細胞内EM可視金ナノ粒子の直接合成によるタンパク質局在解析(英語)

要約

本プロトコルは、新規自己核生成抑制機構に基づく金ナノ粒子合成技術を用いて細胞内のメタロチオネインタグ付きタンパク質を検出するためのクローン可能な電子顕微鏡標識技術を記載する。

要約

細胞内のタンパク質分子の正確な局在を微細構造分解能で分析することは、すべての生物におけるさまざまな生理学的または病理学的プロセスの研究にとって非常に重要です。したがって、蛍光タンパク質が光イメージングの分野で重要な役割を果たしてきたように、電子顕微鏡プローブとして使用できるクローンタグの開発は大きな価値があります。最近、自己核生成抑制機構(ANSM)が明らかになり、メタロチオネイン(MT)や不凍タンパク質(AFP)などのシステインリッチタグ上の金ナノ粒子(AuNP)の特異的合成が可能になりました。

ANSMに基づいて、電子顕微鏡標識技術が開発され、前例のない標識効率で原核細胞および真核細胞内のタグ付きタンパク質の特異的検出が可能になりました。この研究は、微細構造が良好に保存されている哺乳類細胞におけるMTn(アルデヒド反応性残基を欠く改変されたMT変異体)融合タンパク質を検出するためのプロトコルを示しています。このプロトコルでは、非アルデヒド固定剤(タンニン酸、酢酸ウラニルなど)を使用して高圧凍結および凍結置換固定を行い、天然に近い微細構造を維持し、アルデヒド架橋によって引き起こされるタグ活性の損傷を回避しました。

ANSMベースのAuNP合成の前に、単純なワンステップ再水和を使用しました。その結果、タグ付きタンパク質は、小胞体(ER)の膜や内腔を含むさまざまな細胞小器官を標的とし、ミトコンドリアマトリックスが高効率かつ特異性で検出されたことが示されました。この研究は、生物学者に、細胞の微細構造の文脈における単一分子レベルでの膨大な範囲の生物学的問題に対処するための堅牢なプロトコルを提供します。

概要

ポストゲノム時代には、光学顕微鏡用の単一分子レポーターとしての緑色蛍光タンパク質(GFP)の開発は、現代の生命科学研究の分野に革命をもたらしました^1,2。何十年もの間、電子顕微鏡(EM)は、ナノスケールの分解能で細胞の微細構造を直感的に観察するための強力なツールでした³。しかし、タンパク質分子の正確な同定と局在化は依然として困難です。

最も一般的に使用されるEM標識技術は、抗原抗体反応に基づく免疫電子顕微鏡(IEM)標識技術です。しかし、IEMラベリングの分野では、プレエンベディングIEMやポストエンベディングIEM(樹脂切片または水和凍結切片上)など、多くの技術が開発されていますが、サンプル調製と抗体の品質に関連する低いラベディング効率(<10%)^4,5に悩まされています。これらの制限を克服するために、遺伝的にコード化されたタグの開発は大きな応用の可能性を秘めています。

近年、EMタグには主に2つのタイプが徹底的に調査されています。1つのタイプはDAB染色法であり、APEX2などのタグを利用して3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)を浸透親和性ポリマーに酸化し、EM可視化6,7,8,9,10,11,12を行います。細胞内領域の高存在量のタンパク質の標識は可能ですが、単一分子の計数には適していません。他のタイプは、フェリチン13やメタロチオネイン(MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26などの金属結合タンパク質を利用して、電子密度の高い金属堆積物を生成します。 EMの可視化のための現場。後者だけが、単一分子の視覚化とカウントの真の可能性を秘めています。フェリチンの分子サイズは、有望なタグとして使用するには大きすぎる(~450 kD)が、MTのサイズが小さい(~5 kD)ことと、20個のシステインを介してさまざまなイオンと結合する能力が大きな注目を集めています。いくつかのラボでは、Au⁺と直接インキュベートすることにより、精製されたMT融合タンパク質またはMT発現細胞を標識しようとしました。これらの試みは、MTタグが金イオンに結合して高コントラストシグナルを形成できることを最初に証明しましたが、細胞内の個々のタンパク質の効果的な同定を実際に達成したものはなく、広く適用できません14,15,16,17,18,19,20,21,22,23。

