A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنية لصق المجهر الإلكتروني القابل للاستنساخ للكشف عن البروتينات الموسومة بالميتالوثيونين في الخلايا باستخدام تقنية جديدة لتخليق الجسيمات النانوية الذهبية القائمة على آلية قمع النوى الذاتية.

Abstract

يعد تحليل التوطين الدقيق لجزيئات البروتين في الخلايا ذات الدقة الهيكلية الفائقة ذا أهمية كبيرة لدراسة العمليات الفسيولوجية أو المرضية المختلفة في جميع الكائنات الحية. لذلك ، فإن تطوير العلامات القابلة للاستنساخ التي يمكن استخدامها كمجسات مجهرية إلكترونية له قيمة كبيرة ، تماما كما لعبت البروتينات الفلورية دورا حاسما في مجال التصوير البصري. تم الكشف مؤخرا عن آلية قمع النوى الذاتية (ANSM) ، والتي تسمح بالتوليف المحدد لجسيمات الذهب النانوية (AuNPs) على العلامات الغنية بالسيستين ، مثل ميتالوثيونين (MT) والبروتين المضاد للتجمد (AFP).

استنادا إلى ANSM ، تم تطوير تقنية وضع العلامات المجهرية الإلكترونية ، والتي تتيح الكشف المحدد عن البروتينات الموسومة في الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة بكفاءة غير مسبوقة في وضع العلامات. توضح هذه الدراسة بروتوكولا للكشف عن بروتينات اندماج MTn (متغير MT مهندس يفتقر إلى بقايا الألدهيد التفاعلية) في خلايا الثدييات ذات البنية التحتية المحفوظة جيدا. في هذا البروتوكول ، تم إجراء التثبيت بالتجميد والتجميد بالضغط العالي باستخدام مثبتات غير الألدهيد (مثل حمض التانيك ، أسيتات اليورانيل) للحفاظ على البنية التحتية شبه الأصلية وتجنب تلف نشاط العلامة الناجم عن تشابك الألدهيد.

تم استخدام إماهة بسيطة من خطوة واحدة قبل تخليق AuNP القائم على ANSM. أظهرت النتائج أن البروتينات الموسومة استهدفت عضيات مختلفة ، بما في ذلك أغشية وتجويف الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، وتم الكشف عن مصفوفات الميتوكوندريا بكفاءة وخصوصية عالية. يوفر هذا البحث لعلماء الأحياء بروتوكولا قويا لمعالجة مجموعة هائلة من الأسئلة البيولوجية على مستوى الجزيء الواحد في السياقات الخلوية الفائقة.

Introduction

في عصر ما بعد الجينوم ، أحدث تطوير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) كمراسل أحادي الجزيء للفحص المجهري الضوئي ثورة في مجال أبحاث علوم الحياة الحديثة 1,2. لعقود من الزمان ، كان المجهر الإلكتروني (EM) أداة قوية لمراقبة البنية الخلوية بشكل حدسي بدقةنانوية 3. ومع ذلك ، لا يزال التحديد الدقيق لجزيئات البروتين وتوطينها يمثل تحديا.

تقنية وضع العلامات EM الأكثر استخداما هي تقنية وضع العلامات المجهرية الإلكترونية المناعية (IEM) ، والتي تعتمد على تفاعل المستضد والجسم المضاد. ومع ذلك ، على الرغم من تطوير العديد من التقنيات في مجال وضع العلامات على IEM ، بما في ذلك التضمين ا....

Protocol

جميع المستلزمات المستخدمة في هذه التجربة مدرجة في جدول المواد. يظهر سير العمل خطوة بخطوة للبروتوكول الحالي في الشكل 1.

1. زراعة الخلايا على أقراص الياقوت

  1. انقل أقراص الياقوت 3 مم × 0.16 مم إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يحتوي على 1 مل من الإيثانول ، وقم بصوتنيكات في منظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق.
  2. احرق كل قرص ياقوتي في لهب مصباح كحولي حتى لا توجد رواسب مرئية على السطح.
    ملاحظة: من خلال الطريقة المذكورة أعلاه ، يمكن إعادة تدوير أقراص الياقوت عدة مرات.
  3. قم بتسمية جانب واحد من كل قرص ياقوتي برقم باستخدام قلم مقاوم للمذيبات (

النتائج

تعد تقنية تخليق AuNP القائمة على ANSM أداة مفيدة للغاية لوضع العلامات والكشف عن البروتينات الموسومة ب MT باستخدام TEM26. للتحقق من متانتها في خلايا الثدييات ، تم إنشاء ثلاثة خطوط خلايا مستقرة تعبر عن EGFP-MTn-KDEL أو Ost4-EGFP-MTn أو Mito-acGFP-MTn في خلايا Hela. KDEL هو تسلسل احتفاظ / استرجاع للشبكة الإندوب.......

Discussion

تقدم الدراسة هنا تقنية قوية لوضع العلامات EM قابلة للاستنساخ لتصور جزيء واحد لجزيئات البروتين داخل البيئة الخلوية بدقة فائقة الهيكلية. توفر AuNPs التي تم تصنيعها مباشرة على علامات غنية بالسيستين المشفرة وراثيا توطينا واضحا ودقيقا للبروتينات المستهدفة. تحافظ تقنية التجميد والتجميد بالضغط ا.......

Disclosures

ولا يعلن صاحب البلاغ عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم اشتقاق البروتوكول الموصوف هنا من المقالة التي نشرها Jiang et al. (2020). تم دعم هذا العمل بمنح من MOST (973 برنامجا رقم 2011CB812502 و 2014CB849902) وبدعم تمويلي من حكومة بلدية بكين.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrierBeijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
0.2 M HEPES bufferDissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5
1.5 mL MaxyClear snaplock microtubeAxygen ScientificMCT150C
2 mL polypropylene screw cap microtubesBiologix81-0204
200 mesh hexagonal copper gridTedpella incG200HEX
2-mercaptoethanolAmresco0482-250ML
35 mm cell culture dishesCorning430165
50 mL polypropylene centrifuge tubesCorning430928
AcetoneBeiijng Tong Guang Fine Chemicals Company31025
Automated freeze substitution machineLeicaAFS2
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPFBeijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicillamineTCIP0147
Dulbecco’s modified Eagle mediumGBICOC11965500BT
Fetal bovine serumGBICO10099-141C
Flat bottom embedding capsuleTedpella inc
Foam cryobox
Formvar 15/95 resinElectron Microscopy Sciences15800
HAuCl4Sigma4022-1G
HEPESsigma H3375-500G
HPF machineWohlwend HPF compact01
Methonal Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company12397
NaBH4Sigma480886-25G
OsO4Electron Microscopy Sciences19110
PBS-A bufferDissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4
Qualitative filter paper (medium speed)Beyotime BiotechnologyFFT08
Sapphire discsBeijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
Solvent resistant penElectron Microscopy Sciences62053-B
SPI-Pon 812 resinSPI Inc02659-AB
Transmission electron microscopyFEITecnai G2 spirit
Trypsin-EDTAGBICOC25200-056
TweezersDumont
UltramictotomeLeicaFC7
Uranyl acetateElectron Microscopy Sciences22400

References

  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
  2. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

194 AuNP EM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved