Ein Verfahren zur Kryosektion von Spinalganglien der Maus

Zusammenfassung

Vorgestellt wird die Entwicklung zur konsequent hochwertigen Erfassung von Kryostatschnitten der Spinalganglien.

Zusammenfassung

Qualitativ hochwertige Kryostatschnitte des Spinalganglions (DRG) der Maus sind entscheidend für eine ordnungsgemäße immunchemische Färbung und RNAscope-Studien bei der Erforschung von entzündlichen und neuropathischen Schmerzen, Juckreiz sowie anderen peripheren neurologischen Erkrankungen. Aufgrund der winzigen Probengröße des DRG-Gewebes bleibt es jedoch eine Herausforderung, konsistent qualitativ hochwertige, intakte und flache Kryostatschnitte auf Glasobjektträgern zu erhalten. Bisher gibt es keinen Artikel, der ein optimales Protokoll für die DRG-Kryosektion beschreibt. Dieses Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Methode dar, um die häufig auftretenden Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der DRG-Kryosektion zu lösen. Der vorgestellte Artikel erklärt, wie man die umgebende Flüssigkeit aus den DRG-Gewebeproben entfernt, die DRG-Schnitte auf dem Objektträger mit der gleichen Ausrichtung platziert und die Abschnitte auf dem Glasobjektträger abflacht, ohne sich nach oben zu krümmen. Obwohl dieses Protokoll für die Kryosektion der DRG-Proben entwickelt wurde, kann es auch für die Kryosektion vieler anderer Gewebe mit einer kleinen Probengröße angewendet werden.

Einleitung

Das Spinalganglion (DRG) enthält die primären sensorischen Neuronen, die Gewebemakrophagen und die Satellitenzellen, die die primären sensorischen Neuronen umgeben 1,2,3,4. Es ist eine wichtige anatomische Struktur bei der Verarbeitung harmloser und schädlicher Signale und spielt eine entscheidende Rolle bei Schmerzen, Juckreiz und verschiedenen peripheren Nervenerkrankungen 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Obwohl mehrere Methoden entwickelt wurden, um DRG-Gewebe aus dem Rückenmark der Maus zu präparieren^14,15,16, bleibt die Kryosektion des DRG-Gewebes eine Herausforderung, da das DRG-Gewebe recht klein ist und Kryostatschnitte von DRG-Proben dazu neigen, sich zu Rollen zu krümmen, was es schwierig macht^, die Kryostatabschnitte richtig auf Glasobjektträger zu übertragen. Die richtige Kryosektion des DRG-Gewebes ist jedoch entscheidend für immunhistochemische Untersuchungen und die Struktur der DRG-sensorischen Neuronen 17,18,19,20,21,22,23. Da die Ergebnisse der Einzelzell-RNA-Sequenzierung die bemerkenswerte Heterogenität der DRG-sensorischen Neuronen sowohl bei Menschen²⁴ als auch bei Mäusen²⁵ gezeigt haben, ist die richtige Kryosektion von DRG-Gewebe entscheidend für die Untersuchung der funktionellen Rolle verschiedener DRG-Zellen unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen.

Obwohl die Tissue-Clearing-Technik angewendet wurde, um die 3D-Rekonstruktion des DRG²⁶ als alternative Technik der Kryosektion des DRG zu untersuchen, ist die Tissue-Clearing-Technik zeit- und arbeitsaufwändig. Im Vergleich dazu ist die Kryosektion des DRG schnell und relativ einfach durchzuführen und bleibt daher eine Schlüsseltechnik für Immunhistochemie und Strukturstudien des DRG und anderer Regionen des zentralen Nervensystems. Die Gewinnung qualitativ hochwertiger, intakter und flacher Kryostatschnitte auf Glasobjektträgern bleibt jedoch eine Herausforderung in der neurowissenschaftlichen Forschung, da die Probengröße von Geweben, wie dem DRG und bestimmten Hirnregionen, winzig ist, und es gibt derzeit keinen Artikel, der das optimale Protokoll für die Kryosektion kleiner Gewebeproben, wie z. B. Maus-DRGs, beschreibt.

Dieses Protokoll bietet eine einfache, Schritt-für-Schritt-Technik für die Kryostat-Sektion des Maus-DRG, um zuverlässig so viele hochwertige DRG-Schnitte auf den Objektträgern für nachfolgende DRG-Studien zu erhalten. Obwohl diese Technik speziell für die Kryosektion von DRG-Proben entwickelt wurde, kann sie möglicherweise auch für die Kryosektion verschiedener anderer Gewebe mit einer kleinen Probengröße verwendet werden.

