Synthèse directe de nanoparticules d’or EM-visibles dans des cellules pour l’analyse de localisation des protéines avec une ultrastructure bien préservée

Résumé

Le présent protocole décrit une technologie clonable de marquage par microscopie électronique pour détecter les protéines marquées par la métallolothionéine dans les cellules à l’aide d’une nouvelle technique de synthèse de nanoparticules d’or basée sur le mécanisme d’autonucléation.

Résumé

L’analyse de la localisation précise des molécules de protéines dans les cellules à résolution ultrastructurale est d’une grande importance pour l’étude de divers processus physiologiques ou pathologiques dans tous les organismes vivants. Par conséquent, le développement de marqueurs clonables pouvant être utilisés comme sondes de microscopie électronique est d’une grande valeur, tout comme les protéines fluorescentes ont joué un rôle crucial dans le domaine de l’imagerie optique. Le mécanisme de suppression de l’autonucléation (ANSM) a récemment été découvert, qui permet la synthèse spécifique de nanoparticules d’or (AuNPs) sur des marqueurs riches en cystéine, tels que la métallothionéine (MT) et la protéine antigel (AFP).

Sur la base de l’ANSM, une technologie de marquage en microscopie électronique a été développée, qui permet la détection spécifique de protéines marquées dans les cellules procaryotes et eucaryotes avec une efficacité de marquage sans précédent. Cette étude illustre un protocole de détection des protéines de fusion MTn (une variante modifiée de la MT dépourvue de résidus réactifs aux aldéhydes) dans des cellules de mammifères à ultrastructure bien préservée. Dans ce protocole, la congélation à haute pression et la fixation par substitution de congélation ont été réalisées à l’aide de fixateurs non aldéhydiques (tels que l’acide tannique, l’acétate d’uranyle) pour préserver l’ultrastructure quasi native et éviter d’endommager l’activité du marqueur causée par la réticulation des aldéhydes.

Une simple réhydratation en une étape a été utilisée avant la synthèse AuNP basée sur l’ANSM. Les résultats ont montré que les protéines marquées ciblaient divers organites, y compris les membranes et la lumière du réticulum endoplasmique (RE), et les matrices mitochondriales ont été détectées avec une efficacité et une spécificité élevées. Cette recherche fournit aux biologistes un protocole robuste pour répondre à une vaste gamme de questions biologiques au niveau d’une seule molécule dans des contextes ultrastructuraux cellulaires.

Introduction

À l’ère postgénomique, le développement de la protéine fluorescente verte (GFP) en tant que rapporteur à molécule unique pour la microscopie optique a révolutionné le domaine de la recherche moderne en sciences de la vie ^1,2. Pendant des décennies, la microscopie électronique (EM) a été un outil puissant pour observer intuitivement l’ultrastructure cellulaire avec une résolution nanométrique³; Cependant, l’identification et la localisation précises des molécules de protéines restent difficiles.

La technique de marquage EM la plus couramment utilisée est la te....

Protocole

Toutes les fournitures utilisées dans cette expérience sont énumérées dans le tableau des matériaux. Le flux de travail pas à pas du protocole actuel est illustré à la figure 1.

1. Culture cellulaire sur disques de saphir

1. Transvaser des disques de saphir de 3 mm x 0,16 mm dans un tube centrifuge de 2 mL contenant 1 mL d’éthanol et sonifier dans un nettoyeur à ultrasons pendant 10 min.
2. Brûlez chaque disque de saphir dans une flamme de lampe à alcool jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de dépôts visibles à la surface.
   REMARQUE: Grâce à la méthode ci-dessus, les d....

Discussion

L’étude présente ici une technologie robuste de marquage EM clonable pour la visualisation à molécule unique de molécules de protéines dans l’environnement cellulaire avec une résolution ultrastructurale. Les AuNPs directement synthétisés sur des marqueurs riches en cystéine génétiquement codés fournissent une localisation claire et précise des protéines cibles. La technique de congélation à haute pression et de remplacement de la congélation préserve parfaitement l’ultrastructure des échantillo.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
0.2 M HEPES buffer			Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5
1.5 mL MaxyClear snaplock microtube	Axygen Scientific	MCT150C
2 mL polypropylene screw cap microtubes	Biologix	81-0204
200 mesh hexagonal copper grid	Tedpella inc	G200HEX
2-mercaptoethanol	Amresco	0482-250ML
35 mm cell culture dishes	Corning	430165
50 mL polypropylene centrifuge tubes	Corning	430928
Acetone	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	31025
Automated freeze substitution machine	Leica	AFS2
Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF	Beijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicillamine	TCI	P0147
Dulbecco’s modified Eagle medium	GBICO	C11965500BT
Fetal bovine serum	GBICO	10099-141C
Flat bottom embedding capsule	Tedpella inc
Foam cryobox
Formvar 15/95 resin	Electron Microscopy Sciences	15800
HAuCl4	Sigma	4022-1G
HEPES	sigma	H3375-500G
HPF machine	Wohlwend	HPF compact01
Methonal	Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company	12397
NaBH4	Sigma	480886-25G
OsO4	Electron Microscopy Sciences	19110
PBS-A buffer			Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4
Qualitative filter paper (medium speed)	Beyotime Biotechnology	FFT08
Sapphire discs	Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend
Solvent resistant pen	Electron Microscopy Sciences	62053-B
SPI-Pon 812 resin	SPI Inc	02659-AB
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2 spirit
Trypsin-EDTA	GBICO	C25200-056
Tweezers	Dumont
Ultramictotome	Leica	FC7
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400