Direkte Synthese von EM-sichtbaren Gold-Nanopartikeln in Zellen zur Proteinlokalisierungsanalyse mit gut erhaltener Ultrastruktur

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine klonierbare elektronenmikroskopische Markierungstechnologie zum Nachweis von Metallothionein-markierten Proteinen in Zellen unter Verwendung einer neuartigen, auf dem Mechanismus der Autonukleationsunterdrückung basierenden Gold-Nanopartikel-Synthesetechnik.

Zusammenfassung

Die Analyse der präzisen Lokalisation von Proteinmolekülen in Zellen mit ultrastruktureller Auflösung ist von großer Bedeutung für die Untersuchung verschiedener physiologischer oder pathologischer Prozesse in allen lebenden Organismen. Daher ist die Entwicklung klonbarer Tags, die als elektronenmikroskopische Sonden verwendet werden können, von großem Wert, so wie fluoreszierende Proteine im Bereich der optischen Bildgebung eine entscheidende Rolle gespielt haben. Kürzlich wurde der Mechanismus zur Unterdrückung der Autonukleation (ANSM) aufgedeckt, der die spezifische Synthese von Goldnanopartikeln (AuNPs) auf Cystein-reichen Markern wie Metallothionein (MT) und Antifreeze Protein (AFP) ermöglicht.

Basierend auf dem ANSM wurde eine elektronenmikroskopische Markierungstechnologie entwickelt, die den spezifischen Nachweis von markierten Proteinen in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen mit einer bisher unerreichten Markierungseffizienz ermöglicht. Diese Studie veranschaulicht ein Protokoll für den Nachweis von MTn-Fusionsproteinen (einer technisch hergestellten MT-Variante, der aldehydreaktive Rückstände fehlen) in Säugetierzellen mit gut erhaltener Ultrastruktur. In diesem Protokoll wurden Hochdruckgefrieren und Gefriersubstitutionsfixierung unter Verwendung von Nicht-Aldehyd-Fixiermitteln (wie Gerbsäure, Uranylacetat) durchgeführt, um die nahezu native Ultrastruktur zu erhalten und eine Schädigung der Tag-Aktivität durch Aldehydvernetzung zu vermeiden.

Vor der ANSM-basierten AuNP-Synthese wurde eine einfache einstufige Rehydrierung durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die markierten Proteine auf verschiedene Organellen abzielten, einschließlich der Membranen und des Lumens des endoplasmatischen Retikulums (ER), und mitochondriale Matrizen wurden mit hoher Effizienz und Spezifität detektiert. Diese Forschung bietet Biologen ein robustes Protokoll, um eine enorme Bandbreite biologischer Fragestellungen auf Einzelmolekülebene in zellulären ultrastrukturellen Kontexten zu beantworten.

Einleitung

In der postgenomischen Ära hat die Entwicklung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) als Einzelmolekül-Reporter für die Lichtmikroskopie das Feld der modernen lebenswissenschaftlichen Forschung revolutioniert ^1,2. Die Elektronenmikroskopie (EM) ist seit Jahrzehnten ein leistungsfähiges Werkzeug zur intuitiven Beobachtung der zellulären Ultrastruktur mit nanoskaliger Auflösung³; Die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Proteinmolekülen bleibt jedoch eine Herausforderung.

Die am häufigsten verwendete EM-Markierungstechnik ist die Immunelektronenmikro....

Protokoll

Alle in diesem Experiment verwendeten Verbrauchsmaterialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Der Schritt-für-Schritt-Workflow des aktuellen Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Zellkultur auf Saphirscheiben

1. 3 mm x 0,16 mm große Saphirscheiben werden in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml Ethanol überführt und 10 Minuten lang in einem Ultraschallreiniger bescholten.
2. Brennen Sie jede Saphirscheibe in einer Alkohollampenflamme, bis keine sichtbaren Ablagerungen mehr auf der Oberfläche vorhanden sind.
   HINWEIS: Durch die obige Methode können ....

Diskussion

Die Studie stellt hier eine robuste klonierbare EM-Markierungstechnologie für die Einzelmolekül-Visualisierung von Proteinmolekülen in der zellulären Umgebung mit ultrastruktureller Auflösung vor. Die direkt synthetisierten AuNPs auf genetisch kodierten Cystein-reichen Tags ermöglichen eine eindeutige und präzise Lokalisierung der Zielproteine. Hochdruckgefrieren und Gefriersubstitutionstechnik erhalten die Ultrastruktur biologischer Proben hervorragend. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellt.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
0.2 M HEPES buffer			Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube	Axygen Scientific	MCT150C
2 mL polypropylene screw cap microtubes	Biologix	81-0204
200 mesh hexagonal copper grid	Tedpella inc	G200HEX
2-mercaptoethanol	Amresco	0482-250ML
35 mm cell culture dishes	Corning	430165
50 mL polypropylene centrifuge tubes	Corning	430928
Acetone	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	31025
Automated freeze substitution machine	Leica	AFS2
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF	Beijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicillamine	TCI	P0147
Dulbecco’s modified Eagle medium	GBICO	C11965500BT
Fetal bovine serum	GBICO	10099-141C
Flat bottom embedding capsule	Tedpella inc
Foam cryobox
Formvar 15/95 resin	Electron Microscopy Sciences	15800
HAuCl4	Sigma	4022-1G
HEPES	sigma	H3375-500G
HPF machine	Wohlwend	HPF compact01
Methonal	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	12397
NaBH4	Sigma	480886-25G
OsO4	Electron Microscopy Sciences	19110
PBS-A buffer			Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4
Qualitative filter paper (medium speed)	Beyotime Biotechnology	FFT08
Sapphire discs	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
Solvent resistant pen	Electron Microscopy Sciences	62053-B
SPI-Pon 812 resin	SPI Inc	02659-AB
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2 spirit
Trypsin-EDTA	GBICO	C25200-056
Tweezers	Dumont
Ultramictotome	Leica	FC7
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400