在细胞中直接合成EM-可见金纳米颗粒，用于蛋白质定位分析，具有保存完好的超微结构

摘要

本协议描述了一种可克隆的电子显微镜标记技术，用于使用基于新型自成核抑制机制的金纳米颗粒合成技术检测细胞中的金属硫蛋白标记蛋白。

摘要

以超微结构分辨率分析细胞中蛋白质分子的精确定位，对于研究所有生物体的各种生理或病理过程具有重要意义。因此，开发可用作电子显微镜探针的可克隆标签具有重要价值，就像荧光蛋白在光学成像领域发挥了至关重要的作用一样。最近发现了自成核抑制机制（ANSM），它允许在富含半胱氨酸的标签上特异性合成金纳米颗粒（AuNPs），例如金属硫蛋白（MT）和防冻蛋白（AFP）。

基于ANSM，开发了一种电子显微镜标记技术，该技术能够以前所未有的标记效率对原核和真核细胞中的标记蛋白进行特异性检测。这项研究说明了在具有良好保存的超微结构的哺乳动物细胞中检测MTn（一种缺乏醛反应性残基的工程MT变体）融合蛋白的方案。在该协议中，使用非醛固定剂（如单宁酸，乙酸铀酰）进行高压冷冻和冷冻取代固定，以保持近乎天然的超微结构并避免醛交联对标签活性的损害。

在基于ANSM的AuNP合成之前，使用简单的一步复液。结果表明，标记蛋白靶向内质网（ER）膜和管腔等多种细胞器，线粒体基质高效、特异性高。这项研究为生物学家提供了一个强大的协议，以解决细胞超微结构背景下单分子水平上的大量生物学问题。

引言

在后基因组时代，绿色荧光蛋白（GFP）作为光学显微镜单分子报告基因的发展彻底改变了现代生命科学研究领域^1，2。几十年来，电子显微镜（EM）一直是直观观察细胞超微结构的强大工具，分辨率^为纳米级分辨率3;然而，蛋白质分子的精确鉴定和定位仍然具有挑战性。

最常用的EM标记技术是基于抗原 - 抗体反应的免疫电子显微镜（IEM）标记技术。然而，尽管在IEM标记领域已经开发了许多技术，包括预包埋IEM和后嵌入IEM（在树脂切片或水合冷冻切片上），但它仍然存在标记效率低（<10^{%）4，5，这与}样品制备和抗体质量有关。为了克服这些限制，开发基因编码标签具有巨大的应用潜力。

近年来，EM标签的两种主要类型已被彻底探索。一种类型是DAB染色法，该方法利用APEX2等标签将3，3'-二氨基联苯胺（DAB）氧化为亲渗透聚合物，用于EM可视化⁶，⁷，⁸，⁹，....

研究方案

本实验中使用的所有耗材都列在 材料表中。当前协议的分步工作流程如图 1 所示。

1. 蓝宝石盘上的细胞培养

1. 将 3 mm x 0.16 mm 蓝宝石盘转移到含有 1 mL 乙醇的 2 mL 离心管中，并在超声波清洗器中超声处理 10 分钟。
2. 在酒精灯火焰中燃烧每个蓝宝石圆盘，直到表面上没有可见的沉积物。
   注意：通过上述方法，蓝宝石盘可以多次回收。
3. 使用耐溶剂笔在每个蓝宝石圆盘的一侧标记一个数字（图 1A）。
   注意：使用的记号笔需要事先进行测试，以确定它是否耐丙酮和甲醇溶剂，以防止标记丢失。
4. 将标记的蓝宝石圆盘放在 35 mm 培养皿的底部，标记的一面朝上。
5. 在紫外线下用蓝宝石盘对细胞培养皿进行灭菌30分钟。
6. 用镊子翻转蓝宝石光盘（标记的一面朝下），并在紫外线下再消毒 30 分钟。现在，含有蓝宝石盘的培养皿已准备好进行细胞培养。
   注意：蓝宝石盘也可以通过高压灭菌进行灭菌。
7. 将细胞接种在上面制备的蓝宝石盘上，并在37°C，95%湿度和5%CO₂ 的细胞培养箱中生长至80%-90%汇合度（

讨论

该研究在这里展示了一种强大的可克隆EM标记技术，用于以超微结构分辨率在细胞环境中对蛋白质分子进行单分子可视化。直接在富含半胱氨酸的基因编码标签上合成的AuNPs提供了目标蛋白的明确和精确的定位。高压冷冻和冷冻替代技术很好地保留了生物样品的超微结构。综上所述，这里介绍的可克隆电子显微镜标记技术为在细胞超微结构环境中使用EM原 位 定位和识别单个分子提供了强大?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
0.2 M HEPES buffer			Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube	Axygen Scientific	MCT150C
2 mL polypropylene screw cap microtubes	Biologix	81-0204
200 mesh hexagonal copper grid	Tedpella inc	G200HEX
2-mercaptoethanol	Amresco	0482-250ML
35 mm cell culture dishes	Corning	430165
50 mL polypropylene centrifuge tubes	Corning	430928
Acetone	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	31025
Automated freeze substitution machine	Leica	AFS2
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF	Beijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicillamine	TCI	P0147
Dulbecco’s modified Eagle medium	GBICO	C11965500BT
Fetal bovine serum	GBICO	10099-141C
Flat bottom embedding capsule	Tedpella inc
Foam cryobox
Formvar 15/95 resin	Electron Microscopy Sciences	15800
HAuCl4	Sigma	4022-1G
HEPES	sigma	H3375-500G
HPF machine	Wohlwend	HPF compact01
Methonal	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	12397
NaBH4	Sigma	480886-25G
OsO4	Electron Microscopy Sciences	19110
PBS-A buffer			Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4
Qualitative filter paper (medium speed)	Beyotime Biotechnology	FFT08
Sapphire discs	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
Solvent resistant pen	Electron Microscopy Sciences	62053-B
SPI-Pon 812 resin	SPI Inc	02659-AB
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2 spirit
Trypsin-EDTA	GBICO	C25200-056
Tweezers	Dumont
Ultramictotome	Leica	FC7
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400