Synthèse directe de nanoparticules d’or EM-visibles dans des cellules pour l’analyse de localisation des protéines avec une ultrastructure bien préservée

Résumé

Le présent protocole décrit une technologie clonable de marquage par microscopie électronique pour détecter les protéines marquées par la métallolothionéine dans les cellules à l’aide d’une nouvelle technique de synthèse de nanoparticules d’or basée sur le mécanisme d’autonucléation.

Résumé

L’analyse de la localisation précise des molécules de protéines dans les cellules à résolution ultrastructurale est d’une grande importance pour l’étude de divers processus physiologiques ou pathologiques dans tous les organismes vivants. Par conséquent, le développement de marqueurs clonables pouvant être utilisés comme sondes de microscopie électronique est d’une grande valeur, tout comme les protéines fluorescentes ont joué un rôle crucial dans le domaine de l’imagerie optique. Le mécanisme de suppression de l’autonucléation (ANSM) a récemment été découvert, qui permet la synthèse spécifique de nanoparticules d’or (AuNPs) sur des marqueurs riches en cystéine, tels que la métallothionéine (MT) et la protéine antigel (AFP).

Sur la base de l’ANSM, une technologie de marquage en microscopie électronique a été développée, qui permet la détection spécifique de protéines marquées dans les cellules procaryotes et eucaryotes avec une efficacité de marquage sans précédent. Cette étude illustre un protocole de détection des protéines de fusion MTn (une variante modifiée de la MT dépourvue de résidus réactifs aux aldéhydes) dans des cellules de mammifères à ultrastructure bien préservée. Dans ce protocole, la congélation à haute pression et la fixation par substitution de congélation ont été réalisées à l’aide de fixateurs non aldéhydiques (tels que l’acide tannique, l’acétate d’uranyle) pour préserver l’ultrastructure quasi native et éviter d’endommager l’activité du marqueur causée par la réticulation des aldéhydes.

Une simple réhydratation en une étape a été utilisée avant la synthèse AuNP basée sur l’ANSM. Les résultats ont montré que les protéines marquées ciblaient divers organites, y compris les membranes et la lumière du réticulum endoplasmique (RE), et les matrices mitochondriales ont été détectées avec une efficacité et une spécificité élevées. Cette recherche fournit aux biologistes un protocole robuste pour répondre à une vaste gamme de questions biologiques au niveau d’une seule molécule dans des contextes ultrastructuraux cellulaires.

Introduction

À l’ère postgénomique, le développement de la protéine fluorescente verte (GFP) en tant que rapporteur à molécule unique pour la microscopie optique a révolutionné le domaine de la recherche moderne en sciences de la vie ^1,2. Pendant des décennies, la microscopie électronique (EM) a été un outil puissant pour observer intuitivement l’ultrastructure cellulaire avec une résolution nanométrique³; Cependant, l’identification et la localisation précises des molécules de protéines restent difficiles.

La technique de marquage EM la plus couramment utilisée est la technique de marquage par microscopie immunoélectronique (IEM), qui est basée sur la réaction antigène-anticorps. Cependant, bien que de nombreuses techniques aient été développées dans le domaine du marquage IEM, y compris le pré-encastrement IEM et le post-enrobage IEM (sur des coupes de résine ou des cryosections hydratées), il souffre encore d’une faible efficacité de marquage (<10%)^4,5, qui est liée à la préparation de l’échantillon et à la qualité des anticorps. Pour surmonter ces limitations, le développement de balises génétiquement codées a un grand potentiel d’application.

Deux principaux types d’étiquettes EM ont été explorés en profondeur ces dernières années. Un type est la méthode de coloration DAB, qui utilise des marqueurs tels que APEX2 pour oxyder la 3,3'-diaminobenzidine (DAB) en polymères osmiophiles pour la visualisation EM 6,7,8,9,10,11,12. Il permet le marquage de protéines à forte abondance dans les régions subcellulaires, mais ne convient pas au comptage d’une seule molécule. L’autre type utilise des protéines de liaison aux métaux, telles que la ferritine 13 et la métallothionéine (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26^, pour générer des dépôts métalliques denses en électrons dans situ pour la visualisation EM. Seul ce dernier a un réel potentiel pour la visualisation et le comptage d’une seule molécule. La taille moléculaire de la ferritine est trop grande (~450 kD) pour qu’elle puisse être utilisée comme étiquette prometteuse, alors que la petite taille (~5 kD) de la MT et sa capacité à lier divers ions à travers ses 20 cystéines ont attiré une grande attention. Plusieurs laboratoires ont essayé de marquer des protéines de fusion MT purifiées ou des cellules exprimant MT en incubant directement avec Au⁺. Ces tentatives ont initialement prouvé que les marqueurs MT peuvent lier les ions d’or pour former des signaux à contraste élevé, mais aucun n’a vraiment permis l’identification efficace de protéines individuelles dans les cellules, et ils ne sont pas largement applicables 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.

La technique de synthèse AuNP basée sur l’ANSM, qui consiste à synthétiser des AuNP de taille 2-6 nm directement sur des marqueurs riches en cystéine (par exemple, MT, les variantes MTn et MTα, AFP) en tant que marqueurs denses en électrons pour la visualisation EM, est la première approche fiable et applicable pour le marquage des protéines et la détection de molécules uniques dans les cellules^24,25,26. Il permet la synthèse spécifique d’AuNP sur des protéines de fusion de marqueurs isolées et a atteint une efficacité de marquage sans précédent dans les cellules procaryotes (E. coli) et eucaryotes (S. pombe) non fixées ou chimiquement fixées. Cependant, la mise en œuvre du même protocole dans des systèmes plus avancés tels que les cellules de mammifères ou même les tissus implique des défis supplémentaires, tels que l’homéostasie redox intracellulaire plus complexe et une structure cellulaire plus fragile.

Cette étude présente une technologie de marquage EM clonable, qui combine la nouvelle technique de synthèse AuNP basée sur ANSM pour marquer les marqueurs riches en cystéine (MT) génétiquement codés avec la méthode de préparation d’échantillons HPF / FSF / réhydratation / HPF / FSF, permet l’identification sans ambiguïté d’une seule molécule de protéines marquées dans la membrane ER, la lumière ER et la matrice mitochondriale dans les cellules HeLa. La méthode actuelle combine les caractéristiques d’une efficacité d’étiquetage élevée, d’un rapport signal sur bruit élevé, d’un marquage à molécule unique et d’une forte universalité, et cette méthode a de larges perspectives d’application dans la recherche en sciences de la vie.

Protocole

Toutes les fournitures utilisées dans cette expérience sont énumérées dans le tableau des matériaux. Le flux de travail pas à pas du protocole actuel est illustré à la figure 1.

1. Culture cellulaire sur disques de saphir

1. Transvaser des disques de saphir de 3 mm x 0,16 mm dans un tube centrifuge de 2 mL contenant 1 mL d’éthanol et sonifier dans un nettoyeur à ultrasons pendant 10 min.
2. Brûlez chaque disque de saphir dans une flamme de lampe à alcool jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de dépôts visibles à la surface.
   REMARQUE: Grâce à la méthode ci-dessus, les disques saphir peuvent être recyclés plusieurs fois.
3. Étiquetez un côté de chaque disque de saphir avec un numéro à l’aide d’un stylo résistant aux solvants (Figure 1A).
   REMARQUE : Le marqueur utilisé doit être testé à l’avance pour déterminer s’il est résistant aux solvants d’acétone et de méthanol afin d’éviter la perte de marques.
4. Placez les disques de saphir étiquetés au fond d’un plat de culture de 35 mm avec le côté étiqueté vers le haut.
5. Stériliser la boîte de culture cellulaire avec des disques de saphir sous lumière UV pendant 30 min.
6. Retournez les disques de saphir avec une pince à épiler (le côté étiqueté vers le bas) et stérilisez sous la lumière UV pendant 30 minutes supplémentaires. Maintenant, la boîte de culture contenant les disques de saphir est prête pour la culture cellulaire.
   REMARQUE: Les disques de saphir peuvent également être stérilisés par autoclavage.
7. Ensemencer les cellules sur les disques de saphir préparés ci-dessus et atteindre une confluence de 80 % à 90 % dans un incubateur cellulaire à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO₂ (Figure 1B).
   REMARQUE : Des lignées cellulaires HeLa stables exprimant des marqueurs MTn ont été générées comme décrit dans Jiang et ^coll.26.

