A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يصف هذا البروتوكول تقنية لصق المجهر الإلكتروني القابل للاستنساخ للكشف عن البروتينات الموسومة بالميتالوثيونين في الخلايا باستخدام تقنية جديدة لتخليق الجسيمات النانوية الذهبية القائمة على آلية قمع النوى الذاتية.
يعد تحليل التوطين الدقيق لجزيئات البروتين في الخلايا ذات الدقة الهيكلية الفائقة ذا أهمية كبيرة لدراسة العمليات الفسيولوجية أو المرضية المختلفة في جميع الكائنات الحية. لذلك ، فإن تطوير العلامات القابلة للاستنساخ التي يمكن استخدامها كمجسات مجهرية إلكترونية له قيمة كبيرة ، تماما كما لعبت البروتينات الفلورية دورا حاسما في مجال التصوير البصري. تم الكشف مؤخرا عن آلية قمع النوى الذاتية (ANSM) ، والتي تسمح بالتوليف المحدد لجسيمات الذهب النانوية (AuNPs) على العلامات الغنية بالسيستين ، مثل ميتالوثيونين (MT) والبروتين المضاد للتجمد (AFP).
استنادا إلى ANSM ، تم تطوير تقنية وضع العلامات المجهرية الإلكترونية ، والتي تتيح الكشف المحدد عن البروتينات الموسومة في الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة بكفاءة غير مسبوقة في وضع العلامات. توضح هذه الدراسة بروتوكولا للكشف عن بروتينات اندماج MTn (متغير MT مهندس يفتقر إلى بقايا الألدهيد التفاعلية) في خلايا الثدييات ذات البنية التحتية المحفوظة جيدا. في هذا البروتوكول ، تم إجراء التثبيت بالتجميد والتجميد بالضغط العالي باستخدام مثبتات غير الألدهيد (مثل حمض التانيك ، أسيتات اليورانيل) للحفاظ على البنية التحتية شبه الأصلية وتجنب تلف نشاط العلامة الناجم عن تشابك الألدهيد.
تم استخدام إماهة بسيطة من خطوة واحدة قبل تخليق AuNP القائم على ANSM. أظهرت النتائج أن البروتينات الموسومة استهدفت عضيات مختلفة ، بما في ذلك أغشية وتجويف الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، وتم الكشف عن مصفوفات الميتوكوندريا بكفاءة وخصوصية عالية. يوفر هذا البحث لعلماء الأحياء بروتوكولا قويا لمعالجة مجموعة هائلة من الأسئلة البيولوجية على مستوى الجزيء الواحد في السياقات الخلوية الفائقة.
في عصر ما بعد الجينوم ، أحدث تطوير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) كمراسل أحادي الجزيء للفحص المجهري الضوئي ثورة في مجال أبحاث علوم الحياة الحديثة 1,2. لعقود من الزمان ، كان المجهر الإلكتروني (EM) أداة قوية لمراقبة البنية الخلوية بشكل حدسي بدقةنانوية 3. ومع ذلك ، لا يزال التحديد الدقيق لجزيئات البروتين وتوطينها يمثل تحديا.
تقنية وضع العلامات EM الأكثر استخداما هي تقنية وضع العلامات المجهرية الإلكترونية المناعية (IEM) ، والتي تعتمد على تفاعل المستضد والجسم المضاد. ومع ذلك ، على الرغم من تطوير العديد من التقنيات في مجال وضع العلامات على IEM ، بما في ذلك التضمين ا....
جميع المستلزمات المستخدمة في هذه التجربة مدرجة في جدول المواد. يظهر سير العمل خطوة بخطوة للبروتوكول الحالي في الشكل 1.
1. زراعة الخلايا على أقراص الياقوت
تعد تقنية تخليق AuNP القائمة على ANSM أداة مفيدة للغاية لوضع العلامات والكشف عن البروتينات الموسومة ب MT باستخدام TEM26. للتحقق من متانتها في خلايا الثدييات ، تم إنشاء ثلاثة خطوط خلايا مستقرة تعبر عن EGFP-MTn-KDEL أو Ost4-EGFP-MTn أو Mito-acGFP-MTn في خلايا Hela. KDEL هو تسلسل احتفاظ / استرجاع للشبكة الإندوب.......
تقدم الدراسة هنا تقنية قوية لوضع العلامات EM قابلة للاستنساخ لتصور جزيء واحد لجزيئات البروتين داخل البيئة الخلوية بدقة فائقة الهيكلية. توفر AuNPs التي تم تصنيعها مباشرة على علامات غنية بالسيستين المشفرة وراثيا توطينا واضحا ودقيقا للبروتينات المستهدفة. تحافظ تقنية التجميد والتجميد بالضغط ا.......
ولا يعلن صاحب البلاغ عن أي تضارب في المصالح.
تم اشتقاق البروتوكول الموصوف هنا من المقالة التي نشرها Jiang et al. (2020). تم دعم هذا العمل بمنح من MOST (973 برنامجا رقم 2011CB812502 و 2014CB849902) وبدعم تمويلي من حكومة بلدية بكين.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
D-penicillamine | TCI | P0147 | |
Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
Foam cryobox | |||
Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
HEPES | sigma | H3375-500G | |
HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
Tweezers | Dumont | ||
Ultramictotome | Leica | FC7 | |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved