在细胞中直接合成EM-可见金纳米颗粒，用于蛋白质定位分析，具有保存完好的超微结构

摘要

本协议描述了一种可克隆的电子显微镜标记技术，用于使用基于新型自成核抑制机制的金纳米颗粒合成技术检测细胞中的金属硫蛋白标记蛋白。

摘要

以超微结构分辨率分析细胞中蛋白质分子的精确定位，对于研究所有生物体的各种生理或病理过程具有重要意义。因此，开发可用作电子显微镜探针的可克隆标签具有重要价值，就像荧光蛋白在光学成像领域发挥了至关重要的作用一样。最近发现了自成核抑制机制（ANSM），它允许在富含半胱氨酸的标签上特异性合成金纳米颗粒（AuNPs），例如金属硫蛋白（MT）和防冻蛋白（AFP）。

基于ANSM，开发了一种电子显微镜标记技术，该技术能够以前所未有的标记效率对原核和真核细胞中的标记蛋白进行特异性检测。这项研究说明了在具有良好保存的超微结构的哺乳动物细胞中检测MTn（一种缺乏醛反应性残基的工程MT变体）融合蛋白的方案。在该协议中，使用非醛固定剂（如单宁酸，乙酸铀酰）进行高压冷冻和冷冻取代固定，以保持近乎天然的超微结构并避免醛交联对标签活性的损害。

在基于ANSM的AuNP合成之前，使用简单的一步复液。结果表明，标记蛋白靶向内质网（ER）膜和管腔等多种细胞器，线粒体基质高效、特异性高。这项研究为生物学家提供了一个强大的协议，以解决细胞超微结构背景下单分子水平上的大量生物学问题。

引言

在后基因组时代，绿色荧光蛋白（GFP）作为光学显微镜单分子报告基因的发展彻底改变了现代生命科学研究领域^1，2。几十年来，电子显微镜（EM）一直是直观观察细胞超微结构的强大工具，分辨率^为纳米级分辨率3;然而，蛋白质分子的精确鉴定和定位仍然具有挑战性。

最常用的EM标记技术是基于抗原 - 抗体反应的免疫电子显微镜（IEM）标记技术。然而，尽管在IEM标记领域已经开发了许多技术，包括预包埋IEM和后嵌入IEM（在树脂切片或水合冷冻切片上），但它仍然存在标记效率低（<10^{%）4，5，这与}样品制备和抗体质量有关。为了克服这些限制，开发基因编码标签具有巨大的应用潜力。

近年来，EM标签的两种主要类型已被彻底探索。一种类型是DAB染色法，该方法利用APEX2等标签将3，3'-二氨基联苯胺（DAB）氧化为亲渗透聚合物，用于EM可视化⁶，⁷，⁸，⁹，^10，11，12。它可以标记亚细胞区域中的高丰度蛋白质，但不适用于单分子计数。另一种类型利用金属结合蛋白，如铁蛋白13和金属硫蛋白（MT）14，15，16，^17，18，¹⁹，^20，21，^22，23，²⁴，²⁵，^26，在用于电磁可视化的原位。只有后者具有单分子可视化和计数的真正潜力。铁蛋白的分子尺寸太大（~450 kD），无法用作有前途的标签，而MT的小尺寸（~5 kD）及其通过其20个半胱氨酸结合各种离子的能力引起了极大的关注。一些实验室试图通过直接与Au⁺孵育来标记纯化的MT融合蛋白或表达MT的细胞。这些尝试初步证明了MT标签可以结合金离子形成高对比度信号，但没有一个真正实现细胞中单个蛋白质的有效鉴定，并且它们并不广泛适用¹⁴，15，¹⁶，¹⁷，¹⁸，¹⁹，^20，21，^22，23。

基于ANSM的AuNP合成技术涉及直接在富含半胱氨酸的标签（例如MT，MT变体MTn和MTα，AFP）上合成2-6 nm大小的AuNP，作为EM可视化的电子致密标记，是细胞中蛋白质标记和单分子检测的第一个可靠且适用的方法²⁴，^25，26.它允许在分离的标签融合蛋白上特异性合成AuNPs，并在非固定或化学固定的原核（大肠杆菌）和真核（S. pombe）细胞中实现了前所未有的标记效率。然而，在哺乳动物细胞甚至组织等更先进的系统中实施相同的协议涉及额外的挑战，例如更复杂的细胞内氧化还原稳态和更脆弱的细胞结构。

