Sintesi diretta di nanoparticelle d'oro EM-visibili nelle cellule per l'analisi della localizzazione delle proteine con ultrastruttura ben conservata

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una tecnologia di marcatura al microscopio elettronico clonabile per rilevare proteine marcate con metallotioneina nelle cellule utilizzando una nuova tecnica di sintesi di nanoparticelle d'oro basata sul meccanismo di soppressione dell'autonucleazione.

Abstract

Analizzare la localizzazione precisa delle molecole proteiche nelle cellule con risoluzione ultrastrutturale è di grande importanza per lo studio di vari processi fisiologici o patologici in tutti gli organismi viventi. Pertanto, lo sviluppo di tag clonabili che possono essere utilizzati come sonde di microscopia elettronica è di grande valore, così come le proteine fluorescenti hanno svolto un ruolo cruciale nel campo dell'imaging ottico. Recentemente è stato scoperto il meccanismo di soppressione dell'autonucleazione (ANSM), che consente la sintesi specifica di nanoparticelle d'oro (AuNP) su tag ricchi di cisteina, come metallotioneina (MT) e proteina antigelo (AFP).

Sulla base dell'ANSM, è stata sviluppata una tecnologia di marcatura al microscopio elettronico, che consente la rilevazione specifica di proteine marcate in cellule procariotiche ed eucariotiche con un'efficienza di marcatura senza precedenti. Questo studio illustra un protocollo per la rilevazione di proteine di fusione MTn (una variante MT ingegnerizzata priva di residui aldeidico-reattivi) in cellule di mammifero con ultrastruttura ben conservata. In questo protocollo, il congelamento ad alta pressione e la fissazione del congelamento-sostituzione sono stati eseguiti utilizzando fissativi non aldeidici (come acido tannico, acetato di uranile) per preservare l'ultrastruttura quasi nativa ed evitare danni all'attività del tag causati dalla reticolazione aldeidica.

Una semplice reidratazione in un solo passaggio è stata utilizzata prima della sintesi AuNP basata su ANSM. I risultati hanno mostrato che le proteine marcate hanno preso di mira vari organelli, tra cui le membrane e il lume del reticolo endoplasmatico (ER), e le matrici mitocondriali sono state rilevate con elevata efficienza e specificità. Questa ricerca fornisce ai biologi un protocollo robusto per affrontare una vasta gamma di questioni biologiche a livello di singola molecola in contesti ultrastrutturali cellulari.

Introduzione

Nell'era postgenomica, lo sviluppo della proteina fluorescente verde (GFP) come reporter a singola molecola per la microscopia ottica ha rivoluzionato il campo della moderna ricerca sulle scienze della vita ^1,2. Per decenni, la microscopia elettronica (EM) è stata un potente strumento per osservare intuitivamente l'ultrastruttura cellulare con risoluzione su scala nanometrica³; Tuttavia, l'identificazione precisa e la localizzazione delle molecole proteiche rimangono impegnative.

La tecnica di marcatura EM più comunemente usata è la tecnica di marcatura al microscopio immunoelettronico (IEM), che si basa sulla reazione antigene-anticorpo. Tuttavia, sebbene siano state sviluppate molte tecniche nel campo dell'etichettatura IEM, tra cui IEM pre-embedding e IEM post-embedding (su sezioni di resina o criosezioni idratate), soffre ancora di bassa efficienza di etichettatura (<10%)^4,5, che è correlata alla preparazione del campione e alla qualità degli anticorpi. Per superare queste limitazioni, lo sviluppo di tag geneticamente codificati ha un grande potenziale applicativo.

Due tipi principali di tag EM sono stati accuratamente esplorati negli ultimi anni. Un tipo è il metodo di colorazione DAB, che utilizza tag come APEX2 per ossidare 3,3'-diaminobenzidina (DAB) in polimeri osmiofili per la visualizzazione EM 6,7,8,9,10,11,12. Consente la marcatura di proteine ad alta abbondanza nelle regioni subcellulari, ma non è adatto per il conteggio di singole molecole. L'altro tipo utilizza proteine leganti i metalli, come la ferritina 13 e la metallotioneina (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26^, per generare depositi metallici densi di elettroni in situ per la visualizzazione EM. Solo quest'ultimo ha un reale potenziale per la visualizzazione e il conteggio di singole molecole. La dimensione molecolare della ferritina è troppo grande (~450 kD) per essere usata come tag promettente, mentre le piccole dimensioni (~5 kD) della MT e la sua capacità di legare vari ioni attraverso le sue 20 cisteine hanno attirato grande attenzione. Diversi laboratori hanno cercato di etichettare le proteine purificate di fusione MT o le cellule che esprimono MT incubando direttamente con Au⁺. Questi tentativi hanno inizialmente dimostrato che i tag MT possono legare gli ioni d'oro per formare segnali ad alto contrasto, ma nessuno ha realmente raggiunto l'identificazione efficace delle singole proteine nelle cellule, e non sono ampiamente applicabili 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.

La tecnica di sintesi AuNP basata su ANSM, che prevede la sintesi di AuNP di dimensioni 2-6 nm direttamente su tag ricchi di cisteina (ad esempio, MT, le varianti MT MTn e MTα, AFP) come etichette ad alta densità di elettroni per la visualizzazione EM, è il primo approccio affidabile e applicabile per l'etichettatura delle proteine e il rilevamento di singole molecole nelle cellule^24,25,26. Permette la sintesi specifica di AuNPs su proteine isolate di fusione tag e ha raggiunto un'efficienza di marcatura senza precedenti in cellule procariotiche (E. coli) ed eucariotiche (S. pombe) non fisse o chimicamente fissate. Tuttavia, l'implementazione dello stesso protocollo in sistemi più avanzati come le cellule di mammifero o persino i tessuti comporta ulteriori sfide, come la più complessa omeostasi redox intracellulare e la struttura cellulare più fragile.

Questo studio presenta una tecnologia di etichettatura EM clonabile, che combina la nuova tecnica di sintesi AuNP basata su ANSM per l'etichettatura di tag ricchi di cisteina geneticamente codificati (MT) con il metodo di preparazione del campione HPF / FSF reidratazione HPF / FSF, consente l'identificazione univoca di singole molecole di proteine marcate nella membrana ER, nel lume ER e nella matrice mitocondriale nelle cellule HeLa. Il metodo attuale combina le caratteristiche di un'elevata efficienza di etichettatura, un elevato rapporto segnale-rumore, etichettatura a singola molecola e forte universalità, e questo metodo ha ampie prospettive di applicazione nella ricerca sulle scienze della vita.

Protocollo

Tutti i materiali di consumo utilizzati in questo esperimento sono elencati nella tabella dei materiali. Il flusso di lavoro dettagliato del protocollo corrente è illustrato nella Figura 1.

1. Coltura cellulare su dischi di zaffiro

1. Trasferire dischi di zaffiro da 3 mm x 0,16 mm in una provetta da centrifuga da 2 ml contenente 1 ml di etanolo e sonicare in un pulitore ad ultrasuoni per 10 minuti.
2. Bruciare ogni disco di zaffiro in una fiamma di lampada ad alcool fino a quando non ci sono depositi visibili sulla superficie.
   NOTA: Attraverso il metodo di cui sopra, i dischi di zaffiro possono essere riciclati molte volte.
3. Etichettare un lato di ciascun disco di zaffiro con un numero utilizzando una penna resistente ai solventi (Figura 1A).
   NOTA: La pennarello utilizzata deve essere testata in anticipo per determinare se è resistente ai solventi acetone e metanolo per evitare la perdita di segni.
4. Posizionare i dischi di zaffiro etichettati sul fondo di un piatto di coltura da 35 mm con il lato etichettato rivolto verso l'alto.
5. Sterilizzare il piatto di coltura cellulare con dischi di zaffiro sotto luce UV per 30 minuti.
6. Capovolgere i dischi di zaffiro con una pinzetta (il lato etichettato rivolto verso il basso) e sterilizzare sotto la luce UV per altri 30 minuti. Ora, il piatto di coltura contenente i dischi di zaffiro è pronto per la coltura cellulare.
   NOTA: I dischi di zaffiro possono anche essere sterilizzati in autoclave.
7. Seminare le cellule sui dischi di zaffiro preparati sopra e crescere fino all'80% -90% di confluenza in un incubatore cellulare a 37 ° C, 95% di umidità e 5% di CO₂ (Figura 1B).
   NOTA: Sono state generate linee cellulari HeLa stabili che esprimono tag MTn come descritto in Jiang et ^al.26.

2. Congelamento ad alta pressione (HPF)

ATTENZIONE: in questo esperimento viene utilizzato azoto liquido. Quando si lavora con azoto liquido, utilizzare adeguate procedure di sicurezza e dispositivi di protezione individuale per prevenire il congelamento e l'asfissia.

1. Preparare la macchina di congelamento ad alta pressione almeno 2 ore prima dell'esperimento secondo le istruzioni del produttore.
2. Trasferire i supporti in alluminio HPF di tipo A (incasso: 0,025/0,275 mm) in un tubo di centrifuga da 2 ml contenente 1 ml di etanolo e sonicare in un pulitore ad ultrasuoni per 10 minuti.
3. Asciugare i supporti in una capsula di Petri ricoperta di carta da filtro qualitativa (media velocità).
4. Immergere i vettori prepuliti in 1-esadecene.
   NOTA: BSA non è raccomandato come crioprotettore nell'attuale esperimento in quanto interferirà con la successiva sintesi di nanoparticelle d'oro.
5. Utilizzare una pinzetta fine per raccogliere un disco di zaffiro con cellule dal piatto di coltura; Toccare la superficie etichettata con carta da filtro qualitativa (media velocità) per rimuovere il mezzo in eccesso.
   NOTA: La conduttività termica dell'acqua è molto bassa e troppa acqua residua influirà sull'effetto di congelamento. Trattenere acqua minima per evitare che le cellule si secchino.
6. Montare il disco di zaffiro nel supporto del campione HPF e tappare rapidamente il disco con un supporto in alluminio profondo 0,025 mm contenente 1-esadecene (Figura 1C).
7. Aspirare la soluzione in eccesso con carta da filtro qualitativa (media velocità).
8. Caricare il portacampioni per il congelamento ad alta pressione (Figura 1D).
   NOTA: Il processo di caricamento del campione deve essere il più veloce possibile (entro 1 minuto) per ridurre al minimo le alterazioni fisiologiche dovute a variazioni di temperatura, umidità, pH e contenuto di ossigeno.
9. Scaricare il gruppo portadischi in zaffiro sotto azoto liquido in una crioscatola di schiuma e conservare il gruppo in un crioviale in azoto liquido prima dell'uso.
   NOTA: il protocollo potrebbe essere messo in pausa qui. I campioni nei crioviali possono essere conservati in un dewar di azoto liquido per anni.

