마우스 등쪽 뿌리 신경절 냉동 절제술을 위한 절차

요약

여기에 제시된 것은 고품질의 등뿌리 신경절 냉동 유지 장치 절편을 지속적으로 획득하기 위한 개발입니다.

초록

고품질 마우스 배근 신경절(DRG) 냉동 유지 장치 절편은 염증성 및 신경병증성 통증, 가려움증 및 기타 말초 신경학적 상태 연구에서 적절한 면역화학 염색 및 RNAscope 연구에 매우 중요합니다. 그러나 DRG 조직의 샘플 크기가 작기 때문에 유리 슬라이드에서 고품질의 온전하고 평평한 저온 유지 장치 절편을 일관되게 얻는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 지금까지 DRG 동결 절제술을 위한 최적의 프로토콜을 설명하는 논문은 없습니다. 이 프로토콜은 DRG 동결 절제술과 관련하여 자주 발생하는 어려움을 해결하기 위한 단계별 방법을 제시합니다. 제시된 기사에서는 DRG 조직 샘플에서 주변 액체를 제거하고, DRG 섹션을 동일한 방향을 향하도록 슬라이드에 배치하고, 유리 슬라이드의 섹션을 구부리지 않고 평평하게 만드는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 DRG 샘플의 냉동 절편을 위해 개발되었지만, 샘플 크기가 작은 다른 많은 조직의 냉동 절제에 적용할 수 있습니다.

서문

등뿌리신경절(dorsal root ganglion, DRG)은 일차 감각 뉴런, 조직 대식세포, 일차 감각 뉴런 1,2,3,4를 둘러싸고 있는 위성 세포를 포함합니다. 무해하고 유해한 신호를 처리하는 데 중요한 해부학적 구조이며 통증, 가려움증 및 다양한 말초 신경 장애 5,6,7,8,9,10,11,12,13에 중요한 역할을 합니다. 마우스 척수(^14,15,16)로부터 DRG 조직을 해부하기 위한 몇 가지 방법이 개발되었지만, DRG 조직이 매우 작고^, DRG 샘플의 냉동 유지 장치 절편이 롤로 구부러지는 경향이 있어 냉동 유지 장치 절편을 유리 슬라이드 상으로 적절하게 이송하는 것이 어렵기 때문에 DRG 조직의 동결 절제술은 여전히 어려운 과제로 남아 있다. 그러나 DRG 조직의 적절한 동결 절제는 면역조직화학 연구와 DRG 감각 뉴런 17,18,19,20,21,22,23의 구조에 매우 중요합니다. 더욱이, 단세포 RNA 염기서열분석 결과가 인간⁽²⁴)과 마우스(²⁵) 모두에서 DRG 감각 뉴런의 현저한 이질성을 밝혀냈기 때문에, DRG 조직의 적절한 동결절제는 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 상이한 DRG 세포의 기능적 역할을 조사하는 데 중요하다.

DRG 동결 절제술의 대체 기술로서 DRG²⁶ 의 3D 재구성을 조사하기 위해 조직 투명화 기술이 적용되었지만, 조직 투명화 기술은 시간과 노동력이 많이 소요됩니다. 이에 비해 DRG의 동결 절제술은 빠르고 비교적 쉽게 수행할 수 있으므로 DRG 및 중추 신경계의 다른 영역에 대한 면역조직화학 및 구조 연구의 핵심 기술로 남아 있습니다. 그러나 DRG 및 특정 뇌 영역과 같은 조직의 샘플 크기가 작기 때문에 유리 슬라이드에 고품질의 온전하고 평평한 냉동 유지 장치 절편을 얻는 것은 신경 과학 연구에서 여전히 어려운 과제로 남아 있으며, 현재 마우스 DRG와 같은 작은 조직 샘플을 동결 절제하기 위한 최적의 프로토콜을 설명하는 논문은 없습니다.

