إجراء للتشريح بالتبريد لجذر الجذر الظهري للفأر

Summary

يظهر هنا التطوير للحصول باستمرار على أقسام تبريد العقدة الجذرية الظهرية عالية الجودة.

Abstract

تعد أقسام العقدة الجذرية الظهرية للفأر (DRG) عالية الجودة ضرورية لتلطيخ الكيمياء المناعية المناسبة ودراسات RNAscope في البحث عن الألم الالتهابي والاعتلال العصبي والحكة بالإضافة إلى الحالات العصبية الطرفية الأخرى. ومع ذلك ، لا يزال من الصعب الحصول باستمرار على أقسام كريوستات عالية الجودة وسليمة ومسطحة على شرائح زجاجية بسبب حجم العينة الصغير لأنسجة DRG. حتى الآن ، لا توجد مقالة تصف البروتوكول الأمثل للتشريح بالتبريد DRG. يقدم هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لحل الصعوبات التي تواجهها بشكل متكرر والمرتبطة بالتقسيم بالتبريد DRG. تشرح المقالة المقدمة كيفية إزالة السائل المحيط من عينات أنسجة DRG ، ووضع أقسام DRG على الشريحة التي تواجه نفس الاتجاه ، وتسطيح الأقسام الموجودة على الشريحة الزجاجية دون التقويس. على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم تطويره للتشريح بالتبريد لعينات DRG ، إلا أنه يمكن تطبيقه على التشريح بالتبريد للعديد من الأنسجة الأخرى ذات حجم العينة الصغير.

Introduction

تحتوي العقدة الجذرية الظهرية (DRG) على الخلايا العصبية الحسية الأولية ، والبلاعم النسيجية ، والخلايا الساتلية التي تحيط بالخلايا العصبية الحسية الأولية¹،²،^3،4. إنه هيكل تشريحي رئيسي في معالجة الإشارات غير الضارة والضارة ، ويلعب أدوارا حاسمة في الألم والحكة واضطرابات الأعصاب الطرفية المختلفة⁵،⁶،⁷،⁸،⁹،^10،11،¹²

Protocol

بالنسبة للدراسة الحالية ، تمت الموافقة على التجارب على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو وتم إجراؤها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تم استخدام الفئران البالغة من العمر 8-12 أسبوعا C57BL / 6 من الذكور والإناث (المرباة في المنزل) هنا.

1. إعداد عينة DRG

1. تخدير الفئران بنسبة 2.5٪ Avertin (انظر جدول المواد). ضمان التخدير الكافي من خلال عدم الاستجابة للتحفيز المؤلم. قم بتغذية عبر القلب بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) متبوعا ب 4٪ فورمالديهايد ، كما هو موضح سابقا¹⁴،^15،

النتائج

جمعت الدراسة الحالية حوالي 16 قسما مستمرا وعالي الجودة DRG من ماوس واحد L4 DRG. كانت الأقسام التي تم الحصول عليها دون أي تشويه. يوضح الشكل 1 الإجراء خطوة بخطوة للتشريح بالتبريد. يوضح الشكل 2 إزالة السائل الزائد من أقسام الأنسجة. يتم تسليط الضوء على عملية تضمين OCT ل?.......

Discussion

يوفر هذا البروتوكول إجراء سهلا خطوة بخطوة لتقسيم cryostat للماوس DRG للحصول على أقسام DRG عالية الجودة على الشرائح بشكل موثوق. هناك أربع خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. أولا ، يجب أن تكون عينة DRG والملاقط جافة قبل وضع عينة DRG على OCT الأساسي. أي سائل يحيط بعينة DRG سيشكل قشرة جليدية حولها ، مما يؤدي إلى .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetize animal
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched	Fisherbrand	1910	Hold the OCT section at the bottom
Ergo Tweezers	Fisherbrand	S95310	Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	To collect the DRG section
Marking pens	Fisherbrand	133794	Mark the orientation of base OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisherbrand	23730571	Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).