Una procedura per la criosezione del ganglio della radice dorsale del topo

Riepilogo

Di seguito viene presentato lo sviluppo per l'acquisizione costante di sezioni criostatiche gangliari a radice dorsale di alta qualità.

Abstract

Le sezioni del criostato del ganglio della radice dorsale (DRG) di topo di alta qualità sono fondamentali per una corretta colorazione immunochimica e studi di RNAscope nella ricerca di dolore infiammatorio e neuropatico, prurito e altre condizioni neurologiche periferiche. Tuttavia, rimane una sfida ottenere costantemente sezioni di criostato di alta qualità, intatte e piatte su vetrini a causa delle minuscole dimensioni del campione del tessuto DRG. Finora, non esiste un articolo che descriva un protocollo ottimale per la criosezione DRG. Questo protocollo presenta un metodo passo-passo per risolvere le difficoltà frequentemente incontrate associate alla criosezione DRG. L'articolo presentato spiega come rimuovere il liquido circostante dai campioni di tessuto DRG, posizionare le sezioni DRG sul vetrino rivolte verso lo stesso orientamento e appiattire le sezioni sul vetrino senza curvare verso l'alto. Sebbene questo protocollo sia stato sviluppato per la criosezione dei campioni DRG, può essere applicato per la criosezione di molti altri tessuti con un campione di piccole dimensioni.

Introduzione

Il ganglio della radice dorsale (DRG) contiene i neuroni sensoriali primari, i macrofagi tissutali e le cellule satelliti che circondano i neuroni sensoriali primari 1,2,3,4. È una struttura anatomica chiave nell'elaborazione di segnali innocui e nocivi e svolge un ruolo critico nel dolore, nel prurito e in vari disturbi dei nervi periferici 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Sebbene siano stati sviluppati diversi metodi per sezionare il tessuto DRG dal midollo spinale del topo^14,15,16, la criosezione del tessuto DRG rimane impegnativa poiché il tessuto DRG è piuttosto piccolo e le sezioni del criostato dei campioni DRG tendono a curvarsi in rotoli^, rendendo difficile il trasferimento corretto delle sezioni del criostato sui vetrini. Tuttavia, una corretta criosezione del tessuto DRG è fondamentale per gli studi di immunoistochimica e la struttura dei neuroni sensoriali DRG 17,18,19,20,21,22,23. Inoltre, poiché i risultati del sequenziamento dell'RNA a singola cellula hanno rivelato la notevole eterogeneità dei neuroni sensoriali DRG sia nell'uomo²⁴ che nei topi²⁵, una corretta criosezione del tessuto DRG è fondamentale per studiare il ruolo funzionale di diverse cellule DRG in varie condizioni fisiologiche e patologiche.

Sebbene la tecnica di purificazione dei tessuti sia stata applicata per studiare la ricostruzione 3D del DRG²⁶ come tecnica alternativa di criosezione del DRG, la tecnica di purificazione dei tessuti richiede tempo e lavoro. In confronto, la criosezione del DRG è rapida e relativamente facile da eseguire, e quindi rimane una tecnica chiave per l'immunoistochimica e gli studi di struttura del DRG e di altre regioni del sistema nervoso centrale. Tuttavia, ottenere sezioni di criostato di alta qualità, intatte e piatte su vetrini rimane una sfida nella ricerca neuroscientifica a causa delle minuscole dimensioni del campione di tessuti, come il DRG e alcune regioni cerebrali, e non esiste un articolo che descriva il protocollo ottimale a questo punto per la criosezione di campioni di tessuto di piccole dimensioni, come i DRG di topo.

Questo protocollo fornisce una tecnica semplice e passo-passo per il sezionamento criostatico del DRG di topo per ottenere in modo affidabile il maggior numero di sezioni DRG di alta qualità sui vetrini per i successivi studi DRG. Sebbene sia stata progettata specificamente per la criosezione di campioni DRG, questa tecnica può potenzialmente essere utilizzata per la criosezione di vari altri tessuti con un campione di piccole dimensioni.

