Un procedimiento para la criosección de ganglios de la raíz dorsal de ratón

Resumen

Aquí se presenta el desarrollo para la adquisición consistente de secciones de criostato de ganglios de raíces dorsales de alta calidad.

Resumen

Las secciones de criostato de ganglios de la raíz dorsal (DRG) de ratón de alta calidad son cruciales para la tinción inmunoquímica adecuada y los estudios de ARNoscopio en la investigación del dolor inflamatorio y neuropático, la picazón y otras afecciones neurológicas periféricas. Sin embargo, sigue siendo un desafío obtener consistentemente secciones de criostato de alta calidad, intactas y planas en portaobjetos de vidrio debido al pequeño tamaño de la muestra del tejido DRG. Hasta el momento, no existe ningún artículo que describa un protocolo óptimo para la criosección de DRG. Este protocolo presenta un método paso a paso para resolver las dificultades frecuentes asociadas con la criosección de DRG. El artículo presentado explica cómo eliminar el líquido circundante de las muestras de tejido de DRG, colocar las secciones de DRG en el portaobjetos mirando hacia la misma orientación y aplanar las secciones en el portaobjetos de vidrio sin curvarse hacia arriba. Aunque este protocolo se ha desarrollado para la criosección de las muestras de DRG, se puede aplicar para la criosección de muchos otros tejidos con un tamaño de muestra pequeño.

Introducción

El ganglio de la raíz dorsal (DRG) contiene las neuronas sensoriales primarias, los macrófagos tisulares y las células satélite que rodean a las neuronas sensoriales primarias 1,2,3,4. Es una estructura anatómica clave en el procesamiento de señales inocuas y nocivas, y desempeña un papel fundamental en el dolor, la picazón y diversos trastornos de los nervios periféricos 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Aunque se han desarrollado varios métodos para diseccionar el tejido de DRG de la médula espinal del ratón^14,15,16, la criosección del tejido de DRG sigue siendo un desafío, ya que el tejido de DRG es bastante pequeño y las secciones de criostato de las muestras de DRG tienden a curvarse en rollos^, lo que dificulta la transferencia adecuada de las secciones de criostato a portaobjetos de vidrio. Sin embargo, la criosección adecuada del tejido DRG es crucial para los estudios de inmunohistoquímica y la estructura de las neuronas sensoriales DRG 17,18,19,20,21,22,23. Además, dado que los resultados de la secuenciación del ARN de una sola célula han revelado la notable heterogeneidad de las neuronas sensoriales DRG tanto en humanos²⁴ como en ratones²⁵, la criosección adecuada del tejido DRG es fundamental para investigar el papel funcional de diferentes células DRG en diversas condiciones fisiológicas y patológicas.

Aunque la técnica de limpieza de tejidos se ha aplicado para investigar la reconstrucción 3D del DRG²⁶ como una técnica alternativa de criosección del DRG, la técnica de limpieza de tejidos requiere tiempo y trabajo. En comparación, la criosección de la GRD es rápida y relativamente fácil de realizar, por lo que sigue siendo una técnica clave para los estudios de inmunohistoquímica y estructura de la GRD y otras regiones del sistema nervioso central. Sin embargo, la obtención de secciones de criostato de alta calidad, intactas y planas en portaobjetos de vidrio sigue siendo un desafío en la investigación neurocientífica debido al pequeño tamaño de la muestra de tejidos, como el DRG y ciertas regiones del cerebro, y no hay ningún artículo que describa el protocolo óptimo en este momento para crioseccionar muestras de tejido de pequeño tamaño, como los DRG de ratón.

Este protocolo proporciona una técnica fácil y paso a paso para el corte de criostato del DRG del ratón para obtener de manera confiable la mayor cantidad de secciones de DRG de alta calidad en los portaobjetos para estudios posteriores de DRG. Si bien está diseñada específicamente para crioseccionar muestras de DRG, esta técnica puede usarse potencialmente para crioseccionar otros tejidos con un tamaño de muestra pequeño.

Protocolo

Para el presente estudio, los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la UCSF y se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Aquí se utilizaron ratones machos y hembras C57BL/6 adultos de 8 a 12 semanas de edad (criados en casa).