ANSMベースのAuNP合成技術は、システインリッチタグ(例えば、MT、MT変異体MTnおよびMTα、AFP)上に2〜6 nmサイズのAuNPをEM可視化用の電子密度の高い標識として直接合成することを含み、細胞におけるタンパク質標識および単一分子検出のための最初の信頼性が高く適用可能なアプローチです^24,25,26.単離されたタグ融合タンパク質上でのAuNPの特異的合成を可能にし、非固定または化学的に固定された原核生物(大腸菌)および真核生物(S.ポンベ)細胞で前例のない標識効率を達成しました。しかし、哺乳類細胞や組織などのより高度なシステムで同じプロトコルを実装するには、より複雑な細胞内酸化還元恒常性やより脆弱な細胞構造など、追加の課題が伴います。

この研究では、遺伝的にコードされたシステインリッチタグ(MT)を標識するための新しいANSMベースのAuNP合成技術とHPF / FSF再水和-HPF / FSFサンプル調製法を組み合わせたクローン可能なEM標識技術を提示し、HeLa細胞の小胞体膜、小胞体内腔、およびミトコンドリアマトリックス内のタグ付きタンパク質の明確な単一分子同定を可能にします。現在の方法は、高い標識効率、高いS/N比、単一分子標識、および強力な普遍性の特性を兼ね備えており、この方法はライフサイエンス研究への幅広い応用の見通しがあります。

プロトコル

この実験で使用されたすべての消耗品は、 材料表に記載されています。現在のプロトコルの段階的なワークフローを 図1に示します。

1. サファイアディスク上での細胞培養

1. 3 mm x 0.16 mmのサファイアディスクをエタノール1 mLを含む2 mLの遠沈管に移し、超音波洗浄機で10分間超音波処理します。
2. 表面に目に見える堆積物がなくなるまで、各サファイアディスクをアルコールランプの炎で燃やします。
   注意: 上記の方法で、サファイアディスクは何度もリサイクルできます。
3. 各サファイアディスクの片面に、耐溶剤性ペンを使用して番号のラベルを付けます(図1A)。
   注意: 使用するマーカーペンは、マークの損失を防ぐために、事前にアセトンおよびメタノール溶剤に耐性があるかどうかを判断するためにテストする必要があります。
4. ラベルの付いたサファイアディスクを、ラベルの付いた面を上に向けて、35 mmの培養皿の底に置きます。
5. 細胞培養皿をサファイアディスクでUV光下で30分間滅菌します。
6. ピンセット(ラベル面を下に向けて)でサファイアディスクを裏返し、UV光の下でさらに30分間滅菌します。これで、サファイアディスクが入った培養皿は細胞培養の準備が整いました。
   注意: サファイアディスクは、オートクレーブ滅菌によって滅菌することもできます。
7. 上記で調製したサファイアディスク上に細胞を播種し、37°C、95%湿度、および5%_CO2 のセルインキュベーター内で80%〜90%のコンフルエントに増殖させる(図1B)。
   注:MTnタグを発現する安定なHeLa細胞株は、Jiangら²⁶に記載されているように生成されました。

2.高圧凍結(HPF)

注意:この実験では液体窒素を使用しています。液体窒素を扱うときは、凍傷や窒息を防ぐために、適切な安全手順と個人用保護具を使用してください。

1. 製造元の指示に従って、実験の少なくとも2時間前に高圧凍結機を準備します。
2. タイプA HPFアルミニウムキャリア(凹部:0.025 / 0.275 mm)をエタノール1 mLを含む2 mL遠沈管に移し、超音波洗浄機で10分間超音波処理します。
3. 定性濾紙(中速)で覆われたペトリ皿でキャリアを乾燥させます。
4. 洗浄済みの担体を1-ヘキサデセンに浸します。
   注:BSAは、その後の金ナノ粒子合成を妨げるため、現在の実験では凍結保護剤として推奨されていません。
5. 細かいピンセットを使用して、培養皿から細胞が入ったサファイアディスクをピックアップします。ラベル面を定性濾紙(中速)で触れて、余分な媒体を取り除きます。
   注意: 水の熱伝導率は非常に低く、残留水が多すぎると凍結効果に影響します。細胞が乾燥するのを防ぐために、最小限の水を保持します。
6. サファイアディスクをHPF試料ホルダーに取り付け、1-ヘキサデセンを含む深さ0.025 mmのアルミニウムキャリアでディスクをすばやくキャップします(図1C)。
7. 定性的なろ紙(中速)で余分な溶液を吸引します。
8. 高圧凍結用の試料ホルダーをロードします(図1D)。
   注:試料のローディングプロセスは、温度、湿度、pH、および酸素含有量の変化による生理学的変化を最小限に抑えるために、可能な限り高速(1分以内)である必要があります。
9. サファイアディスクキャリアアセンブリを液体窒素下のフォームクライオボックスから降ろし、使用前にアセンブリを液体窒素中のクライオバイアルに保管します。
   注: プロトコルはここで一時停止される場合があります。クライオバイアルの検体は、液体窒素デュワーに何年も保存できます。

3. 凍結置換固定(FSF)と再水和(図1E)

1. 自動凍結置換機(AFS)に液体窒素を充填し、チャンバーを-90°Cまで冷却します。
   注意:この実験では液体窒素を使用しています。液体窒素を扱うときは、凍傷や窒息を防ぐために、適切な安全手順と個人用保護具を使用してください。
2. 2 mLの0.01%タンニン酸(w/v)をアセトン(FSF溶液1)に20 mmのラウンドポリプロピレン容器(図1E)に入れてドラフトに調製し、液体窒素で凍結します。
3. 試料(サファイアディスクキャリアアセンブリ)を、予冷したピンセットを使用してLN2下で凍結したFSF溶液1とともに容器に入れます。
4. 容器を予冷されたAFSチャンバーに移し、-90°CでFSF処理を行います。
5. 試料を-90°Cで1時間保ちます。次に、予冷したピンセットでサファイアディスクをキャリアから分離し、サファイアディスクのマークされた側面が下を向いていることを確認します。
   注意: ピンセットは、温度変化を防ぐために十分に予冷する必要があります。サファイアディスクは簡単に分離できるはずです。
6. -90°Cでさらに8〜10時間保ちます。その後、3時間以内に-60°Cに温めます。
7. 容器内のFSF溶液1を予冷したアセトンと交換し、1時間インキュベートする。このアセトン洗浄を2回繰り返します。
8. 3時間以内に-30°Cまで温めます。この間に、2 mLの遠心管でアセトン中の0.01%酢酸ウラニル2(FSF溶液2、メタノール中の10%酢酸ウラニルから希釈)を調製し、予冷します。
   注意:現在の実験で使用されている酢酸ウラニルは放射性で毒性が高い。適切な安全手順に従って処理し、危険な化学廃棄物として処分する必要があります。
9. アセトンをFSF溶液2に置換し、−30°Cで3時間インキュベートします。
10. 容器内のFSF溶液2を予冷したアセトンに交換し、-30°Cで30分間インキュベートします。 このアセトン洗浄を2回繰り返します。
11. -30°Cから4°Cまで2時間以内に温めます。
12. アセトンを、pH 5.5で1 mM CaCl 2および1 mM MgCl 2を含む2 mLの_0.2 M HEPESバッファーに置き換えます。
13. バッファーを一度交換し、室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
    注:プロトコルは、ここで一晩一時停止するか、ステップ5で検体が再び凍結されるまで少なくとも6時間続けることができます。

4. 哺乳類細胞のためのANSMベースのAuNP合成(図1F)