Protocollo

Per il presente studio, gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'UCSF e sono stati condotti in conformità con la Guida NIH per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. Qui sono stati utilizzati topi maschi e femmine adulti di 8-12 settimane C57BL/6 (allevati internamente).

1. Preparazione del campione DRG

1. Anestetizzare i topi con Avertin al 2,5% (vedi Tabella dei Materiali). Garantire un'anestesia adeguata in caso di mancata risposta alla stimolazione dolorosa. Perfondere gli animali per via transcardiaca con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) seguita da formaldeide al 4%, come descritto in precedenza^14,15,16.
2. Sezionare il tessuto DRG dal midollo spinale, come descritto in precedenza^14,15,16.
3. Post-fissare i DRG sezionati in formaldeide al 4% per 3 ore a temperatura ambiente.
4. Mettere i DRG in saccarosio al 30% in PBS a 4 °C per una notte.
5. Preparazione della temperatura di taglio ottimale di base (OCT)
   1. Aggiungere il composto OCT (vedere la tabella dei materiali) per coprire la superficie superiore del blocco di alluminio e congelare a -20 °C per 5-10 minuti (Figura 1A).
   2. Tagliare la parte superiore dell'OCT utilizzando il criostato (vedere la tabella dei materiali) a uno spessore di 30 μm fino a quando la sua superficie non è piatta come l'OCT di base (Figura 1B).
   3. Segnare nella parte inferiore (a ore sei) dell'OCT di base per segnarne l'orientamento, prima di togliere il blocco di alluminio dal criostato (Figura 1C).
   4. Nei passaggi successivi, mantenere il segno a ore sei per mantenere lo stesso orientamento, il che può portare a ottenere più sezioni del campione DRG.
      NOTA: Se l'orientamento viene perso e il campione DRG viene tagliato con un'angolazione diversa, il campione DRG non può essere tagliato completamente dall'alto verso il basso, il che lascerà alcuni campioni lasciati fuori sull'OCT di base e sprecati, poiché l'OCT di base si incontrerà durante il tentativo di tagliare il campione DRG (Figura 1C).
6. Esecuzione dell'incorporamento OCT di DRG
   1. Asciugare il tessuto DRG prima di metterlo sull'OCT.
      1. Prima di aggiungere il DRG al blocco, assicurarsi di rimuovere la soluzione di saccarosio/PBS al 30% intorno al campione.
      2. Asciugare il campione DRG posizionandolo su una capsula di Petri asciutta (Figura 2A) e spostandolo da una posizione all'altra due o tre volte con una pinzetta asciutta (Figura 2B).
      3. Asciugare le pinzette con un panno privo di lanugine prima di spostare un altro campione DRG (Figura 2C).
   2. Mettere il DRG asciutto sull'OCT di base.
      1. Con una pinzetta asciutta, posizionare il DRG asciutto sull'OCT di base a ore 12 (Figura 1D).
      2. Mantenere una distanza di almeno 5 mm tra il bordo superiore del DRG e il bordo superiore dell'OCT di base.
      3. Posizionare la parte dorsale del DRG a ore 12 e la parte ventrale a ore sei (Figura 1D).
   3. Incorporare il tessuto DRG con OCT.
      1. Aggiungere altro OCT per coprire l'intero campione DRG in una forma rotonda o ovale, con il DRG al centro (Figura 1E).
      2. Assicurarsi che il bordo superiore dell'OCT copra il DRG sul bordo superiore dell'OCT di base (Figura 1F), in quanto ciò facilita il trasferimento della sezione sul vetrino (Figura 3A).
         NOTA: Se l'OCT di copertura si trova al centro dell'OCT di base, il bordo superiore dell'OCT di base bloccherà il vetrino per raccogliere la sezione (Figura 3B).
      3. Congelare il campione OCT e DRG di copertura a -20 °C per altri 5 minuti (Figura 1G). Non tagliare l'OCT attorno al campione DRG.
      4. Tagliare la parte superiore del coperchio OCT a uno spessore di 30 μm fino a quando il DRG non è visibile.

2. Criosezione del DRG

1. Modificare lo spessore della sezione del criostato a 12 μm per tagliare le sezioni DRG sul vetrino (Figura 1H).
2. Tenere la sezione OCT in basso con un piccolo pennello raffreddato a -20 °C.
   NOTA: È importante non tagliare completamente l'intera sezione, ma lasciare 1-3 mm non tagliati (Figura 1I).
3. Utilizzare l'estremità di una pinzetta a temperatura ambiente per toccare delicatamente la parte inferiore (posizione a ore sei) della sezione in modo che aderisca alla superficie della piattaforma (Figura 1J). In questo modo si evita che la sezione si curvi all'indietro in un rotolo, il che rende difficile la raccolta della sezione sulla slitta.
   NOTA: Quando la parte inferiore della sezione aderisce alla superficie della piattaforma e la parte superiore della sezione si collega ancora con l'OCT di copertura, la sezione ha una forma piatta (Figura 1K), rendendo molto più facile la raccolta della sezione sulla diapositiva.
4. Prendi un vetrino di vetro caricato (vedi Tabella dei materiali) e posiziona lentamente il vetrino sulla sezione. Non appena la sezione inizia ad aderire alla slitta, tirare delicatamente la slitta all'indietro (Figura 1L).
5. Seguire la stessa procedura per ottenere più sezioni DRG sulla diapositiva senza sovrapporle (Figura 1M). Assicurarsi che una nuova sezione DRG non venga posizionata sopra l'OCT di un'altra sezione DRG (Figura 4), poiché tale sezione non può rimanere bene sul vetrino e può essere lavata via durante il processo di colorazione immunochimica.

3. Colorazione Nissl della sezione DRG sul vetrino

1. Lavare le sezioni per 10 minuti in PBS più Triton X-10 allo 0,1%. Quindi, lavare le sezioni due volte con PBS.
2. Applicare una colorazione Nissl 1:300 (vedi Tabella dei materiali) sul vetrino e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
3. Lavare la sezione con PBS più Triton X-100 allo 0,1%. Quindi, lavare le sezioni due volte con PBS per 5 minuti e poi per 2 ore a temperatura ambiente.
4. Applicare il fluoromount-G 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (vedi Tabella dei materiali) per coprire le sezioni con un vetrino coprioggetti.

Risultati

L'attuale studio ha raccolto circa 16 sezioni DRG continue e di alta qualità da un topo L4 DRG. Le sezioni ottenute erano prive di qualsiasi distorsione. La Figura 1 illustra la procedura passo-passo per la criosezione. La rimozione del liquido in eccesso dalle sezioni di tessuto è mostrata nella Figura 2. Il processo di incorporazione OCT dei tessuti è evidenziato nella Figura 3. La Figura 4 mostra ...

Discussione

Questo protocollo fornisce una semplice procedura passo-passo per il sezionamento del criostato del DRG del topo per ottenere sezioni DRG di alta qualità su vetrini in modo affidabile. Ci sono quattro passaggi critici in questo protocollo. Innanzitutto, il campione DRG e le pinzette devono essere asciutti prima di mettere il campione DRG sull'OCT di base. Qualsiasi liquido che circonda il campione DRG formerà un guscio di ghiaccio attorno ad esso, con il risultato che le sezioni DRG si separano dall'OCT e si curvono. I...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetize animal
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched	Fisherbrand	1910	Hold the OCT section at the bottom
Ergo Tweezers	Fisherbrand	S95310	Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	To collect the DRG section
Marking pens	Fisherbrand	133794	Mark the orientation of base OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisherbrand	23730571	Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).