Sintesi diretta di nanoparticelle d'oro EM-visibili nelle cellule per l'analisi della localizzazione delle proteine con ultrastruttura ben conservata

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una tecnologia di marcatura al microscopio elettronico clonabile per rilevare proteine marcate con metallotioneina nelle cellule utilizzando una nuova tecnica di sintesi di nanoparticelle d'oro basata sul meccanismo di soppressione dell'autonucleazione.

Abstract

Analizzare la localizzazione precisa delle molecole proteiche nelle cellule con risoluzione ultrastrutturale è di grande importanza per lo studio di vari processi fisiologici o patologici in tutti gli organismi viventi. Pertanto, lo sviluppo di tag clonabili che possono essere utilizzati come sonde di microscopia elettronica è di grande valore, così come le proteine fluorescenti hanno svolto un ruolo cruciale nel campo dell'imaging ottico. Recentemente è stato scoperto il meccanismo di soppressione dell'autonucleazione (ANSM), che consente la sintesi specifica di nanoparticelle d'oro (AuNP) su tag ricchi di cisteina, come metallotioneina (MT) e proteina antigelo (AFP).

Sulla base dell'ANSM, è stata sviluppata una tecnologia di marcatura al microscopio elettronico, che consente la rilevazione specifica di proteine marcate in cellule procariotiche ed eucariotiche con un'efficienza di marcatura senza precedenti. Questo studio illustra un protocollo per la rilevazione di proteine di fusione MTn (una variante MT ingegnerizzata priva di residui aldeidico-reattivi) in cellule di mammifero con ultrastruttura ben conservata. In questo protocollo, il congelamento ad alta pressione e la fissazione del congelamento-sostituzione sono stati eseguiti utilizzando fissativi non aldeidici (come acido tannico, acetato di uranile) per preservare l'ultrastruttura quasi nativa ed evitare danni all'attività del tag causati dalla reticolazione aldeidica.

Una semplice reidratazione in un solo passaggio è stata utilizzata prima della sintesi AuNP basata su ANSM. I risultati hanno mostrato che le proteine marcate hanno preso di mira vari organelli, tra cui le membrane e il lume del reticolo endoplasmatico (ER), e le matrici mitocondriali sono state rilevate con elevata efficienza e specificità. Questa ricerca fornisce ai biologi un protocollo robusto per affrontare una vasta gamma di questioni biologiche a livello di singola molecola in contesti ultrastrutturali cellulari.

Introduzione

Nell'era postgenomica, lo sviluppo della proteina fluorescente verde (GFP) come reporter a singola molecola per la microscopia ottica ha rivoluzionato il campo della moderna ricerca sulle scienze della vita ^1,2. Per decenni, la microscopia elettronica (EM) è stata un potente strumento per osservare intuitivamente l'ultrastruttura cellulare con risoluzione su scala nanometrica³; Tuttavia, l'identificazione precisa e la localizzazione delle molecole proteiche rimangono impegnative.

La tecnica di marcatura EM più comunemente usata è la tecnica di marcatura al mi....

Protocollo

Tutti i materiali di consumo utilizzati in questo esperimento sono elencati nella tabella dei materiali. Il flusso di lavoro dettagliato del protocollo corrente è illustrato nella Figura 1.

1. Coltura cellulare su dischi di zaffiro

1. Trasferire dischi di zaffiro da 3 mm x 0,16 mm in una provetta da centrifuga da 2 ml contenente 1 ml di etanolo e sonicare in un pulitore ad ultrasuoni per 10 minuti.
2. Bruciare ogni disco di zaffiro in una fiamma di lampada ad alcool fino a quando non ci sono depositi visibili sulla superficie.
   NOTA: Attraverso il metodo di cui ....

Discussione

Lo studio presenta qui una robusta tecnologia di etichettatura EM clonabile per la visualizzazione di singole molecole di molecole proteiche all'interno dell'ambiente cellulare con risoluzione ultrastrutturale. Le AuNP sintetizzate direttamente su tag ricchi di cisteina geneticamente codificati forniscono una localizzazione univoca e precisa delle proteine bersaglio. La tecnica di congelamento ad alta pressione e di congelamento preserva in modo eccellente l'ultrastruttura dei campioni biologici. Nel complesso, la tecnol.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
0.2 M HEPES buffer			Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube	Axygen Scientific	MCT150C
2 mL polypropylene screw cap microtubes	Biologix	81-0204
200 mesh hexagonal copper grid	Tedpella inc	G200HEX
2-mercaptoethanol	Amresco	0482-250ML
35 mm cell culture dishes	Corning	430165
50 mL polypropylene centrifuge tubes	Corning	430928
Acetone	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	31025
Automated freeze substitution machine	Leica	AFS2
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF	Beijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicillamine	TCI	P0147
Dulbecco’s modified Eagle medium	GBICO	C11965500BT
Fetal bovine serum	GBICO	10099-141C
Flat bottom embedding capsule	Tedpella inc
Foam cryobox
Formvar 15/95 resin	Electron Microscopy Sciences	15800
HAuCl4	Sigma	4022-1G
HEPES	sigma	H3375-500G
HPF machine	Wohlwend	HPF compact01
Methonal	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	12397
NaBH4	Sigma	480886-25G
OsO4	Electron Microscopy Sciences	19110
PBS-A buffer			Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4
Qualitative filter paper (medium speed)	Beyotime Biotechnology	FFT08
Sapphire discs	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
Solvent resistant pen	Electron Microscopy Sciences	62053-B
SPI-Pon 812 resin	SPI Inc	02659-AB
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2 spirit
Trypsin-EDTA	GBICO	C25200-056
Tweezers	Dumont
Ultramictotome	Leica	FC7
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400