1. PBS-Aバッファー3回で毎回5分間洗浄します。
2. サファイアディスクを、室温で1 mLのPBS-Aバッファーを含む35 mm培養皿に移します。
   注意: サファイアディスクのマークされた側面を常に下に向けて、サファイアディスクを重ねたり、セルをこすったりしないでください。
3. 1 mLのPBS-Aバッファーを含む2 mLの遠沈管に4.28 μLの2-メルカプトエタノールを添加し、ドラフトでよく混合して、還元溶液を調製します。
   注意:2-メルカプトエタノールは有毒であり、刺激臭があります。適切な安全手順に従って取り扱う必要があります。
4. 培養皿内のPBS-Aバッファーを1 mLの還元溶液に交換し、室温で1時間インキュベートします。
5. 使用前に金前駆体を準備してください。
   1. ddH 2 O中の80 μLの10 mM HAuCl₄ を、1 mLの還元溶液を含む₂mLの遠沈管に加え、直ちにボルテックスします。
      注:溶液が濁る可能性があります。
   2. ddH2O中の500 mM D-ペニシラミン80 μLを上記の溶液に加え、直ちにボルテックスします。
      注:解決策が再び明らかになる場合があります。
6. 培養皿内の溶液をステップ4.5で調製した金前駆体溶液1 mLと交換し、4°Cで2時間インキュベートします。
   注:1ミリリットルの金前駆体は、約1 × 10⁶ 細胞(35 mmディッシュ上でコンフルエント)と反応するのに十分です。AuNPが著しく小さくなると、より大きな量の前駆体が必要になります。
7. 0.0038 gのNaBH₄ を1.5 mLの遠沈管に計量し、1 mLの氷冷ddH₂Oを加え、ボルテックスして使用直前に新鮮な100 mM NaBH₄ を作ります。
8. ステップ4.6の溶液に20〜100μLの100mM NaBH₄ を加え、直ちに振とうしてよく混合し、室温で5分間インキュベートします。
   注意: すぐに使用できるように、100 mM NaBH₄ を新たに準備してください。NaBH₄を加えた後、溶液の色は徐々に赤くなり、その後深くなります。色の変化が観察されない場合は、主に実験が失敗したことを示しています。
9. 溶液を2 mLのPBS-Aバッファーに置き換えて反応を停止します。
   注:長時間の反応は徐々にAuNPを分解するため、30分以内に反応を停止することが重要です。

5. 高圧凍結と凍結置換固定(図1C-F)

注:標本は再びHPFとFSFであり、手順はセクション2とセクション3で以前に説明したものとほぼ同じですが、いくつかの変更があります。

1. アセトン中の1%四酸化オスミウムおよび0.1%酢酸ウラニルを調製する(FSF溶液3、アセトン中の4%四酸化オスミウムおよびメタノール中の10%酢酸ウラニルから希釈)。
   注意:四酸化オスミウムと酢酸ウラニルは非常に有毒な化学物質です。それらは適切な安全手順に従って処理し、危険な化学廃棄物として処分する必要があります。
2. 試料(サファイアディスクキャリアアセンブリ)を、予冷したピンセットを使用してLN2下で凍結FSF溶液3を入れた容器に入れます。
3. 容器を-90°CでFSF処理のために予冷されたAFSチャンバーに移し、次のようにFSFプログラムを実行します:-90°Cで8〜10時間維持します。その後、3時間以内に-60°Cに温めます。-60°Cで3時間保ちます。その後、3時間以内に-30°Cに温めます。-30°Cで3時間保ちます。その後、2時間以内に4°Cに温めます。
4. 温度が4°Cに達したら、試験片をドラフトに移し、室温で15分間維持します。
5. 毎回アセトン3回で15分間洗浄します。
6. アセトン中で室温で少なくとも2時間維持する。

6. 樹脂の浸透、包埋、重合

1. 使用前に、製造元の指示に従ってエポキシ樹脂混合物を準備してください。
   注意:現在の実験で使用されているエポキシ樹脂は、重合前に有毒です。適切な安全手順に従って取り扱う必要があります。重合していない樹脂は、廃棄する前に有害な化学廃棄物として廃棄するか、重合する必要があります。
2. サファイアディスクを平底包埋カプセルに移し、室温で少なくとも30分間樹脂を浸透させます。
   注意: サファイアディスクのマークされた側面を下に向けてください。
3. 試料をオーブンで60°Cで少なくとも18時間重合します。
   注:プロトコルは、重合後にここで一時停止できます。重合した試料ブロックは、ドライ容器に何年も保存できます。