Protokoll

Für die vorliegende Studie wurden die Tierversuche vom UCSF Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Hier wurden erwachsene, 8-12 Wochen alte männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (selbst gezüchtet) verwendet.

1. DRG-Probenvorbereitung

1. Betäuben Sie die Mäuse mit 2,5% Avertin (siehe Materialtabelle). Sorgen Sie für eine ausreichende Anästhesie, indem Sie nicht auf schmerzhafte Stimulation reagieren. Die Tiere werden transkardial mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefolgt von 4% Formaldehyd perfundiert, wie zuvor beschrieben^14,15,16.
2. DRG-Gewebe aus dem Rückenmark sezieren, wie zuvor beschrieben^14,15,16.
3. Die präparierten DRGs werden 3 h lang bei Raumtemperatur in 4%igem Formaldehyd nachfixiert.
4. Die DRGs werden über Nacht in 30%iger Saccharose in PBS bei 4 °C eingelegt.
5. Vorbereiten der optimalen Schnitttemperatur (OCT)
   1. Fügen Sie die OCT-Mischung (siehe Materialtabelle) hinzu, um die Oberseite des Aluminiumblocks zu bedecken, und frieren Sie sie bei -20 °C für 5-10 Minuten ein (Abbildung 1A).
   2. Schneiden Sie die Oberseite des OCT mit dem Kryostaten (siehe Materialtabelle) mit einer Dicke von 30 μm ab, bis seine Oberfläche flach ist wie das Basis-OCT (Abbildung 1B).
   3. Machen Sie eine Markierung an der Unterseite (Sechs-Uhr-Position) des Basis-OCT, um seine Ausrichtung zu markieren, bevor Sie den Aluminiumblock vom Kryostaten entfernen (Abbildung 1C).
   4. Halten Sie in den folgenden Schritten die Markierung auf der Sechs-Uhr-Position, um die gleiche Ausrichtung beizubehalten, was dazu führen kann, dass Sie mehr Abschnitte der DRG-Probe erhalten.
      HINWEIS: Wenn die Orientierung verloren geht und die DRG-Probe in einem anderen Winkel geschnitten wird, kann die DRG-Probe nicht vollständig von oben nach unten geschnitten werden, wodurch einige Proben auf dem Basis-OCT ausgelassen und verschwendet werden, da das Basis-OCT beim Versuch, das DRG-Sample zu schneiden, angetroffen wird (Abbildung 1C).
6. OCT-Einbettung von DRGs durchführen
   1. Trocknen Sie das DRG-Gewebe ab, bevor Sie es auf das OCT legen.
      1. Bevor Sie das DRG auf den Block geben, stellen Sie sicher, dass die 30%ige Saccharose/PBS-Lösung um die Probe herum entfernt wird.
      2. Trocknen Sie die DRG-Probe, indem Sie sie auf eine trockene Petrischale legen (Abbildung 2A) und zwei- oder dreimal mit einer trockenen Pinzette von einer Stelle zur anderen bewegen (Abbildung 2B).
      3. Trocknen Sie die Pinzette mit fusselfreiem Gewebe ab, bevor Sie eine weitere DRG-Probe bewegen (Abbildung 2C).
   2. Den trockenen DRG auf das Basis-OCT geben.
      1. Legen Sie das trockene DRG mit einer trockenen Pinzette auf das Basis-OCT an der 12-Uhr-Position (Abbildung 1D).
      2. Halten Sie mindestens 5 mm zwischen der Oberkante des DRG und der Oberkante des Basis-OCT.
      3. Legen Sie den dorsalen Teil des DRG auf die 12-Uhr-Position und den ventralen Teil auf die 6-Uhr-Position (Abbildung 1D).
   3. Betten Sie das DRG-Gewebe mit OCT ein.
      1. Fügen Sie weitere OCT hinzu, um die gesamte DRG-Probe in runder oder ovaler Form mit dem DRG in der Mitte abzudecken (Abbildung 1E).
      2. Achten Sie darauf, dass die Oberkante des OAT die DRG am oberen Rand des Basis-OAT bedeckt (Abbildung 1F), da dies die Übertragung des Schnitts auf den Objektträger erleichtert (Abbildung 3A).
         HINWEIS: Wenn sich das Deckel-OCT in der Mitte des Basis-OCT befindet, blockiert die Oberkante des Basis-OCT den Glasobjektträger, um den Abschnitt aufzufangen (Abbildung 3B).
      3. Die OCT- und DRG-Probe für weitere 5 Minuten bei -20 °C einfrieren (Abbildung 1G). Trimmen Sie das OAT nicht um die DRG-Probe herum.
      4. Schneiden Sie die Oberseite der Abdeckung OCT mit einer Dicke von 30 μm ab, bis das DRG sichtbar ist.

