A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכנולוגיית תיוג מיקרוסקופיית אלקטרונים ניתנת לשיבוט לגילוי חלבונים מתויגים במתכות בתאים באמצעות טכניקת סינתזת ננו-חלקיקי זהב חדשנית המבוססת על מנגנון דיכוי אוטו-נוקלציה.
ניתוח הלוקליזציה המדויקת של מולקולות חלבון בתאים בעלי רזולוציה אולטרה-מבנית הוא בעל משמעות רבה לחקר תהליכים פיזיולוגיים או פתולוגיים שונים בכל האורגניזמים החיים. לכן, הפיתוח של תגים ניתנים לשיבוט שיכולים לשמש כבדיקות מיקרוסקופיית אלקטרונים הוא בעל ערך רב, בדיוק כפי שחלבונים פלואורסצנטיים מילאו תפקיד מכריע בתחום הדימות האופטי. לאחרונה נחשף מנגנון דיכוי האוטונוקלציה (ANSM), המאפשר סינתזה ספציפית של ננו-חלקיקי זהב (AuNPs) על תגים עשירים בציסטאין, כגון מטלותיונין (MT) וחלבון נוגד קיפאון (AFP).
על בסיס ה-ANSM פותחה טכנולוגיית תיוג במיקרוסקופ אלקטרונים, המאפשרת זיהוי ספציפי של חלבונים מתויגים בתאים פרוקריוטים ואיקריוטים ביעילות תיוג חסרת תקדים. מחקר זה מדגים פרוטוקול לזיהוי חלבוני היתוך MTn (גרסה מהונדסת של MT החסרה שאריות אלדהיד-תגובתי) בתאי יונקים בעלי מבנה אולטרה-מבנה שמור היטב. בפרוטוקול זה, קיבוע הקפאה ותחליפי הקפאה בלחץ גבוה בוצע באמצעות קיבוע שאינו אלדהיד (כגון חומצה טאנית, אורניל אצטט) כדי לשמר מבנה אולטרה כמעט טבעי ולמנוע נזק לפעילות התג הנגרמת על ידי הצלבת אלדהיד.
התייבשות פשוטה בצעד אחד שימשה לפני סינתזת AuNP מבוססת ANSM. התוצאות הראו כי החלבונים המתויגים התמקדו באברונים שונים, כולל הממברנות והלומן של הרשתית האנדופלסמית (ER), ומטריצות מיטוכונדריאליות זוהו ביעילות וספציפיות גבוהות. מחקר זה מספק לביולוגים פרוטוקול חזק כדי לענות על מגוון עצום של שאלות ביולוגיות ברמת המולקולה הבודדת בהקשרים אולטרה-מבניים תאיים.
בעידן הפוסט-גנומי, פיתוחו של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ככתב בעל מולקולה בודדת למיקרוסקופ אור חולל מהפכה בתחום המחקר המודרני במדעי החיים 1,2. במשך עשרות שנים, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) היה כלי רב עוצמה להתבוננות אינטואיטיבית באולטרה-מבנה התאי ברזולוציה ננומטרית3; עם זאת, הזיהוי והלוקליזציה המדויקים של מולקולות חלבון נותרו מאתגרים.
טכניקת התיוג הנפוצה ביותר של קרינה אלקטרומגנטית היא טכניקת התיוג במיקרוסקופ אימונואלקטרונים (IEM), המבוססת על תגובת האנטיגן-נוגדנים. עם זאת, למרות שפותחו טכניקות רבות בתחום התיוג IEM, כולל הטבעה מראש של IEM והטבעה לאחר הטבעה של IEM....
כל החומרים המשמשים בניסוי זה מפורטים בטבלת החומרים. זרימת העבודה שלב אחר שלב של הפרוטוקול הנוכחי מוצגת באיור 1.
1. תרבית תאים על דיסקיות ספיר
טכניקת הסינתזה AuNP מבוססת ANSM היא כלי שימושי ביותר לתיוג וזיהוי חלבונים מתויגים MT עם TEM26. כדי לאמת את חוסנו בתאי יונקים, נוצרו שלושה קווי תאים יציבים המבטאים EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn או Mito-acGFP-MTn בתאי הלה. KDEL הוא רצף שמירה/אחזור קנוני של רשתית אנדופלסמית C-terminal (ER), השומר על חלבון ההיתוך EGFP-MTn-.......
המחקר מציג כאן טכנולוגיית תיוג EM חזקה הניתנת לשיבוט להדמיית מולקולות בודדות של מולקולות חלבון בסביבה התאית עם רזולוציה אולטרה-מבנית. AuNPs המסונתזים ישירות על תגים עשירים בציסטאין המקודדים גנטית מספקים לוקליזציה חד משמעית ומדויקת של חלבוני המטרה. טכניקת הקפאה והחלפת הקפאה בלחץ גבוה משמרת .......
המחבר מצהיר כי אין ניגוד עניינים.
הפרוטוקול המתואר כאן נגזר מהמאמר שפורסם על ידי Jiang et al. (2020). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של MOST (973 תוכניות מס '2011CB812502 ו 2014CB849902) ועל ידי מימון תמיכה מהממשלה העירונית בייג'ינג.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
D-penicillamine | TCI | P0147 | |
Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
Foam cryobox | |||
Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
HEPES | sigma | H3375-500G | |
HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
Tweezers | Dumont | ||
Ultramictotome | Leica | FC7 | |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved