סינתזה ישירה של ננו-חלקיקי זהב גלויים EM בתאים לניתוח לוקליזציה של חלבונים עם מבנה אולטרה שמור היטב

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכנולוגיית תיוג מיקרוסקופיית אלקטרונים ניתנת לשיבוט לגילוי חלבונים מתויגים במתכות בתאים באמצעות טכניקת סינתזת ננו-חלקיקי זהב חדשנית המבוססת על מנגנון דיכוי אוטו-נוקלציה.

Abstract

ניתוח הלוקליזציה המדויקת של מולקולות חלבון בתאים בעלי רזולוציה אולטרה-מבנית הוא בעל משמעות רבה לחקר תהליכים פיזיולוגיים או פתולוגיים שונים בכל האורגניזמים החיים. לכן, הפיתוח של תגים ניתנים לשיבוט שיכולים לשמש כבדיקות מיקרוסקופיית אלקטרונים הוא בעל ערך רב, בדיוק כפי שחלבונים פלואורסצנטיים מילאו תפקיד מכריע בתחום הדימות האופטי. לאחרונה נחשף מנגנון דיכוי האוטונוקלציה (ANSM), המאפשר סינתזה ספציפית של ננו-חלקיקי זהב (AuNPs) על תגים עשירים בציסטאין, כגון מטלותיונין (MT) וחלבון נוגד קיפאון (AFP).

על בסיס ה-ANSM פותחה טכנולוגיית תיוג במיקרוסקופ אלקטרונים, המאפשרת זיהוי ספציפי של חלבונים מתויגים בתאים פרוקריוטים ואיקריוטים ביעילות תיוג חסרת תקדים. מחקר זה מדגים פרוטוקול לזיהוי חלבוני היתוך MTn (גרסה מהונדסת של MT החסרה שאריות אלדהיד-תגובתי) בתאי יונקים בעלי מבנה אולטרה-מבנה שמור היטב. בפרוטוקול זה, קיבוע הקפאה ותחליפי הקפאה בלחץ גבוה בוצע באמצעות קיבוע שאינו אלדהיד (כגון חומצה טאנית, אורניל אצטט) כדי לשמר מבנה אולטרה כמעט טבעי ולמנוע נזק לפעילות התג הנגרמת על ידי הצלבת אלדהיד.

התייבשות פשוטה בצעד אחד שימשה לפני סינתזת AuNP מבוססת ANSM. התוצאות הראו כי החלבונים המתויגים התמקדו באברונים שונים, כולל הממברנות והלומן של הרשתית האנדופלסמית (ER), ומטריצות מיטוכונדריאליות זוהו ביעילות וספציפיות גבוהות. מחקר זה מספק לביולוגים פרוטוקול חזק כדי לענות על מגוון עצום של שאלות ביולוגיות ברמת המולקולה הבודדת בהקשרים אולטרה-מבניים תאיים.

Introduction

בעידן הפוסט-גנומי, פיתוחו של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ככתב בעל מולקולה בודדת למיקרוסקופ אור חולל מהפכה בתחום המחקר המודרני במדעי החיים ^1,2. במשך עשרות שנים, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) היה כלי רב עוצמה להתבוננות אינטואיטיבית באולטרה-מבנה התאי ברזולוציה ננומטרית³; עם זאת, הזיהוי והלוקליזציה המדויקים של מולקולות חלבון נותרו מאתגרים.

טכניקת התיוג הנפוצה ביותר של קרינה אלקטרומגנטית היא טכניקת התיוג במיקרוסקופ אימונואלקטרונים (IEM), המבוססת על תגובת האנטיגן-נוגדנים. עם זאת, למרות שפותחו טכניקות רבות בתחום התיוג IEM, כולל הטבעה מראש של IEM והטבעה לאחר הטבעה של IEM....

Protocol

כל החומרים המשמשים בניסוי זה מפורטים בטבלת החומרים. זרימת העבודה שלב אחר שלב של הפרוטוקול הנוכחי מוצגת באיור 1.

1. תרבית תאים על דיסקיות ספיר

1. מעבירים דיסקיות ספיר בגודל 3 מ"מ x 0.16 מ"מ לצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל אתנול, ומשמיעים אותן בשואב על-קולי למשך 10 דקות.
2. צרוב כל דיסק ספיר בלהבת מנורת אלכוהול עד שאין משקעים נראים לעין על פני השטח.
   הערה: באמצעות השיטה לעיל, ניתן למחזר דיסקיות ספיר פעמים רבות.
3. תייגו צד אחד של כל דיסק ספיר במספר באמצעות עט עמיד בפני ממסים (איור 1A).
   הערה: עט הסימון שבו נעשה שימוש ....

תוצאות

טכניקת הסינתזה AuNP מבוססת ANSM היא כלי שימושי ביותר לתיוג וזיהוי חלבונים מתויגים MT עם TEM²⁶. כדי לאמת את חוסנו בתאי יונקים, נוצרו שלושה קווי תאים יציבים המבטאים EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn או Mito-acGFP-MTn בתאי הלה. KDEL הוא רצף שמירה/אחזור קנוני של רשתית אנדופלסמית C-terminal (ER), השומר על חלבון ההיתוך EGFP-MTn-.......

Discussion

המחקר מציג כאן טכנולוגיית תיוג EM חזקה הניתנת לשיבוט להדמיית מולקולות בודדות של מולקולות חלבון בסביבה התאית עם רזולוציה אולטרה-מבנית. AuNPs המסונתזים ישירות על תגים עשירים בציסטאין המקודדים גנטית מספקים לוקליזציה חד משמעית ומדויקת של חלבוני המטרה. טכניקת הקפאה והחלפת הקפאה בלחץ גבוה משמרת .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
0.2 M HEPES buffer			Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube	Axygen Scientific	MCT150C
2 mL polypropylene screw cap microtubes	Biologix	81-0204
200 mesh hexagonal copper grid	Tedpella inc	G200HEX
2-mercaptoethanol	Amresco	0482-250ML
35 mm cell culture dishes	Corning	430165
50 mL polypropylene centrifuge tubes	Corning	430928
Acetone	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	31025
Automated freeze substitution machine	Leica	AFS2
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF	Beijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicillamine	TCI	P0147
Dulbecco’s modified Eagle medium	GBICO	C11965500BT
Fetal bovine serum	GBICO	10099-141C
Flat bottom embedding capsule	Tedpella inc
Foam cryobox
Formvar 15/95 resin	Electron Microscopy Sciences	15800
HAuCl4	Sigma	4022-1G
HEPES	sigma	H3375-500G
HPF machine	Wohlwend	HPF compact01
Methonal	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	12397
NaBH4	Sigma	480886-25G
OsO4	Electron Microscopy Sciences	19110
PBS-A buffer			Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4
Qualitative filter paper (medium speed)	Beyotime Biotechnology	FFT08
Sapphire discs	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
Solvent resistant pen	Electron Microscopy Sciences	62053-B
SPI-Pon 812 resin	SPI Inc	02659-AB
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2 spirit
Trypsin-EDTA	GBICO	C25200-056
Tweezers	Dumont
Ultramictotome	Leica	FC7
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400