 4 ٪ الفورمالديهايد لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
4. ضع DRGs في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
5. تحضير درجة حرارة القطع المثلى للقاعدة (OCT)
   1. أضف مركب OCT (انظر جدول المواد) لتغطية السطح العلوي لكتلة الألومنيوم وقم بتجميده عند -20 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق (الشكل 1 أ).
   2. اقطع الجزء العلوي من OCT باستخدام cryostat (انظر جدول المواد) بسمك 30 ميكرومتر حتى يصبح سطحه مسطحا مثل OCT الأساسي (الشكل 1B).
   3. ضع علامة في الجزء السفلي (موضع الساعة السادسة) من OCT الأساسي لتحديد اتجاهه ، قبل إزالة كتلة الألومنيوم من cryostat (الشكل 1C).
   4. في الخطوات التالية ، احتفظ بالعلامة عند موضع الساعة السادسة للحفاظ على نفس الاتجاه ، مما قد يؤدي إلى الحصول على المزيد من أقسام عينة DRG.
      ملاحظة: إذا فقد الاتجاه وتم قطع عينة DRG بزاوية مختلفة ، فلا يمكن قطع عينة DRG بالكامل من أعلى إلى أسفل ، مما سيترك بعض العينات متروكة على قاعدة OCT وتضيع ، حيث سيتم مواجهة OCT الأساسي أثناء محاولة قطع عينة DRG (الشكل 1C).
6. إجراء تضمين OCT ل DRGs
   1. جفف أنسجة DRG قبل وضعها على OCT.
      1. قبل إضافة DRG إلى الكتلة ، تأكد من إزالة محلول السكروز / PBS بنسبة 30٪ حول العينة.
      2. جفف عينة DRG عن طريق وضعها على طبق بتري جاف (الشكل 2 أ) ونقلها من مكان إلى آخر مرتين أو ثلاث مرات باستخدام ملاقط جافة (الشكل 2 ب).
      3. جفف الملقط بمنديل خال من النسالة قبل نقل عينة DRG أخرى (الشكل 2C).
   2. ضع DRG الجاف على القاعدة OCT.
      1. باستخدام الملقط الجاف ، ضع DRG الجاف على قاعدة OCT عند موضع الساعة 12 (الشكل 1 د).
      2. احتفظ بما لا يقل عن 5 مم بين الحافة العلوية ل DRG والحافة العلوية للقاعدة OCT.
      3. ضع الجزء الظهري من DRG في موضع الساعة 12 والجزء البطني في موضع الساعة السادسة (الشكل 1D).
   3. قم بتضمين أنسجة DRG مع OCT.
      1. أضف المزيد من OCT لتغطية عينة DRG بأكملها في شكل دائري أو بيضاوي ، مع وجود DRG في المنتصف (الشكل 1E).
      2. تأكد من أن الحافة العلوية ل OCT تغطي DRG عند الحافة العلوية للقاعدة OCT (الشكل 1F) ، لأن هذا يسهل نقل القسم إلى الشريحة الزجاجية (الشكل 3 أ).
         ملاحظة: إذا كان غطاء OCT في منتصف OCT الأساسي ، فإن الحافة العلوية للقاعدة OCT ستسد الشريحة الزجاجية لتجميع القسم (الشكل 3B).
      3. قم بتجميد عينة الغطاء OCT و DRG عند -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أخرى (الشكل 1G). لا تقم بقص OCT حول عينة DRG.
      4. اقطع الجزء العلوي من الغطاء OCT بسمك 30 ميكرومتر حتى يصبح DRG مرئيا.

2. التقسيم بالتبريد ل DRG

1. قم بتغيير سمك مقطع cryostat إلى 12 ميكرومتر لقطع أقسام DRG على الشريحة (الشكل 1H).
2. أمسك قسم OCT في الأسفل بفرشاة رسم صغيرة مبردة إلى -20 درجة مئوية.
   ملاحظة: من المهم عدم قطع القسم بأكمله تماما ، ولكن ترك 1-3 مم غير مقطوع (الشكل 1I).
3. استخدم نهاية الملقط بدرجة حرارة الغرفة للمس الجزء السفلي (موضع الساعة السادسة) برفق من القسم بحيث يلتصق بسطح المنصة (الشكل 1J). هذا يمنع القسم من التقويس مرة أخرى في لفة ، مما يجعل من الصعب جمع القسم على الشريحة.
   ملاحظة: عندما يلتصق الجزء السفلي من القسم بسطح المنصة ، ولا يزال الجزء العلوي من القسم متصلا بالغطاء OCT ، يكون القسم في شكل مسطح (الشكل 1K) ، مما يسهل جمع القسم على الشريحة.
4. خذ شريحة زجاجية مشحونة (انظر جدول المواد) وضع الشريحة ببطء فوق القسم. بمجرد أن يبدأ القسم في الالتصاق بالشريحة ، اسحب الشريحة برفق للخلف (الشكل 1L).
5. اتبع نفس العملية للحصول على المزيد من أقسام DRG على الشريحة دون تداخل الأقسام (الشكل 1M). تأكد من عدم وضع قسم DRG جديد فوق OCT لقسم DRG آخر (الشكل 4) ، لأن هذا القسم لا يمكن أن يبقى جيدا على الشريحة ويمكن غسله أثناء عملية تلطيخ الكيمياء المناعية.

3. تلطيخ نيسل لقسم DRG على الشريحة الزجاجية

1. اغسل الأقسام لمدة 10 دقائق في PBS بالإضافة إلى 0.1٪ Triton X-10. ثم اغسل الأقسام مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني.
2. ضع بقعة 1: 300 Nissl (انظر جدول المواد) على الشريحة واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. اغسل القسم باستخدام PBS بالإضافة إلى 0.1٪ Triton X-100. ثم ، اغسل الأقسام مرتين باستخدام PBS لمدة 5 دقائق ، ثم لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
4. قم بتطبيق 4 ′،6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) فلوروماونت-G (انظر جدول المواد) لتغطية الأقسام بغطاء غطاء.

النتائج

جمعت الدراسة الحالية حوالي 16 قسما مستمرا وعالي الجودة DRG من ماوس واحد L4 DRG. كانت الأقسام التي تم الحصول عليها دون أي تشويه. يوضح الشكل 1 الإجراء خطوة بخطوة للتشريح بالتبريد. يوضح الشكل 2 إزالة السائل الزائد من أقسام الأنسجة. يتم تسليط الضوء على عملية تضمين OCT ل?...

Discussion

يوفر هذا البروتوكول إجراء سهلا خطوة بخطوة لتقسيم cryostat للماوس DRG للحصول على أقسام DRG عالية الجودة على الشرائح بشكل موثوق. هناك أربع خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. أولا ، يجب أن تكون عينة DRG والملاقط جافة قبل وضع عينة DRG على OCT الأساسي. أي سائل يحيط بعينة DRG سيشكل قشرة جليدية حولها ، مما يؤدي إلى ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetize animal
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched	Fisherbrand	1910	Hold the OCT section at the bottom
Ergo Tweezers	Fisherbrand	S95310	Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	To collect the DRG section
Marking pens	Fisherbrand	133794	Mark the orientation of base OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisherbrand	23730571	Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).