2. Congélation à haute pression (HPF)

ATTENTION : L’azote liquide est utilisé dans cette expérience. Lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide, utilisez des procédures de sécurité appropriées et de l’équipement de protection individuelle pour prévenir les engelures et l’asphyxie.

1. Préparez la machine de congélation à haute pression au moins 2 h avant l’expérience conformément aux instructions du fabricant.
2. Transférer les supports en aluminium HPF de type A (encastrement : 0,025/0,275 mm) dans un tube centrifuge de 2 mL contenant 1 mL d’éthanol et sonifier dans un nettoyeur à ultrasons pendant 10 min.
3. Sécher les supports dans une boîte de Petri recouverte de papier filtre qualitatif (vitesse moyenne).
4. Faire tremper les supports prénettoyés dans du 1-hexadécène.
   REMARQUE: Le BSA n’est pas recommandé comme cryoprotecteur dans l’expérience actuelle car il interférera avec la synthèse ultérieure de nanoparticules d’or.
5. Utilisez une pince à épiler fine pour ramasser un disque de saphir avec des cellules du plat de culture; Touchez la surface étiquetée avec du papier filtre qualitatif (vitesse moyenne) pour enlever l’excès de milieu.
   REMARQUE: La conductivité thermique de l’eau est très faible et trop d’eau résiduelle affectera l’effet de congélation. Retenez un minimum d’eau pour empêcher les cellules de se dessécher.
6. Montez le disque de saphir dans le porte-échantillon HPF et coiffez rapidement le disque d’un support en aluminium de 0,025 mm de profondeur contenant du 1-hexadécène (Figure 1C).
7. Aspirer l’excès de solution avec du papier filtre qualitatif (vitesse moyenne).
8. Chargez le porte-échantillon pour la congélation à haute pression (figure 1D).
   NOTE: Le processus de chargement de l’échantillon doit être aussi rapide que possible (dans les 1 min) pour minimiser les altérations physiologiques dues aux changements de température, d’humidité, de pH et de teneur en oxygène.
9. Décharger l’ensemble disque de saphir sous azote liquide dans une cryoboîte en mousse et stocker l’ensemble dans un cryovial dans de l’azote liquide avant utilisation.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les échantillons dans des cryovials peuvent être stockés dans un dewar d’azote liquide pendant des années.