1. Preparación de la muestra de DRG

1. Anestesiar a los ratones con avertina al 2,5% (ver Tabla de Materiales). Asegurar una anestesia adecuada por la falta de respuesta a la estimulación dolorosa. Perfundir a los animales por vía transcárdica con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x seguida de formaldehído al 4%, como se describió anteriormente^14,15,16.
2. Diseccionar el tejido DRG de la médula espinal, como se describió anteriormente^14,15,16.
3. Fijar posteriormente los GRD disecados en formaldehído al 4% durante 3 h a temperatura ambiente.
4. Poner los GRD en sacarosa al 30% en PBS a 4 °C durante la noche.
5. Preparación de la temperatura óptima de corte de la base (OCT)
   1. Agregue el compuesto OCT (consulte la Tabla de materiales) para cubrir la superficie superior del bloque de aluminio y congele a -20 °C durante 5-10 minutos (Figura 1A).
   2. Corte la parte superior de la OCT con el criostato (ver Tabla de Materiales) a 30 μm de espesor hasta que su superficie sea plana como la OCT base (Figura 1B).
   3. Haga una marca en la parte inferior (posición de las seis en punto) de la OCT base para marcar su orientación, antes de quitar el bloque de aluminio del criostato (Figura 1C).
   4. En los siguientes pasos, mantenga la marca en la posición de las seis en punto para mantener la misma orientación, lo que puede llevar a obtener más secciones de la muestra de DRG.
      NOTA: Si se pierde la orientación y la muestra de DRG se corta en un ángulo diferente, la muestra de DRG no se puede cortar completamente de arriba a abajo, lo que dejará algunas muestras en la OCT base y se desperdiciarán, ya que la OCT base se encontrará al intentar cortar la muestra de DRG (Figura 1C).
6. Realización de la incrustación de OCT de DRG
   1. Seque el pañuelo DRG antes de colocarlo en la OCT.
      1. Antes de agregar el DRG al bloque, asegúrese de eliminar la solución de sacarosa/PBS al 30% alrededor de la muestra.
      2. Seque la muestra de DRG colocándola en una placa de Petri seca (Figura 2A) y moviéndola de un lugar a otro dos o tres veces con pinzas secas (Figura 2B).
      3. Seque las pinzas con un pañuelo sin pelusa antes de mover otra muestra de DRG (Figura 2C).
   2. Coloque el DRG seco en la OCT base.
      1. Con pinzas secas, coloque el DRG seco en la OCT base en la posición de las 12 en punto (Figura 1D).
      2. Mantenga al menos 5 mm entre el borde superior del DRG y el borde superior de la OCT base.
      3. Coloque la parte dorsal del GRD en la posición de las 12 en punto y la parte ventral en la posición de las seis en punto (Figura 1D).
   3. Incruste el tejido DRG con OCT.
      1. Agregue más OCT para cubrir toda la muestra de DRG en forma redonda u ovalada, con el DRG en el centro (Figura 1E).
      2. Asegúrese de que el borde superior de la OCT cubra el DRG en el borde superior de la OCT base (Figura 1F), ya que esto facilita la transferencia de la sección al portaobjetos de vidrio (Figura 3A).
         NOTA: Si la OCT de cubierta está en el medio de la OCT base, el borde superior de la OCT base bloqueará el portaobjetos de vidrio para recoger la sección (Figura 3B).
      3. Congele la muestra de OCT y DRG de la cubierta a -20 °C durante otros 5 minutos (Figura 1G). No recorte la OCT alrededor de la muestra de DRG.
      4. Corte la parte superior de la OCT de la cubierta con un grosor de 30 μm hasta que el DRG sea visible.

2. Crioseccionamiento del GRD

1. Cambie el grosor de la sección del criostato a 12 μm para cortar secciones de DRG en el portaobjetos (Figura 1H).
2. Sujete la sección OCT en la parte inferior con un pincel pequeño enfriado a -20 °C.
   NOTA: Es importante no cortar toda la sección por completo, sino dejar 1-3 mm sin cortar (Figura 1I).
3. Use el extremo de una pinza a temperatura ambiente para tocar suavemente la parte inferior (posición de las seis en punto) de la sección para que se adhiera a la superficie de la plataforma (Figura 1J). Esto evita que la sección se curve hacia atrás en un rollo, lo que dificulta la recogida de la sección en el portaobjetos.
   NOTA: Cuando la parte inferior de la sección se adhiere a la superficie de la plataforma, y la parte superior de la sección aún se conecta con el OCT de la cubierta, la sección tiene una forma plana (Figura 1K), lo que facilita mucho la recolección de la sección en el portaobjetos.
4. Tome un portaobjetos de vidrio cargado (consulte la Tabla de materiales) y coloque lentamente el portaobjetos sobre la sección. Tan pronto como la sección comience a pegarse a la guía, tire suavemente de la guía hacia atrás (Figura 1L).
5. Siga el mismo proceso para colocar más secciones de DRG en la diapositiva sin superponer las secciones (Figura 1M). Asegúrese de que no se coloque una nueva sección de DRG sobre la OCT de otra sección de DRG (Figura 4), ya que dicha sección no puede permanecer bien en el portaobjetos y puede lavarse durante el proceso de tinción inmunoquímica.

3. Tinción Nissl de la sección DRG en el portaobjetos de vidrio

1. Lavar las secciones durante 10 min en PBS más 0,1% Triton X-10. Luego, lave las secciones dos veces con PBS.
2. Aplique un tinte de Nissl 1:300 (consulte la Tabla de materiales) al portaobjetos e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.
3. Lave la sección con PBS más 0.1% Triton X-100. Luego, lave las secciones dos veces con PBS durante 5 minutos y luego durante 2 h a temperatura ambiente.
4. Aplique 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) fluoromount-G (ver Tabla de Materiales) para cubrir las secciones con un cubreobjetos.

Resultados

El estudio actual recolectó alrededor de 16 secciones de DRG continuas y de alta calidad de un DRG L4 de ratón. Las secciones obtenidas no tenían ninguna distorsión. La Figura 1 muestra el procedimiento paso a paso para la criosección. La eliminación del exceso de líquido de las secciones de tejido se muestra en la Figura 2. El proceso de inclusión de los tejidos por OCT se destaca en la Figura 3. La Fig...

Discusión

Este protocolo proporciona un procedimiento sencillo paso a paso para el seccionamiento por criostato del DRG del ratón para obtener secciones de DRG de alta calidad en portaobjetos de forma fiable. Hay cuatro pasos críticos en este protocolo. Primero, la muestra de DRG y las pinzas deben estar secas antes de colocar la muestra de DRG en la OCT base. Cualquier líquido que rodee la muestra de DRG formará una capa de hielo a su alrededor, lo que hará que las secciones de DRG se separen de la OCT y se curven hacia arri...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetize animal
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched	Fisherbrand	1910	Hold the OCT section at the bottom
Ergo Tweezers	Fisherbrand	S95310	Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	To collect the DRG section
Marking pens	Fisherbrand	133794	Mark the orientation of base OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisherbrand	23730571	Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).