本研究提出了一种可克隆的EM标记技术，该技术将基于ANSM的新型AuNP合成技术与HPF / FSF-再水化-HPF / FSF样品制备方法相结合，能够明确单分子鉴定HeLa细胞中ER膜，ER腔和线粒体基质中的标记蛋白。目前的方法综合了标记效率高、信噪比高、单分子标记、通用性强等特点，在生命科学研究中具有广阔的应用前景。

研究方案

本实验中使用的所有耗材都列在 材料表中。当前协议的分步工作流程如图 1 所示。

1. 蓝宝石盘上的细胞培养

1. 将 3 mm x 0.16 mm 蓝宝石盘转移到含有 1 mL 乙醇的 2 mL 离心管中，并在超声波清洗器中超声处理 10 分钟。
2. 在酒精灯火焰中燃烧每个蓝宝石圆盘，直到表面上没有可见的沉积物。
   注意：通过上述方法，蓝宝石盘可以多次回收。
3. 使用耐溶剂笔在每个蓝宝石圆盘的一侧标记一个数字（图 1A）。
   注意：使用的记号笔需要事先进行测试，以确定它是否耐丙酮和甲醇溶剂，以防止标记丢失。
4. 将标记的蓝宝石圆盘放在 35 mm 培养皿的底部，标记的一面朝上。
5. 在紫外线下用蓝宝石盘对细胞培养皿进行灭菌30分钟。
6. 用镊子翻转蓝宝石光盘（标记的一面朝下），并在紫外线下再消毒 30 分钟。现在，含有蓝宝石盘的培养皿已准备好进行细胞培养。
   注意：蓝宝石盘也可以通过高压灭菌进行灭菌。
7. 将细胞接种在上面制备的蓝宝石盘上，并在37°C，95%湿度和5%CO₂ 的细胞培养箱中生长至80%-90%汇合度（图1B）。
   注意：表达MTn标签的稳定HeLa细胞系如Jiang等人²⁶中所述产生。

2. 高压冷冻

注意：本实验使用液氮。使用液氮时，请使用适当的安全程序和个人防护设备，以防止冻伤和窒息。

1. 根据制造商的说明在实验前至少2小时准备高压冷冻机。
2. 将 A 型 HPF 铝载体（凹槽：0.025/0.275 mm）转移到含有 1 mL 乙醇的 2 mL 离心管中，并在超声波清洗器中超声处理 10 分钟。
3. 在覆盖有定性滤纸（中速）的培养皿中干燥载体。
4. 将预清洁的载体浸泡在1-十六碳烯中。
   注意：在当前的实验中，不建议将BSA用作冷冻保护剂，因为它会干扰随后的金纳米颗粒合成。
5. 使用细镊子从培养皿中取出带有细胞的蓝宝石盘;用定性滤纸（中速）触摸标记的表面以去除多余的介质。
   注意：水的导热系数很低，残留水过多会影响冷冻效果。保留最少的水以防止细胞变干。
6. 将蓝宝石圆盘安装到 HPF 试样支架中，并用含有 1-十六烯的 0.025 毫米深铝载体快速盖住圆盘（图 1C）。
7. 用定性滤纸（中速）吸出过量溶液。
8. 加载试样支架进行高压冷冻（图1D）。
   注意：试样加载过程需要尽可能快（1 分钟内），以尽量减少由于温度、湿度、pH 值和氧含量变化而导致的生理变化。
9. 在泡沫冷冻箱中的液氮下卸载蓝宝石盘载体组件，并在使用前将组件存放在液氮中的冷冻管中。
   注意：协议可能在此处暂停。冷冻管中的标本可以在液氮杜瓦瓶中储存多年。

3. 冷冻替代固定（FSF）和补液（图1E）

1. 用液氮填充自动冷冻替代机（AFS），并将腔室冷却至-90°C。
   注意：本实验使用液氮。使用液氮时，请使用适当的安全程序和个人防护设备，以防止冻伤和窒息。
2. 在通风橱中的20mm圆形聚丙烯容器（图1E）中制备2mL的0.01%单宁酸（w / v）丙酮（FSF溶液1），并将其冷冻在液氮中。
3. 使用一对预冷的镊子将标本（蓝宝石圆盘载体组件）装入装有LN2下的冷冻FSF溶液1的容器中。
4. 将容器转移到预冷的AFS室中进行FSF处理，温度为-90°C。
5. 将样品在-90°C下保持1小时;然后，用预冷镊子将蓝宝石圆盘与载体分开，并确保蓝宝石圆盘的标记侧面朝下。
   注意：镊子必须充分预冷以防止温度变化。蓝宝石圆盘应易于分离。
6. 在-90°C下再保持8-10小时;然后，在3小时内加热至-60°C。
7. 用预冷的丙酮替换容器中的FSF溶液1，孵育1小时。重复这种丙酮洗涤2次。
8. 在3小时内加热至-30°C。在此期间，在2 mL离心管中制备并预冷2mL 0.01%乙酸铀酰丙酮溶液（FSF溶液2，由10%乙酸铀酰在甲醇中稀释）。
   注意：当前实验中使用的乙酸铀酰具有放射性和剧毒;必须按照适当的安全程序进行处理，并作为危险化学废物处理。
9. 用FSF溶液2替换丙酮，并在-30°C下孵育3小时。
10. 用预冷的丙酮替换容器中的FSF溶液2，并在-30°C下孵育30分钟。 重复这种丙酮洗涤2次。
11. 在2小时内从-30°C加热至4°C。
12. 用 pH 5.5 的 2 mL 含有 1 mM CaCl 2 和 1 mM MgCl 2 的_0.2 M HEPES 缓冲液替换丙酮。
13. 更换缓冲液一次，并在室温下孵育1小时或在4°C孵育过夜。
    注意：方案可以在这里暂停一晚或持续至少6小时，直到在步骤5中再次冷冻标本。

4. 哺乳动物细胞基于ANSM的AuNP合成（图1F）

1. 用PBS-A缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
2. 在室温下将蓝宝石盘转移到含有 1 mL PBS-A 缓冲液的 35 mm 培养皿中。
   注意：始终保持蓝宝石圆盘的标记面朝下，并避免蓝宝石圆盘重叠并擦掉细胞。
3. 通过将 4.28 μL 2-巯基乙醇加入含有 1 mL PBS-A 缓冲液的 2 mL 离心管中并在通风橱中充分混合来制备还原溶液。
   注意：2-巯基乙醇有毒，有刺激性气味;必须按照适当的安全程序进行处理。
4. 用1mL还原溶液替换培养皿中的PBS-A缓冲液，并在室温下孵育1小时。
5. 使用前准备黄金前体。
   1. 将 80 μL 10 mM HAuCl₄ 中的 ddH 2 O 加入含有 1 mL 还原溶液的₂mL 离心管中，并立即涡旋。
      注意：解决方案可能会变得浑浊。
   2. 将 80 μL 500 mM D-青霉胺的 ddH 2 O 加入上述溶液中，并立即涡旋。
      注意：解决方案可能会再次变得清晰。
6. 用步骤4.5中制备的1mL金前体溶液替换培养皿中的溶液，并在4°C下孵育2小时。
   注意：一毫升金前体足以与大约1×10⁶ 个细胞（在35毫米培养皿上汇合）反应。当AuNPs明显变小时，需要更大体积的前体。
7. 称取 0.0038 g NaBH 4 到 1.5 mL 离心管中，加入 1 mL 冰冷的 ddH₂O，并在使用前涡旋制成新鲜的 100 mM NaBH₄。
8. 将 20-100 μL 的 100 mM NaBH 4 加入步骤_4.6 的溶液中，立即摇匀混合，并在室温下孵育 5 分钟。
   注意：新鲜准备 100 mM NaBH₄ 以立即使用。加入NaBH₄后，溶液的颜色会逐渐变红，然后加深。如果没有观察到颜色变化，则在很大程度上表明实验失败。
9. 用 2 mL PBS-A 缓冲液替换溶液以停止反应。
   注意：在30分钟内停止反应至关重要，因为长时间的反应会逐渐分解AuNP。

5.高压冷冻和冷冻替代固定（图1C-F）

注意：标本再次是HPF和FSF，程序与前面在第2节和第3节中描述的程序几乎相同，但进行了一些修改。

1. 在丙酮中制备1%四氧化锇和0.1%乙酸铀酰（FSF溶液3，由4%四氧化锇丙酮溶液和10%乙酸铀酰甲醇稀释）。
   注意：四氧化锇和乙酸铀酰是剧毒化学品;它们必须按照适当的安全程序进行处理，并作为危险化学废物处理。
2. 使用一对预冷镊子将标本（蓝宝石圆盘载体组件）装入装有LN2下的冷冻FSF溶液3的容器中。
3. 将容器转移到预冷的AFS室中进行-90°C的FSF处理，并按如下方式运行FSF程序：在-90°C下保持8-10小时;然后，在3小时内加热至-60°C;在-60°C下保持3小时;然后，在3小时内加热至-30°C;在-30°C下保持3小时;然后，在2小时内加热至4°C。
4. 当温度达到4°C时，将试样转移到通风橱中，并在室温下保持15分钟。
5. 用丙酮洗涤3次，每次15分钟。
6. 在室温下在丙酮中保持至少2小时。

6. 树脂浸润、包埋和聚合

1. 使用前，请根据制造商的说明准备环氧树脂混合物。
   注意：当前实验中使用的环氧树脂在聚合之前是有毒的;必须按照适当的安全程序进行处理。未聚合的树脂在处置前应作为危险化学废物处理或聚合。
2. 将蓝宝石盘转移到平底包埋胶囊中，并在室温下用树脂浸润至少 30 分钟。
   注意：保持蓝宝石圆盘的标记侧面朝下。
3. 将样品在60°C的烘箱中聚合至少18小时。
   注意：聚合后，协议可以在此处暂停。聚合的试样块可以在干燥的容器中储存多年。

7. 超薄切片

1. 使用剃须刀小心修剪聚合的试样块，露出蓝宝石盘。
2. 将带有蓝宝石圆盘的块尖端浸入液氮中几秒钟，然后在室温下解冻。重复冻融动作几次，将光盘从块上拆下。
   注意：避免长时间冷冻，因为这可能会使试样块破裂。用刀片轻轻地拆下蓝宝石圆盘，避免过度用力，以免损坏样品。
3. 将块面修剪为梯形形状以进行超薄切片（图1G）。
4. 用超薄切片机获得70-100nm超薄切片（图1H）。
5. 在 200 目六角形铜网格上选取截面。
   注意：分段后，协议可以在此处暂停。腰带上的部分可以在干燥的容器中存放多年。如果需要，网格上的切片可以用2%铀酰丙酮染色，以获得更好的膜对比度。应避免铅染色，因为它会掩盖纳米金颗粒信号。

8. 透射电镜成像（图1I）

1. 使用透射电子显微镜检查铜栅上的超薄切片。通常，11 kX 至 30 kX 的放大倍率范围适用于可视化细胞中的 AuNP，并且需要适当的散焦值以确保 2-3 nm AuNP 可见。

结果

基于ANSM的AuNP合成技术是用TEM²⁶标记和检测MT标记蛋白的非常有用的工具。为了验证其在哺乳动物细胞中的稳健性，在Hela细胞中产生了三种表达EGFP-MTn-KDEL，Ost4-EGFP-MTn或Mito-acGFP-MTn的稳定细胞系。KDEL是一个规范的C端内质网（ER）保留/检索序列，其将融合蛋白EGFP-MTn-KDEL维持在ER腔内或核包膜（NE）的核周空间内。Ost4是寡糖转移酶复合物的一个亚基，寡糖转移酶复合物是一种位于ER和N...

讨论

该研究在这里展示了一种强大的可克隆EM标记技术，用于以超微结构分辨率在细胞环境中对蛋白质分子进行单分子可视化。直接在富含半胱氨酸的基因编码标签上合成的AuNPs提供了目标蛋白的明确和精确的定位。高压冷冻和冷冻替代技术很好地保留了生物样品的超微结构。综上所述，这里介绍的可克隆电子显微镜标记技术为在细胞超微结构环境中使用EM原 位 定位和识别单个分子提供了强大?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
0.2 M HEPES buffer			Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube	Axygen Scientific	MCT150C
2 mL polypropylene screw cap microtubes	Biologix	81-0204
200 mesh hexagonal copper grid	Tedpella inc	G200HEX
2-mercaptoethanol	Amresco	0482-250ML
35 mm cell culture dishes	Corning	430165
50 mL polypropylene centrifuge tubes	Corning	430928
Acetone	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	31025
Automated freeze substitution machine	Leica	AFS2
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF	Beijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicillamine	TCI	P0147
Dulbecco’s modified Eagle medium	GBICO	C11965500BT
Fetal bovine serum	GBICO	10099-141C
Flat bottom embedding capsule	Tedpella inc
Foam cryobox
Formvar 15/95 resin	Electron Microscopy Sciences	15800
HAuCl4	Sigma	4022-1G
HEPES	sigma	H3375-500G
HPF machine	Wohlwend	HPF compact01
Methonal	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	12397
NaBH4	Sigma	480886-25G
OsO4	Electron Microscopy Sciences	19110
PBS-A buffer			Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4
Qualitative filter paper (medium speed)	Beyotime Biotechnology	FFT08
Sapphire discs	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
Solvent resistant pen	Electron Microscopy Sciences	62053-B
SPI-Pon 812 resin	SPI Inc	02659-AB
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2 spirit
Trypsin-EDTA	GBICO	C25200-056
Tweezers	Dumont
Ultramictotome	Leica	FC7
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400