Процедура криосекции ганглия заднего корешка мыши

Резюме

Здесь представлена разработка для стабильного получения высококачественных срезов криостата ганглия заднего корешка.

Аннотация

Высококачественные криостатные срезы ганглия заднего корешка мыши (DRG) имеют решающее значение для правильного иммунохимического окрашивания и РНК-скопических исследований при исследовании воспалительной и нейропатической боли, зуда, а также других периферических неврологических состояний. Тем не менее, по-прежнему остается сложной задачей получение высококачественных, неповрежденных и плоских срезов криостата на предметных стеклах из-за крошечного размера образца ткани DRG. До сих пор нет статьи, описывающей оптимальный протокол криосекции DRG. Данный протокол представляет собой пошаговый метод разрешения часто встречающихся трудностей, связанных с криосекционированием DRG. В представленной статье объясняется, как удалить окружающую жидкость из образцов тканей DRG, разместить секции DRG на предметном стекле, обращенные к одной и той же ориентации, и сплющить срезы на предметном стекле, не искривляя его. Несмотря на то, что этот протокол был разработан для криосекции образцов DRG, он может быть применен для криосекции многих других тканей с небольшим размером образца.

Введение

Ганглий дорсального корешка (DRG) содержит первичные сенсорные нейроны, тканевые макрофаги и клетки-сателлиты, которые окружают первичные сенсорные нейроны 1,2,3,4. Он является ключевой анатомической структурой в обработке безобидных и вредных сигналов и играет решающую роль в боли, зуде и различных заболеваниях периферических нервов 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Несмотря на то, что было разработано несколько методов для препарирования ткани DRG из спинного мозга мыши^14,15,16, криосекция ткани DRG остается сложной задачей, поскольку ткань DRG довольно мала, а криостатные срезы образцов DRG имеют тенденцию изгибаться в рулоны^, что затрудняет правильный перенос срезов криостата на предметные стекла. Тем не менее, правильное криосекционирование ткани DRG имеет решающее значение для иммуногистохимических исследований и структуры сенсорных нейронов DRG 17,18,19,20,21,22,23. Более того, поскольку результаты секвенирования одноклеточной РНК выявили замечательную гетерогенность сенсорных нейронов DRG как у людей²⁴, так и у мышей²⁵, правильное криосекционирование ткани DRG имеет решающее значение для изучения функциональной роли различных DRG-клеток в различных физиологических и патологических состояниях.

Несмотря на то, что метод очистки тканей был применен для исследования 3D-реконструкции DRG²⁶ в качестве альтернативного метода криосекции DRG, метод очистки тканей является трудоемким и трудоемким. Для сравнения, криосекция DRG выполняется быстро и относительно легко, и, таким образом, она остается ключевым методом иммуногистохимии и структурных исследований DRG и других областей центральной нервной системы. Тем не менее, получение высококачественных, неповрежденных и плоских криостатных срезов на предметных стеклах остается проблемой в исследованиях в области неврологии из-за крошечного размера выборки тканей, таких как DRG и определенные области мозга, и на данный момент нет статьи, описывающей оптимальный протокол для криосекции образцов тканей небольшого размера, таких как мышиные DRG.

Этот протокол обеспечивает простую, пошаговую технику криостатного секционирования DRG мыши, чтобы надежно получить как можно больше высококачественных срезов DRG на предметных стеклах для последующих исследований DRG. Несмотря на то, что этот метод специально разработан для криосекции образцов DRG, он потенциально может быть использован для криосекции различных других тканей с небольшим размером образца.

протокол

Для настоящего исследования эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию UCSF и проводились в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Здесь использовали взрослых 8-12-недельных самцов и самок мышей C57BL/6 (собственного выведения).

1. Подготовка проб DRG

1. Обезболивайте мышей 2,5% Авертином (см. таблицу материалов). Обеспечьте адекватную анестезию отсутствием реакции на болевую стимуляцию. Транскардиально проводят животным 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) с последующим введением 4% формальдегида, как описано ранее ^14,15,16.
2. Рассекают ткань ДРГ из спинного мозга, как описано ранее 14,15,16.
3. После закрепления рассеченных ДРГ в 4% формальдегиде в течение 3 ч при комнатной температуре.
4. Поместите DRG в 30% сахарозу в PBS при температуре 4 °C на ночь.
5. Подготовка базовой оптимальной температуры резания (OCT)
   1. Добавьте компаунд OCT (см. Таблицу материалов), чтобы покрыть верхнюю поверхность алюминиевого блока, и заморозьте при -20 °C в течение 5-10 минут (Рисунок 1A).
   2. Отрежьте верхнюю часть ОКТ с помощью криостата (см. Таблицу материалов) толщиной 30 мкм до тех пор, пока его поверхность не станет плоской, как у базового ОКТ (Рисунок 1B).
   3. Сделайте отметку в нижней части (положение «шесть часов») базового ОКТ, чтобы отметить его ориентацию, прежде чем снимать алюминиевый блок с криостата (рис. 1C).
   4. На следующих шагах удерживайте метку в положении «шесть часов», чтобы сохранить ту же ориентацию, что может привести к получению большего количества срезов образца DRG.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ориентация потеряна и образец DRG разрезается под другим углом, образец DRG не может быть разрезан полностью сверху вниз, что приведет к тому, что некоторые образцы останутся на базовом ОКТ и будут потрачены впустую, так как базовая ОКТ будет встречена при попытке разрезать образец DRG (Рисунок 1C).
6. Выполнение встраивания ДРГ методом ОСТ
   1. Высушите ткань DRG перед тем, как положить ее на ОКТ.
      1. Перед добавлением DRG в блок убедитесь, что 30% раствор сахарозы/PBS вокруг образца удален.
      2. Высушите образец DRG, поместив его на сухую чашку Петри (рис. 2A) и переместив его из одного места в другое два или три раза сухим пинцетом (рис. 2B).
      3. Высушите пинцет безворсовой тканью, прежде чем перемещать другой образец DRG (Рисунок 2C).
   2. Положите сухую ДРГ на базовый ОКТ.
      1. Сухим пинцетом поместите сухой DRG на основание OCT в положении «12 часов» (рис. 1D).
      2. Держите не менее 5 мм между верхним краем DRG и верхним краем базового OCT.
      3. Поставьте дорсальную часть ДРГ в положение «12 часов», а брюшную — в положение «шесть часов» (рис. 1D).
   3. Внедрите ткань DRG с помощью ОКТ.
      1. Добавьте больше ОКТ, чтобы покрыть весь образец DRG круглой или овальной формы с DRG в центре (рис. 1E).
      2. Убедитесь, что верхний край ОКТ перекрывает ДРГ на верхнем крае базового ОКТ (Рисунок 1F), так как это облегчает перенос секции на предметное стекло (Рисунок 3A).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если ОКТ крышки находится в середине базового ОКТ, верхний край базового ОКТ будет блокировать предметное стекло для сбора секции (Рисунок 3B).
      3. Заморозьте крышку образца ОКТ и ДРГ при температуре -20 °C еще на 5 мин (рис. 1G). Не обрезайте ОКТ вокруг образца DRG.
      4. Срежьте верхнюю часть крышки OCT толщиной 30 мкм до тех пор, пока DRG не станет видна.

2. Криосекционирование ДРГ

1. Измените толщину секции криостата на 12 мкм, чтобы вырезать секции DRG на предметном стекле (Рисунок 1H).
2. Держите секцию ОКТ внизу маленькой кистью, охлажденной до -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не разрезать всю секцию полностью, а оставить 1-3 мм неразрезанным (Рисунок 1I).
3. С помощью пинцета комнатной температуры осторожно коснитесь нижней части секции (положение «шесть часов») так, чтобы она прилипла к поверхности платформы (рис. 1J). Это предотвращает обратное изгибание секции в рулоне, что затрудняет сбор секции на салазках.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда нижняя часть секции прилипает к поверхности платформы, а верхняя часть секции все еще соединяется с OCT крышки, секция имеет плоскую форму (Рисунок 1K), что значительно облегчает сбор секции на салазках.
4. Возьмите заряженное предметное стекло (см. Таблицу материалов) и медленно поместите предметное стекло на секцию. Как только секция начнет прилипать к направляющей, осторожно потяните затвор назад (Рисунок 1L).
5. Выполните тот же процесс, чтобы разместить на слайде больше секций DRG, не перекрывая секции (рис. 1M). Следите за тем, чтобы новый участок DRG не располагался поверх ОКТ другого участка DRG (рис. 4), так как такой участок не может хорошо держаться на предметном стекле и может быть смыт в процессе иммунохимического окрашивания.

3. Окрашивание по Нисслю секции DRG на предметном стекле

1. Промойте срезы в течение 10 мин в ПБС плюс 0,1% Triton X-10. Затем дважды промойте срезы ПБС.
2. Нанесите на предметное стекло морилку по Нисслю в масштабе 1:300 (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
3. Промойте срез препаратом PBS plus 0,1% Triton X-100. Затем дважды промыть срезы ПБС в течение 5 мин, а затем в течение 2 ч при комнатной температуре.
4. Нанесите 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) фторомаунт-G (см. Таблицу материалов) для покрытия срезов покровным покрытием.

Результаты

В текущем исследовании было собрано около 16 непрерывных, высококачественных срезов DRG от одной мыши L4 DRG. Полученные участки были без каких-либо искажений. На рисунке 1 изображена пошаговая процедура криосекции. Удаление лишней жидкости из срезов тканей показано на

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает простую пошаговую процедуру криостатного секционирования DRG мыши для надежного получения высококачественных DRG срезов на предметных стеклах. В этом протоколе есть четыре критически важных шага. Во-первых, образец DRG и пинцет должны быть сухими, прежде чем по?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetize animal
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched	Fisherbrand	1910	Hold the OCT section at the bottom
Ergo Tweezers	Fisherbrand	S95310	Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	To collect the DRG section
Marking pens	Fisherbrand	133794	Mark the orientation of base OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisherbrand	23730571	Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).