3. Fixation par substitution au gel (FSF) et réhydratation (Figure 1E)

1. Remplissez la machine de remplacement automatique de la congélation (AFS) avec de l’azote liquide et refroidissez la chambre à −90 °C.
   ATTENTION : L’azote liquide est utilisé dans cette expérience. Lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide, utilisez des procédures de sécurité appropriées et de l’équipement de protection individuelle pour prévenir les engelures et l’asphyxie.
2. Préparer 2 mL d’acide tannique à 0,01 % (p/v) dans de l’acétone (solution FSF 1) dans un contenant rond en polypropylène de 20 mm (figure 1E) dans une hotte et le congeler dans de l’azote liquide.
3. Charger les échantillons (les assemblages disque-support saphir) dans le récipient avec la solution congelée FSF 1 sous LN2 à l’aide d’une paire de pinces à épiler prérefroidies.
4. Transférer le récipient dans la chambre AFS prérefroidie pour le traitement FSF à −90 °C.
5. Conserver les échantillons à −90 °C pendant 1 h; Ensuite, séparez les disques de saphir des supports avec une pince à épiler prérefroidie et assurez-vous que les côtés marqués des disques de saphir sont orientés vers le bas.
   NOTE: La pince à épiler doit être suffisamment prérefroidie pour éviter les changements de température. Les disques de saphir doivent être facilement séparés.
6. Maintenir à −90 °C pendant encore 8 à 10 h; puis, chauffer à −60 °C en 3 heures.
7. Remplacez la solution FSF 1 dans le récipient par de l’acétone prérefroidie et incuber pendant 1 h. Répétez ce lavage à l’acétone 2x.
8. Chauffer à −30 °C en 3 h. Pendant cette période, préparer et prérefroidir 2 mL d’acétate d’uranyle à 0,01 % dans de l’acétone (solution 2 de FSF, diluée à partir d’acétate d’uranyle à 10 % dans du méthanol) dans un tube à centrifuger de 2 mL.
   ATTENTION : L’acétate d’uranyle, utilisé dans la présente expérience, est radioactif et hautement toxique; Ils doivent être manipulés conformément aux procédures de sécurité appropriées et éliminés comme déchets chimiques dangereux.
9. Remplacer l’acétone par la solution FSF 2 et incuber à −30 °C pendant 3 h.
10. Remplacer la solution FSF 2 dans le récipient par de l’acétone prérefroidie et incuber pendant 30 min à −30 °C. Répétez ce lavage à l’acétone 2x.
11. Chauffer de −30 °C à 4 °C en 2 h.
12. Remplacer l’acétone par 2 mL de tampon HEPES 0,2 M contenant 1 mM de CaCl2_{et 1} mM de MgCl2_{à pH} 5,5.
13. Changez le tampon une fois et incuber à température ambiante pendant 1 h ou à 4 °C pendant une nuit.
    REMARQUE : Le protocole peut être interrompu ici pendant une nuit ou poursuivi pendant au moins 6 heures jusqu’à ce que les échantillons soient congelés à nouveau à l’étape 5.

4. Synthèse AuNP basée sur l’ANSM pour les cellules de mammifères (Figure 1F)

1. Laver avec un tampon PBS-A 3x pendant 5 minutes à chaque fois.
2. Transférer les disques de saphir dans une boîte de culture de 35 mm contenant 1 ml de tampon PBS-A à température ambiante.
   REMARQUE: Gardez toujours les côtés marqués des disques de saphir vers le bas et évitez de chevaucher les disques de saphir et de frotter les cellules.
3. Préparer la solution réductrice en ajoutant 4,28 μL de 2-mercaptoéthanol dans un tube à centrifuger de 2 mL contenant 1 mL de tampon PBS-A et en mélangeant bien dans une hotte.
   ATTENTION : Le 2-mercaptoéthanol est toxique et dégage une odeur piquante ; Il doit être manipulé conformément aux procédures de sécurité appropriées.
4. Remplacer le tampon PBS-A dans la boîte de culture par 1 mL de solution réductrice et incuber pendant 1 h à température ambiante.
5. Préparer le précurseur d’or avant utilisation.
   1. Ajouter 80 μL de 10 mM HAuCl₄ dans ddH 2 O dans un tube centrifuge de₂mL contenant 1 mL de solution réductrice et immédiatement vortex.
      REMARQUE: La solution peut devenir trouble.
   2. Ajouter 80 μL de 500 mM de D-pénicillamine dans le ddH2O dans la solution ci-dessus, et immédiatement vortex.
      Remarque : La solution peut redevenir claire.
6. Remplacer la solution dans la boîte de culture par la solution de précurseur d’or de 1 mL préparée à l’étape 4.5 et incuber pendant 2 h à 4 °C.
   NOTE: Un millilitre du précurseur de l’or est suffisant pour réagir avec environ 1 × 10⁶ cellules (confluent sur une boîte de 35 mm). Des volumes plus importants du précurseur sont nécessaires lorsque les AuNP deviennent significativement plus petits.
7. Peser 0,0038 g de NaBH 4 dans un tube à centrifuger de 1,5 mL, ajouter 1 mL de ddH2O glacé et vortexpour obtenir du NaBH₄ frais de 100 mM juste avant utilisation.
8. Ajouter 20-100 μL de NaBH 4 100 mM à la solution à partir de l’étape_4.6 , agiter immédiatement pour bien mélanger et incuber pendant 5 min à température ambiante.
   REMARQUE: Préparer 100 mM NaBH₄ fraîchement pour une utilisation immédiate. Après avoir ajouté le NaBH₄, la couleur de la solution deviendra progressivement rouge puis s’approfondira. Si aucun changement de couleur n’est observé, cela indique en grande partie que l’expérience a échoué.
9. Remplacez la solution par 2 mL de tampon PBS-A pour arrêter la réaction.
   NOTE: L’arrêt de la réaction dans les 30 minutes est critique, car une réaction prolongée décomposera progressivement les AuNP.