3. Fissazione del congelamento-sostituzione (FSF) e reidratazione (Figura 1E)

1. Riempire la macchina automatica di sostituzione del congelamento (AFS) con azoto liquido e raffreddare la camera a -90 °C.
   ATTENZIONE: in questo esperimento viene utilizzato azoto liquido. Quando si lavora con azoto liquido, utilizzare adeguate procedure di sicurezza e dispositivi di protezione individuale per prevenire il congelamento e l'asfissia.
2. Preparare 2 mL di acido tannico allo 0,01% (p/v) in acetone (soluzione FSF 1) in un contenitore rotondo di polipropilene da 20 mm (Figura 1E) in una cappa aspirante e congelarlo in azoto liquido.
3. Caricare i campioni (i gruppi portadischi in zaffiro) nel contenitore con la soluzione FSF congelata 1 sotto LN2 usando una coppia di pinzette preraffreddate.
4. Trasferire il contenitore nella camera AFS preraffreddata per la lavorazione FSF a -90 °C.
5. Conservare i campioni a -90 °C per 1 ora; Quindi, separare i dischi di zaffiro dai supporti con pinzette preraffreddate e assicurarsi che i lati marcati dei dischi di zaffiro siano rivolti verso il basso.
   NOTA: Le pinzette devono essere sufficientemente preraffreddate per evitare variazioni di temperatura. I dischi di zaffiro dovrebbero essere facilmente separati.
6. Conservare a −90 °C per altre 8-10 ore; quindi, riscaldare a -60 °C entro 3 ore.
7. Sostituire la soluzione FSF 1 nel contenitore con acetone preraffreddato e incubare per 1 ora. Ripeti questo lavaggio con acetone 2x.
8. Caldo a -30 °C entro 3 ore. Durante questo periodo, preparare e preraffreddare 2 mL di acetato di uranile allo 0,01% in acetone (soluzione FSF 2, diluita dal 10% di acetato di uranile in metanolo) in una provetta da centrifuga da 2 ml.
   ATTENZIONE: L'acetato di uranile, utilizzato nel presente esperimento, è radioattivo e altamente tossico; devono essere manipolati secondo adeguate procedure di sicurezza e smaltiti come rifiuti chimici pericolosi.
9. Sostituire l'acetone con la soluzione FSF 2 e incubare a -30 °C per 3 ore.
10. Sostituire la soluzione FSF 2 nel contenitore con acetone preraffreddato e incubare per 30 minuti a -30 °C. Ripeti questo lavaggio con acetone 2x.
11. Riscaldare da -30 °C a 4 °C entro 2 ore.
12. Sostituire l'acetone con 2 mL di tampone HEPES da 0,2 M contenente 1 mM di CaCl 2 e 1 mM MgCl₂ a pH 5,5.
13. Cambiare il tampone una volta e incubare a temperatura ambiente per 1 ora o a 4 °C durante la notte.
    NOTA: Il protocollo può essere sospeso qui per una notte o continuato per almeno 6 ore fino a quando i campioni non vengono nuovamente congelati nel passaggio 5.

4. Sintesi di AuNP basata su ANSM per cellule di mammifero (Figura 1F)

1. Lavare con tampone PBS-A 3 volte per 5 minuti.
2. Trasferire i dischi di zaffiro in un piatto di coltura da 35 mm contenente 1 mL di tampone PBS-A a temperatura ambiente.
   NOTA: Tenere sempre i lati marcati dei dischi di zaffiro rivolti verso il basso ed evitare di sovrapporre i dischi di zaffiro e di strofinare le celle.
3. Preparare la soluzione riducente aggiungendo 4,28 μL di 2-mercaptoetanolo in una provetta da centrifuga da 2 mL contenente 1 mL di tampone PBS-A e mescolando bene in una cappa aspirante.
   ATTENZIONE: il 2-mercaptoetanolo è tossico e ha un odore pungente; Deve essere maneggiato secondo adeguate procedure di sicurezza.
4. Sostituire il tampone PBS-A nel piatto di coltura con 1 mL di soluzione riducente e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
5. Preparare il precursore d'oro prima dell'uso.
   1. Aggiungere 80 μL di 10 mM HAuCl₄ in ddH 2 O in una provetta da centrifuga da₂mL contenente 1 mL di soluzione riducente e immediatamente vortice.
      Nota : la soluzione potrebbe diventare torbida.
   2. Aggiungere 80 μL di 500 mM di D-penicillamina in ddH2O nella soluzione di cui sopra e immediatamente vortice.
      NOTA: la soluzione potrebbe diventare di nuovo chiara.
6. Sostituire la soluzione nel piatto di coltura con 1 mL di soluzione precursore d'oro preparata al punto 4.5 e incubare per 2 ore a 4 °C.
   NOTA: Un millilitro del precursore d'oro è sufficiente per reagire con circa 1 × 10⁶ cellule (confluente su un piatto da 35 mm). Sono necessari volumi maggiori del precursore quando le AuNP diventano significativamente più piccole.
7. Pesare 0,0038 g di NaBH 4 in una provetta da centrifuga da 1,5 ml, aggiungere 1 mL di ddH₂O ghiacciato e vortice per ottenere 100 mM NaBH₄ fresco appena prima dell'uso.
8. Aggiungere 20-100 μL di 100 mM NaBH 4 alla soluzione dal punto_4.6 , agitare immediatamente per mescolare bene e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Preparare 100 mM NaBH₄ fresco per l'uso immediato. Dopo aver aggiunto il NaBH₄, il colore della soluzione diventerà gradualmente rosso e poi si approfondirà. Se non viene osservato alcun cambiamento di colore, indica in gran parte che l'esperimento è fallito.
9. Sostituire la soluzione con 2 mL di tampone PBS-A per interrompere la reazione.
   NOTA: Interrompere la reazione entro 30 minuti è fondamentale, poiché una reazione prolungata abbatterà gradualmente gli AuNP.

5. Congelamento ad alta pressione e fissazione di congelamento-sostituzione (figura 1C-F)

NOTA: I campioni sono di nuovo HPF e FSF, e la procedura è quasi la stessa di quella precedentemente descritta nella sezione 2 e nella sezione 3 con alcune modifiche.

1. Preparare tetrossido di osmio all'1% e acetato di uranile allo 0,1% in acetone (soluzione FSF 3, diluita dal 4% di tetrossido di osmio in acetone e dal 10% di uranile acetato in metanolo).
   ATTENZIONE: Il tetrossido di osmio e l'acetato di uranile sono sostanze chimiche altamente tossiche; Devono essere manipolati secondo adeguate procedure di sicurezza e smaltiti come rifiuti chimici pericolosi.
2. Caricare i campioni (i gruppi portadischi in zaffiro) nel contenitore con la soluzione FSF congelata 3 sotto LN2 usando una coppia di pinzette preraffreddate.
3. Trasferire il contenitore nella camera AFS preraffreddata per la lavorazione FSF a -90 °C ed eseguire il programma FSF come segue: mantenere a -90 °C per 8-10 ore; quindi, riscaldare a -60 °C entro 3 ore; mantenere a −60 °C per 3 ore; quindi, riscaldare a -30 °C entro 3 ore; conservare a −30 °C per 3 ore; quindi, riscaldare a 4 °C entro 2 ore.
4. Quando la temperatura raggiunge i 4 °C, trasferire le provette nella cappa aspirante e mantenerle a temperatura ambiente per 15 minuti.
5. Lavare con acetone 3 volte per 15 minuti ogni volta.
6. Conservare in acetone a temperatura ambiente per almeno 2 ore.

6. Infiltrazione, incorporamento e polimerizzazione della resina

1. Preparare la miscela di resina epossidica secondo le istruzioni del produttore prima dell'uso.
   ATTENZIONE: La resina epossidica utilizzata nel presente esperimento è tossica prima della polimerizzazione; Deve essere maneggiato secondo adeguate procedure di sicurezza. La resina non polimerizzata deve essere smaltita come rifiuto chimico pericoloso o polimerizzata prima dello smaltimento.
2. Trasferire i dischi di zaffiro in capsule di incorporamento a fondo piatto e infiltrarsi con resina per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Tenere i lati marcati dei dischi di zaffiro rivolti verso il basso.
3. Polimerizzare la provetta a 60 °C in forno per almeno 18 ore.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui dopo la polimerizzazione. I blocchi di campioni polimerizzati possono essere conservati in un contenitore asciutto per anni.

7. Sezionamento ultrasottile

1. Tagliare accuratamente i blocchi di campioni polimerizzati usando un rasoio per esporre i dischi di zaffiro.
2. Immergere le punte dei blocchi con dischi di zaffiro in azoto liquido per alcuni secondi e scongelare a temperatura ambiente. Ripetere più volte l'azione di congelamento-scongelamento per staccare i dischi dai blocchi.
   NOTA: Evitare il congelamento prolungato, in quanto ciò potrebbe rompere i blocchi del campione. Staccare delicatamente i dischi di zaffiro con una lama, evitando una forza eccessiva, che potrebbe danneggiare i campioni.
3. Rifilare la faccia del blocco a una forma trapezoidale per la sezione ultrasottile (Figura 1G).
4. Ottenere sezioni ultrasottili a 70-100 nm con un ultramicrotomo (Figura 1H).
5. Scegliete le sezioni su griglie esagonali in rame a 200 maglie.
   NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui dopo il sezionamento. Le sezioni sulle cinture possono essere conservate in un contenitore asciutto per anni. Se lo si desidera, le sezioni sulle griglie possono essere colorate con acetone di uranile al 2% per ottenere un migliore contrasto della membrana. La colorazione del piombo dovrebbe essere evitata in quanto maschererà i segnali delle particelle di nanooro.

8. Imaging TEM (Figura 1I)

1. Esaminare le sezioni ultrasottili sulle griglie di rame utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione. Tipicamente, un intervallo di ingrandimento da 11 kX a 30 kX è adatto per visualizzare AuNP nelle celle ed è necessario un valore di sfocatura appropriato per garantire che gli AuNP di 2-3 nm siano visibili.

Risultati

La tecnica di sintesi AuNP basata su ANSM è uno strumento estremamente utile per marcare e rilevare proteine marcate con MT con TEM²⁶. Per convalidare la sua robustezza nelle cellule di mammifero, sono state generate tre linee cellulari stabili che esprimono EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn o Mito-acGFP-MTn nelle cellule Hela. KDEL è una sequenza canonica di ritenzione/recupero del reticolo endoplasmatico C-terminale (ER), che mantiene la proteina di fusione EGFP-MTn-KDEL all'interno del lume ER o d...

Discussione

Lo studio presenta qui una robusta tecnologia di etichettatura EM clonabile per la visualizzazione di singole molecole di molecole proteiche all'interno dell'ambiente cellulare con risoluzione ultrastrutturale. Le AuNP sintetizzate direttamente su tag ricchi di cisteina geneticamente codificati forniscono una localizzazione univoca e precisa delle proteine bersaglio. La tecnica di congelamento ad alta pressione e di congelamento preserva in modo eccellente l'ultrastruttura dei campioni biologici. Nel complesso, la tecnol...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
0.2 M HEPES buffer			Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube	Axygen Scientific	MCT150C
2 mL polypropylene screw cap microtubes	Biologix	81-0204
200 mesh hexagonal copper grid	Tedpella inc	G200HEX
2-mercaptoethanol	Amresco	0482-250ML
35 mm cell culture dishes	Corning	430165
50 mL polypropylene centrifuge tubes	Corning	430928
Acetone	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	31025
Automated freeze substitution machine	Leica	AFS2
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF	Beijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicillamine	TCI	P0147
Dulbecco’s modified Eagle medium	GBICO	C11965500BT
Fetal bovine serum	GBICO	10099-141C
Flat bottom embedding capsule	Tedpella inc
Foam cryobox
Formvar 15/95 resin	Electron Microscopy Sciences	15800
HAuCl4	Sigma	4022-1G
HEPES	sigma	H3375-500G
HPF machine	Wohlwend	HPF compact01
Methonal	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	12397
NaBH4	Sigma	480886-25G
OsO4	Electron Microscopy Sciences	19110
PBS-A buffer			Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4
Qualitative filter paper (medium speed)	Beyotime Biotechnology	FFT08
Sapphire discs	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
Solvent resistant pen	Electron Microscopy Sciences	62053-B
SPI-Pon 812 resin	SPI Inc	02659-AB
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2 spirit
Trypsin-EDTA	GBICO	C25200-056
Tweezers	Dumont
Ultramictotome	Leica	FC7
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400