Síntesis directa de nanopartículas de oro EM-visibles en células para análisis de localización de proteínas con ultraestructura bien conservada

Resumen

El presente protocolo describe una tecnología de etiquetado de microscopía electrónica clonable para detectar proteínas marcadas con metalotioneína en células utilizando una nueva técnica de síntesis de nanopartículas de oro basada en el mecanismo de supresión de autonucleación.

Resumen

El análisis de la localización precisa de moléculas de proteínas en células con resolución ultraestructural es de gran importancia para el estudio de diversos procesos fisiológicos o patológicos en todos los organismos vivos. Por lo tanto, el desarrollo de etiquetas clonables que se pueden utilizar como sondas de microscopía electrónica es de gran valor, al igual que las proteínas fluorescentes han jugado un papel crucial en el campo de la imagen óptica. Recientemente se descubrió el mecanismo de supresión de autonucleación (ANSM), que permite la síntesis específica de nanopartículas de oro (AuNP) en etiquetas ricas en cisteína, como la metalotioneína (MT) y la proteína anticongelante (AFP).

Basado en el ANSM, se desarrolló una tecnología de etiquetado por microscopía electrónica, que permite la detección específica de proteínas marcadas en células procariotas y eucariotas con una eficiencia de etiquetado sin precedentes. Este estudio ilustra un protocolo para la detección de proteínas de fusión MTn (una variante de MT diseñada que carece de residuos reactivos al aldehído) en células de mamíferos con una ultraestructura bien conservada. En este protocolo, la congelación a alta presión y la fijación por congelación y sustitución por congelación se realizaron utilizando fijadores no aldehídos (como ácido tánico, acetato de uranilo) para preservar la ultraestructura casi nativa y evitar daños a la actividad de la etiqueta causada por la reticulación de aldehído.

Se utilizó una simple rehidratación de un solo paso antes de la síntesis de AuNP basada en ANSM. Los resultados mostraron que las proteínas marcadas se dirigieron a varios orgánulos, incluidas las membranas y la luz del retículo endoplásmico (RE), y las matrices mitocondriales se detectaron con alta eficiencia y especificidad. Esta investigación proporciona a los biólogos un protocolo robusto para abordar una enorme gama de cuestiones biológicas a nivel de molécula única en contextos ultraestructurales celulares.

Introducción

En la era postgenómica, el desarrollo de la proteína fluorescente verde (GFP) como reportero de una sola molécula para microscopía óptica ha revolucionado el campo de la investigación moderna en ciencias de la vida ^1,2. Durante décadas, la microscopía electrónica (EM) ha sido una herramienta poderosa para observar intuitivamente la ultraestructura celular con resolución a nanoescala³; Sin embargo, la identificación precisa y la localización de las moléculas de proteínas siguen siendo un desafío.

La técnica de marcado EM más utilizada es la técnica de marcado ....

Protocolo

Todos los suministros utilizados en este experimento se enumeran en la Tabla de materiales. El flujo de trabajo paso a paso del protocolo actual se muestra en la figura 1.

1. Cultivo celular en discos de zafiro

1. Transfiera discos de zafiro de 3 mm x 0,16 mm a un tubo centrífugo de 2 ml que contenga 1 ml de etanol y sanice en un limpiador ultrasónico durante 10 minutos.
2. Queme cada disco de zafiro en una llama de lámpara de alcohol hasta que no haya depósitos visibles en la superficie.
   NOTA: A través del método anterior, los discos de zafiro se pueden recicl....

Discusión

El estudio presenta aquí una robusta tecnología de etiquetado EM clonable para la visualización de moléculas de proteínas individuales dentro del entorno celular con resolución ultraestructural. Las AuNP sintetizadas directamente en etiquetas ricas en cisteína codificadas genéticamente proporcionan una localización inequívoca y precisa de las proteínas diana. La técnica de congelación a alta presión y la sustitución por congelación preservan excelentemente la ultraestructura de las muestras biológicas. E.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
0.2 M HEPES buffer			Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube	Axygen Scientific	MCT150C
2 mL polypropylene screw cap microtubes	Biologix	81-0204
200 mesh hexagonal copper grid	Tedpella inc	G200HEX
2-mercaptoethanol	Amresco	0482-250ML
35 mm cell culture dishes	Corning	430165
50 mL polypropylene centrifuge tubes	Corning	430928
Acetone	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	31025
Automated freeze substitution machine	Leica	AFS2
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF	Beijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicillamine	TCI	P0147
Dulbecco’s modified Eagle medium	GBICO	C11965500BT
Fetal bovine serum	GBICO	10099-141C
Flat bottom embedding capsule	Tedpella inc
Foam cryobox
Formvar 15/95 resin	Electron Microscopy Sciences	15800
HAuCl4	Sigma	4022-1G
HEPES	sigma	H3375-500G
HPF machine	Wohlwend	HPF compact01
Methonal	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	12397
NaBH4	Sigma	480886-25G
OsO4	Electron Microscopy Sciences	19110
PBS-A buffer			Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4
Qualitative filter paper (medium speed)	Beyotime Biotechnology	FFT08
Sapphire discs	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
Solvent resistant pen	Electron Microscopy Sciences	62053-B
SPI-Pon 812 resin	SPI Inc	02659-AB
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2 spirit
Trypsin-EDTA	GBICO	C25200-056
Tweezers	Dumont
Ultramictotome	Leica	FC7
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400