細胞内EM可視金ナノ粒子の直接合成によるタンパク質局在解析(英語)

要約

本プロトコルは、新規自己核生成抑制機構に基づく金ナノ粒子合成技術を用いて細胞内のメタロチオネインタグ付きタンパク質を検出するためのクローン可能な電子顕微鏡標識技術を記載する。

要約

細胞内のタンパク質分子の正確な局在を微細構造分解能で分析することは、すべての生物におけるさまざまな生理学的または病理学的プロセスの研究にとって非常に重要です。したがって、蛍光タンパク質が光イメージングの分野で重要な役割を果たしてきたように、電子顕微鏡プローブとして使用できるクローンタグの開発は大きな価値があります。最近、自己核生成抑制機構(ANSM)が明らかになり、メタロチオネイン(MT)や不凍タンパク質(AFP)などのシステインリッチタグ上の金ナノ粒子(AuNP)の特異的合成が可能になりました。

ANSMに基づいて、電子顕微鏡標識技術が開発され、前例のない標識効率で原核細胞および真核細胞内のタグ付きタンパク質の特異的検出が可能になりました。この研究は、微細構造が良好に保存されている哺乳類細胞におけるMTn(アルデヒド反応性残基を欠く改変されたMT変異体)融合タンパク質を検出するためのプロトコルを示しています。このプロトコルでは、非アルデヒド固定剤(タンニン酸、酢酸ウラニルなど)を使用して高圧凍結および凍結置換固定を行い、天然に近い微細構造を維持し、アルデヒド架橋によって引き起こされるタグ活性の損傷を回避しました。

ANSMベースのAuNP合成の前に、単純なワンステップ再水和を使用しました。その結果、タグ付きタンパク質は、小胞体(ER)の膜や内腔を含むさまざまな細胞小器官を標的とし、ミトコンドリアマトリックスが高効率かつ特異性で検出されたことが示されました。この研究は、生物学者に、細胞の微細構造の文脈における単一分子レベルでの膨大な範囲の生物学的問題に対処するための堅牢なプロトコルを提供します。

概要

ポストゲノム時代には、光学顕微鏡用の単一分子レポーターとしての緑色蛍光タンパク質(GFP)の開発は、現代の生命科学研究の分野に革命をもたらしました^1,2。何十年もの間、電子顕微鏡(EM)は、ナノスケールの分解能で細胞の微細構造を直感的に観察するための強力なツールでした³。しかし、タンパク質分子の正確な同定と局在化は依然として困難です。

最も一般的に使用されるEM標識技術は、抗原抗体反応に基づく免疫電子顕微鏡(IEM)標識技術です。しかし、IEMラベリングの分野では、プレエンベディングIEMやポストエンベディングIEM(樹脂切片または水和凍結切片上)など、多くの技術が開発されていますが、サンプル調製と抗体の品質に関連する低いラベディング効率(<10%)^4,5に悩まされています。これらの制限を克服するために、遺伝的にコード化されたタグの開発は大きな応用の可能性を秘めています。

近年、EMタグには主に2つのタイプが徹底的に調査されています。1つのタイプはDAB染色法であり、APEX2などのタグを利用して3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)を浸透親....

プロトコル

この実験で使用されたすべての消耗品は、 材料表に記載されています。現在のプロトコルの段階的なワークフローを 図1に示します。

1. サファイアディスク上での細胞培養

1. 3 mm x 0.16 mmのサファイアディスクをエタノール1 mLを含む2 mLの遠沈管に移し、超音波洗浄機で10分間超音波処理します。
2. 表面に目に見える堆積物がなくなるまで、各サファイアディスクをアルコールランプの炎で燃やします。
   注意: 上記の方法で、サファイアディスクは何度もリサイクルできます。
3. 各サファイアディスクの片面に、耐溶剤性ペンを使用して番号のラベルを付けます(図1A)。
   注意: 使用するマーカーペンは、マークの損失を防ぐために、事前にアセトンおよびメタノール溶剤に耐性があるかどうかを判断するためにテストする必要があります。
4. ラベルの付いたサファイアディスクを、ラベルの付いた面を上に向けて、35 mmの培養皿の底に置きます。
5. 細胞培養皿をサファイアディスクでUV光下で30分間滅菌します。
6. ピンセット(ラベル面を下に向けて)でサファイアディスクを裏返し、UV光の下でさらに30分間滅菌....

ディスカッション

本研究では、細胞環境内のタンパク質分子を微細構造分解能で1分子可視化するための堅牢なクローン性EM標識技術を紹介します。遺伝的にコードされたシステインリッチタグ上で直接合成されたAuNPは、標的タンパク質の明確で正確な局在化を提供します。高圧凍結および凍結置換技術は、生物学的サンプルの微細構造を良好に保存します。まとめると、ここで紹介するクローン型電子顕微鏡.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
0.2 M HEPES buffer			Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube	Axygen Scientific	MCT150C
2 mL polypropylene screw cap microtubes	Biologix	81-0204
200 mesh hexagonal copper grid	Tedpella inc	G200HEX
2-mercaptoethanol	Amresco	0482-250ML
35 mm cell culture dishes	Corning	430165
50 mL polypropylene centrifuge tubes	Corning	430928
Acetone	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	31025
Automated freeze substitution machine	Leica	AFS2
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF	Beijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicillamine	TCI	P0147
Dulbecco’s modified Eagle medium	GBICO	C11965500BT
Fetal bovine serum	GBICO	10099-141C
Flat bottom embedding capsule	Tedpella inc
Foam cryobox
Formvar 15/95 resin	Electron Microscopy Sciences	15800
HAuCl4	Sigma	4022-1G
HEPES	sigma	H3375-500G
HPF machine	Wohlwend	HPF compact01
Methonal	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	12397
NaBH4	Sigma	480886-25G
OsO4	Electron Microscopy Sciences	19110
PBS-A buffer			Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4
Qualitative filter paper (medium speed)	Beyotime Biotechnology	FFT08
Sapphire discs	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
Solvent resistant pen	Electron Microscopy Sciences	62053-B
SPI-Pon 812 resin	SPI Inc	02659-AB
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2 spirit
Trypsin-EDTA	GBICO	C25200-056
Tweezers	Dumont
Ultramictotome	Leica	FC7
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400