이 프로토콜은 마우스 DRG의 저온 유지 장치 절편을 위한 쉽고 단계적인 기술을 제공하여 후속 DRG 연구를 위해 슬라이드에서 고품질 DRG 절편을 최대한 많이 안정적으로 얻을 수 있습니다. DRG 시료를 동결 절제하기 위해 특별히 고안된 이 기법은 시료 크기가 작은 다양한 다른 조직을 동결 절제하는 데 잠재적으로 사용될 수 있습니다.

프로토콜

본 연구의 경우 동물 실험은 UCSF Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 수행되었습니다. 성체, 8-12주 된 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스(자체 사육)를 여기에 사용하였다.

1. DRG 시료 전처리

1. 2.5% 아베르틴으로 마우스를 마취합니다(재료 표 참조). 고통스러운 자극에 대한 반응 부족으로 적절한 마취를 보장합니다. 앞서 기술한^바와 같이 1x 인산염-완충 식염수(PBS)에 이어 4% 포름알데히드를 동물에 심 경관류한다 14,15,16.
2. 앞서 설명한 바와 같이 척수에서 DRG 조직을 절개합니다^14,15,16.
3. 해부된 DRG를 실온에서 3시간 동안 4% 포름알데히드에 사후 고정합니다.
4. DRG를 PBS의 30% 자당에 넣고 밤새 4°C에서 가열합니다.
5. 베이스 최적 절삭 온도(OCT) 준비
   1. OCT 화합물( 재료 표 참조)을 추가하여 알루미늄 블록의 상단 표면을 덮고 -20°C에서 5-10분 동안 얼립니다(그림 1A).
   2. 표면이 기본 OCT처럼 평평해질 때까지 30μm 두께의 저온 유지 장치( 재료 표 참조)를 사용하여 OCT의 상단을 잘라냅니다(그림 1B).
   3. 저온 유지 장치에서 알루미늄 블록을 제거하기 전에 기본 OCT의 하단(6시 위치)에 표시를 하여 방향을 표시합니다(그림 1C).
   4. 다음 단계에서는 동일한 방향을 유지하기 위해 표시를 6시 위치에 유지하여 DRG 샘플의 더 많은 섹션을 얻을 수 있습니다.
      참고: 방향이 손실되고 DRG 샘플이 다른 각도로 절단되면 DRG 샘플을 위에서 아래로 완전히 절단할 수 없으므로 DRG 샘플을 절단하려고 시도하는 동안 기본 OCT가 발생하기 때문에 일부 샘플이 기본 OCT에 남겨져 낭비됩니다(그림 1C).
6. DRG의 OCT 임베딩 수행
   1. OCT에 바르기 전에 DRG 조직을 건조시키십시오.
      1. DRG를 블록에 추가하기 전에 샘플 주변의 30% 자당/PBS 용액을 제거해야 합니다.
      2. DRG 샘플을 마른 페트리 접시에 놓고 마른 핀셋으로 한 위치에서 다른 위치로 두세 번 이동하여 건조시킵니다(그림 2B).
      3. 다른 DRG 샘플을 이동하기 전에 보푸라기가 없는 조직으로 핀셋을 건조시킵니다(그림 2C).
   2. 드라이 DRG를 베이스 OCT에 놓습니다.
      1. 마른 핀셋을 사용하여 마른 DRG를 12시 방향의 베이스 OCT에 놓습니다(그림 1D).
      2. DRG의 상단 가장자리와 베이스 OCT의 상단 가장자리 사이에 최소 5mm를 유지하십시오.
      3. DRG의 등쪽 부분을 12시 방향에, 복부 부분을 6시 방향에 놓습니다(그림 1D).
   3. OCT로 DRG 조직을 삽입합니다.
      1. OCT를 더 추가하여 DRG가 중앙에 오도록 전체 DRG 샘플을 원형 또는 타원형으로 덮습니다(그림 1E).
      2. OCT의 상단 가장자리가 베이스 OCT의 상단 가장자리에 있는 DRG를 덮도록 합니다(그림 1F). 이렇게 하면 섹션을 유리 슬라이드로 쉽게 옮길 수 있습니다(그림 3A).
         참고: 덮개 OCT가 베이스 OCT의 중간에 있는 경우 베이스 OCT의 위쪽 가장자리가 유리 슬라이드를 막아 섹션을 모을 수 있습니다(그림 3B).
      3. 덮개 OCT 및 DRG 샘플을 -20°C에서 5분 더 얼립니다(그림 1G). DRG 샘플 주위의 OCT를 트리밍하지 마십시오.
      4. DRG가 보일 때까지 30μm 두께로 덮개 OCT의 상단을 자릅니다.