7.超薄型セクショニング

1. かみそりを使用して重合した試料ブロックを慎重にトリミングし、サファイアディスクを露出させます。
2. サファイアディスク付きのブロックチップを液体窒素に数秒間浸し、室温で解凍します。フリーズ解凍操作を数回繰り返して、ディスクをブロックから取り外します。
   注意: 長時間の凍結は、試料ブロックにひびが入る可能性があるため、避けてください。サファイアディスクをブレードでそっと取り外し、サンプルを損傷する可能性のある過度の力を避けます。
3. ブロック面を台形にトリミングして、超薄片化します(図1G)。
4. ウルトラミクロトームで70〜100 nmの超薄切片を取得します(図1H)。
5. 200メッシュの六角銅グリッドのセクションを選択します。
   注: プロトコルは、セクション化後にここで一時停止できます。桁の部分は何年も乾いた容器に保管することができます。必要に応じて、グリッド上の切片を2%ウラニルアセトンで染色して、膜のコントラストを向上させることができます。鉛染色は、ナノ金粒子のシグナルをマスクするため、避ける必要があります。

8. TEMイメージング(図1I)

1. 銅グリッド上の超薄切片を透過型電子顕微鏡で調べます。通常、細胞内のAuNPを視覚化するには、11 kXから30 kXの倍率範囲が適しており、2〜3 nmのAuNPを確実に可視化するには適切な焦点ずれ値が必要です。

結果

ANSMベースのAuNP合成技術は、TEM²⁶でMTタグ付きタンパク質を標識および検出するための非常に有用なツールです。哺乳類細胞におけるその堅牢性を検証するために、Hela細胞においてEGFP-MTn-KDEL、Ost4-EGFP-MTn、またはMito-acGFP-MTnを発現する3つの安定な細胞株を作製した。KDELは、標準的なC末端小胞体(ER)保持/検索配列であり、融合タンパク質EGFP-MTn-KDELを小胞体内腔または核膜(NE)の?...

ディスカッション

本研究では、細胞環境内のタンパク質分子を微細構造分解能で1分子可視化するための堅牢なクローン性EM標識技術を紹介します。遺伝的にコードされたシステインリッチタグ上で直接合成されたAuNPは、標的タンパク質の明確で正確な局在化を提供します。高圧凍結および凍結置換技術は、生物学的サンプルの微細構造を良好に保存します。まとめると、ここで紹介するクローン型電子顕微鏡...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
0.2 M HEPES buffer			Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube	Axygen Scientific	MCT150C
2 mL polypropylene screw cap microtubes	Biologix	81-0204
200 mesh hexagonal copper grid	Tedpella inc	G200HEX
2-mercaptoethanol	Amresco	0482-250ML
35 mm cell culture dishes	Corning	430165
50 mL polypropylene centrifuge tubes	Corning	430928
Acetone	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	31025
Automated freeze substitution machine	Leica	AFS2
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF	Beijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicillamine	TCI	P0147
Dulbecco’s modified Eagle medium	GBICO	C11965500BT
Fetal bovine serum	GBICO	10099-141C
Flat bottom embedding capsule	Tedpella inc
Foam cryobox
Formvar 15/95 resin	Electron Microscopy Sciences	15800
HAuCl4	Sigma	4022-1G
HEPES	sigma	H3375-500G
HPF machine	Wohlwend	HPF compact01
Methonal	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	12397
NaBH4	Sigma	480886-25G
OsO4	Electron Microscopy Sciences	19110
PBS-A buffer			Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4
Qualitative filter paper (medium speed)	Beyotime Biotechnology	FFT08
Sapphire discs	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
Solvent resistant pen	Electron Microscopy Sciences	62053-B
SPI-Pon 812 resin	SPI Inc	02659-AB
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2 spirit
Trypsin-EDTA	GBICO	C25200-056
Tweezers	Dumont
Ultramictotome	Leica	FC7
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400