5. Congélation à haute pression et fixation par substitution de congélation (figure 1C-F)

REMARQUE : Les échantillons sont à nouveau HPF et FSF, et la procédure est presque la même que celle décrite précédemment aux sections 2 et 3 avec quelques modifications.

1. Préparer 1 % de tétroxyde d’osmium et 0,1 % d’acétate d’uranyle dans de l’acétone (solution 3 de FSF, diluée à partir de 4 % de tétroxyde d’osmium dans de l’acétone et de 10 % d’acétate d’uranyle dans du méthanol).
   ATTENTION : Le tétroxyde d’osmium et l’acétate d’uranyle sont des produits chimiques hautement toxiques; Ils doivent être manipulés conformément aux procédures de sécurité appropriées et éliminés en tant que déchets chimiques dangereux.
2. Charger les échantillons (les assemblages disque-support saphir) dans le récipient avec la solution FSF congelée 3 sous LN2 à l’aide d’une paire de pinces à épiler prérefroidies.
3. Transférer le récipient dans la chambre AFS prérefroidie pour le traitement FSF à −90 °C et exécuter le programme FSF comme suit: conserver à −90 °C pendant 8-10 h; puis, chauffer à −60 °C en 3 heures; maintenir à −60 °C pendant 3 h; puis, chauffer à −30 °C en 3 heures; conserver à −30 °C pendant 3 h; puis, chauffer à 4 °C en 2 h.
4. Lorsque la température atteint 4 °C, transférer les échantillons dans la hotte et les maintenir à température ambiante pendant 15 min.
5. Laver à l’acétone 3x pendant 15 min à chaque fois.
6. Maintenir dans l’acétone à température ambiante pendant au moins 2 h.

6. Infiltration de résine, enrobage et polymérisation

1. Préparez le mélange de résine époxy conformément aux instructions du fabricant avant utilisation.
   ATTENTION : La résine époxy utilisée dans l’expérience actuelle est toxique avant polymérisation ; Il doit être manipulé conformément aux procédures de sécurité appropriées. La résine non polymérisée doit être éliminée en tant que déchet chimique dangereux ou polymérisée avant d’être éliminée.
2. Transférer les disques de saphir dans des capsules à fond plat et s’infiltrer avec de la résine pendant au moins 30 minutes à température ambiante.
   REMARQUE: Gardez les côtés marqués des disques saphir vers le bas.
3. Polymériser l’échantillon à 60 °C dans une étuve pendant au moins 18 h.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici après la polymérisation. Les blocs d’échantillons polymérisés peuvent être stockés dans un récipient sec pendant des années.