2. DRG의 냉동 절편

1. 저온 유지 장치 섹션 두께를 12μm로 변경하여 DRG 섹션을 슬라이드로 절단합니다(그림 1H).
2. -20 °C로 냉각된 작은 붓으로 바닥의 OCT 섹션을 잡습니다.
   알림: 전체 섹션을 완전히 자르지 말고 1-3mm를 자르지 않은 상태로 두는 것이 중요합니다(그림 1I).
3. 실온 핀셋 끝을 사용하여 섹션의 바닥(6시 위치)을 부드럽게 터치하여 플랫폼 표면에 달라붙도록 합니다(그림 1J). 이렇게 하면 단면이 롤에서 뒤로 구부러지는 것을 방지하여 슬라이드에서 단면을 수집하기 어렵게 만듭니다.
   참고: 섹션의 하단이 플랫폼 표면에 달라붙고 섹션의 상단이 여전히 커버 OCT와 연결되면 섹션이 평평한 모양이 되므로(그림 1K) 슬라이드에서 섹션을 훨씬 쉽게 수집할 수 있습니다.
4. 충전된 유리 슬라이드( 재료 표 참조)를 가져다가 슬라이드를 섹션 위에 천천히 놓습니다. 섹션이 슬라이드에 달라붙기 시작하면 슬라이드를 뒤로 부드럽게 당깁니다(그림 1L).
5. 동일한 프로세스를 수행하여 섹션이 겹치지 않고 더 많은 DRG 섹션을 슬라이드에 가져옵니다(그림 1M). 새 DRG 절편이 다른 DRG 절편의 OCT 위에 놓이지 않도록 하십시오(그림 4).

3. 유리 슬라이드의 DRG 섹션의 Nissl 염색

1. PBS에 0.1% Triton X-10을 더한 상태에서 10분 동안 섹션을 세척합니다. 그런 다음 PBS로 섹션을 두 번 세척하십시오.
2. 슬라이드에 1:300 Nissl 염색( 재료 표 참조)을 바르고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
3. PBS 플러스 0.1% Triton X-100으로 섹션을 세척합니다. 그런 다음 PBS로 5분 동안 섹션을 두 번 세척한 다음 실온에서 2시간 동안 세척합니다.
4. 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) fluoromount-G( 재료 표 참조)를 적용하여 커버슬립으로 섹션을 덮습니다.

결과

이번 연구에서는 마우스 L4 DRG 한 마리에서 약 16개의 연속적인 고품질 DRG 절편을 수집했습니다. 얻어진 부분은 왜곡이 없었습니다. 그림 1 은 동결 절제술을 위한 단계별 절차를 보여줍니다. 조직 절편에서 여분의 액체를 제거하는 방법은 그림 2에 나와 있습니다. 조직의 OCT 포매 과정은 그림 3에 강조되어 있습니다.

토론

이 프로토콜은 마우스 DRG의 저온 유지 장치 절편을 위한 쉬운 단계별 절차를 제공하여 슬라이드에서 고품질 DRG 절편을 안정적으로 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜에는 네 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, DRG 샘플을 기본 OCT에 넣기 전에 DRG 샘플과 핀셋을 건조시켜야 합니다. DRG 샘플을 둘러싼 모든 액체는 그 주위에 얼음 껍질을 형성하여 DRG 섹션이 OCT에서 분리되고 위로 구부러집니다. 둘째, ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetize animal
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched	Fisherbrand	1910	Hold the OCT section at the bottom
Ergo Tweezers	Fisherbrand	S95310	Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	To collect the DRG section
Marking pens	Fisherbrand	133794	Mark the orientation of base OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisherbrand	23730571	Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).