2. Kryosektion des DRG

1. Ändern Sie die Dicke des Kryostatabschnitts auf 12 μm, um DRG-Abschnitte auf den Objektträger zu schneiden (Abbildung 1H).
2. Halten Sie den OCT-Abschnitt mit einem kleinen Pinsel, der auf -20 °C abgekühlt ist, an der Unterseite.
   HINWEIS: Es ist wichtig, nicht den gesamten Abschnitt vollständig abzuschneiden, sondern 1-3 mm ungeschnitten zu lassen (Abbildung 1I).
3. Berühren Sie mit dem Ende einer Pinzette bei Raumtemperatur vorsichtig die Unterseite (Sechs-Uhr-Position) des Abschnitts, damit er an der Oberfläche der Plattform haftet (Abbildung 1J). Dadurch wird verhindert, dass sich der Abschnitt in einer Rolle nach hinten krümmt, was das Auffangen des Abschnitts auf dem Schlitten erschwert.
   HINWEIS: Wenn die Unterseite des Abschnitts an der Oberfläche der Plattform klebt und die Oberseite des Abschnitts noch mit dem Deckel-OCT verbunden ist, hat der Abschnitt eine flache Form (Abbildung 1K), was das Sammeln des Abschnitts auf der Rutsche erheblich erleichtert.
4. Nehmen Sie einen Objektträger aus geladenem Glas (siehe Materialtabelle) und legen Sie den Objektträger langsam über den Abschnitt. Sobald der Abschnitt anfängt, am Schlitten zu kleben, ziehen Sie den Schlitten vorsichtig nach hinten (Abbildung 1L).
5. Führen Sie den gleichen Vorgang aus, um mehr DRG-Abschnitte auf die Folie zu bringen, ohne die Abschnitte zu überlappen (Abbildung 1M). Stellen Sie sicher, dass ein neuer DRG-Abschnitt nicht über dem OCT eines anderen DRG-Abschnitts platziert wird (Abbildung 4), da ein solcher Abschnitt nicht gut auf dem Objektträger bleiben kann und während des immunchemischen Färbeprozesses weggespült werden kann.

3. Nissl-Färbung des DRG-Abschnitts auf dem Objektträger

1. Waschen Sie die Abschnitte 10 Minuten lang in PBS plus 0,1 % Triton X-10. Waschen Sie die Abschnitte dann zweimal mit PBS.
2. Tragen Sie eine Nissl-Färbung im Maßstab 1:300 (siehe Materialtabelle) auf den Objektträger auf und inkubieren Sie ihn 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
3. Waschen Sie den Abschnitt mit PBS plus 0,1 % Triton X-100. Waschen Sie die Abschnitte dann zweimal 5 Minuten lang mit PBS und dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur.
4. Tragen Sie 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Fluoromount-G auf (siehe Materialtabelle), um die Abschnitte mit einem Deckglas abzudecken.

Ergebnisse

In der aktuellen Studie wurden etwa 16 kontinuierliche, qualitativ hochwertige DRG-Schnitte von einem L4-DRG der Maus gesammelt. Die erhaltenen Schnitte waren ohne jegliche Verzerrung. Abbildung 1 zeigt die Schritt-für-Schritt-Vorgehensweise für die Kryoschnittung. Die Entfernung von überschüssiger Flüssigkeit aus den Gewebeschnitten ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Prozess der OCT-Einbettung des Gewebes ist in Abbildung 3 d...

Diskussion

Dieses Protokoll bietet ein einfaches Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Kryostat-Sektion des Maus-DRG, um zuverlässig qualitativ hochwertige DRG-Schnitte auf Objektträgern zu erhalten. Dieses Protokoll besteht aus vier kritischen Schritten. Zuerst müssen die DRG-Probe und die Pinzette trocken sein, bevor die DRG-Probe auf das Basis-OCT gelegt wird. Jede Flüssigkeit, die die DRG-Probe umgibt, bildet eine Eishülle um sie herum, was dazu führt, dass sich DRG-Abschnitte vom OCT lösen und nach oben krümmen. Zwei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetize animal
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched	Fisherbrand	1910	Hold the OCT section at the bottom
Ergo Tweezers	Fisherbrand	S95310	Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	To collect the DRG section
Marking pens	Fisherbrand	133794	Mark the orientation of base OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisherbrand	23730571	Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).