7. Sectionnement ultrafin

1. Coupez soigneusement les blocs d’échantillons polymérisés à l’aide d’un rasoir pour exposer les disques de saphir.
2. Trempez les extrémités des blocs avec des disques de saphir dans de l’azote liquide pendant plusieurs secondes et décongelez à température ambiante. Répétez l’action de gel-dégel plusieurs fois pour détacher les disques des blocs.
   REMARQUE : Évitez la congélation prolongée, car cela pourrait fissurer les blocs d’échantillon. Détachez délicatement les disques de saphir avec une lame, en évitant une force excessive, qui pourrait endommager les échantillons.
3. Coupez la face du bloc à une forme trapézoïdale pour une section ultramince (Figure 1G).
4. Obtenir des sections ultraminces de 70 à 100 nm avec un ultramicrotome (Figure 1H).
5. Choisissez les sections sur des grilles hexagonales en cuivre à 200 mailles.
   REMARQUE: Le protocole peut être suspendu ici après la section. Les sections sur les ceintures peuvent être stockées dans un conteneur sec pendant des années. Si vous le souhaitez, les sections sur les grilles peuvent être colorées avec 2% d’acétone d’uranyle pour obtenir un meilleur contraste membranaire. La coloration au plomb doit être évitée car elle masquera les signaux de particules de nano-or.

8. Imagerie TEM (Figure 1I)

1. Examiner les sections ultraminces sur des grilles de cuivre à l’aide d’un microscope électronique à transmission. En règle générale, une plage de grossissement de 11 kX à 30 kX convient à la visualisation des AuNP dans les cellules, et une valeur de défocalisation appropriée est nécessaire pour s’assurer que les AuNP de 2 à 3 nm sont visibles.

Résultats

La technique de synthèse AuNP basée sur l’ANSM est un outil extrêmement utile pour marquer et détecter les protéines marquées MT avec TEM²⁶. Pour valider sa robustesse dans les cellules de mammifères, trois lignées cellulaires stables exprimant EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn ou Mito-acGFP-MTn dans les cellules Hela ont été générées. KDEL est une séquence canonique de rétention/récupération du réticulum endoplasmique (ER) C-terminal, qui maintient la protéine de fusion EGFP-MTn-K...

Discussion

L’étude présente ici une technologie robuste de marquage EM clonable pour la visualisation à molécule unique de molécules de protéines dans l’environnement cellulaire avec une résolution ultrastructurale. Les AuNPs directement synthétisés sur des marqueurs riches en cystéine génétiquement codés fournissent une localisation claire et précise des protéines cibles. La technique de congélation à haute pression et de remplacement de la congélation préserve parfaitement l’ultrastructure des échantillo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
0.2 M HEPES buffer			Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube	Axygen Scientific	MCT150C
2 mL polypropylene screw cap microtubes	Biologix	81-0204
200 mesh hexagonal copper grid	Tedpella inc	G200HEX
2-mercaptoethanol	Amresco	0482-250ML
35 mm cell culture dishes	Corning	430165
50 mL polypropylene centrifuge tubes	Corning	430928
Acetone	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	31025
Automated freeze substitution machine	Leica	AFS2
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF	Beijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicillamine	TCI	P0147
Dulbecco’s modified Eagle medium	GBICO	C11965500BT
Fetal bovine serum	GBICO	10099-141C
Flat bottom embedding capsule	Tedpella inc
Foam cryobox
Formvar 15/95 resin	Electron Microscopy Sciences	15800
HAuCl4	Sigma	4022-1G
HEPES	sigma	H3375-500G
HPF machine	Wohlwend	HPF compact01
Methonal	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	12397
NaBH4	Sigma	480886-25G
OsO4	Electron Microscopy Sciences	19110
PBS-A buffer			Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4
Qualitative filter paper (medium speed)	Beyotime Biotechnology	FFT08
Sapphire discs	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
Solvent resistant pen	Electron Microscopy Sciences	62053-B
SPI-Pon 812 resin	SPI Inc	02659-AB
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2 spirit
Trypsin-EDTA	GBICO	C25200-056
Tweezers	Dumont
Ultramictotome	Leica	FC7
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400