تشريح الأوعية الدموية للفأر البالغ من أجل تسلسل النواة المفردة أو تلطيخ المناعة

Summary

السطور الوعائية أمر حيوي لتوليد إمكانات القوقعة الداخلية. هنا ، نقدم تشريح الأوعية الدموية للفأر البالغ لتسلسل النواة المفردة أو تلطيخ المناعة.

Abstract

تعد إمكانات Endocochlear ، التي يتم إنشاؤها بواسطة السطور الوعائية ، ضرورية للحفاظ على بيئة مواتية للنقل الميكانيكي المناسب لخلايا الشعر والسمع في نهاية المطاف. يمكن أن تؤدي أمراض الأوعية الدموية السطورية إلى انخفاض السمع. يسمح تشريح الأوعية الدموية للخطوط البالغة بالتقاط نواة واحدة مركزة وتسلسل النواة المفردة اللاحقة والبقع المناعية. تستخدم هذه التقنيات لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للأوعية الدموية السعيرة على مستوى الخلية الواحدة.

يمكن استخدام تسلسل النواة المفردة في إعداد التحليل النسخي للأوعية الدموية السطورية. وفي الوقت نفسه، لا يزال التلوين المناعي مفيدا في تحديد مجموعات معينة من الخلايا. تتطلب كلتا الطريقتين تشريح الأوعية الدموية المناسب كشرط أساسي ، والذي يمكن أن يكون تحديا تقنيا.

Introduction

تتكون القوقعة من ثلاث غرف مملوءة بالسوائل ، سكالا الدهليز ، سكالا ميديا ، وسكالا تيمباني . يحتوي كل من سكالا الدهليزي وسكالا تيمباني على perilymph ، الذي يحتوي على تركيز عال من الصوديوم (138 mM) وتركيز منخفض من البوتاسيوم (6.8 mM) ¹. تحتوي وسائط سكالا على اللمف الداخلي ، الذي يحتوي على تركيز عال من البوتاسيوم (154 مللي مول) وتركيز منخفض من الصوديوم (0.91 مللي مول) ¹،^2،3. يمكن الإشارة إلى هذا الاختلاف في تركيز الأيونات باسم جهد القوقعة الداخلية (EP) ، ويتولد بشكل أساسي عن طريق حركة أيونات البوتاسيوم عبر قنوات أيونية مختلفة وتقاطعات الفجوة في الأوعية الدموية السطورية (SV) على طول الجدار الجانبي للقوقعة⁴،⁵،⁶،⁷،⁸،⁹،^10،11. SV هو نسيج غير متجانس شديد الأوعية الدموية يبطن الجانب الإنسي للجدار الجانبي للقوقعة ويحتوي على ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا: الخلايا الهامشية والمتوسطة والقاعدية¹² (الشكل 1).

ترتبط الخلايا الهامشية عن طريق تقاطعات ضيقة لتشكيل السطح الأكثر وسطية ل SV. يواجه الغشاء القمي اللمف الداخلي لوسط سكالا ويساهم في نقل أيونات البوتاسيوم إلى اللمف الداخلي باستخدام قنوات مختلفة ، بما في ذلك KCNE1 / KCNQ1 و SLC12A2 و Na ⁺ -K ⁺ -ATPase (NKA) ⁵،¹⁰،^13،14. الخلايا الوسيطة هي خلايا مصطبغة تقع بين الخلايا الهامشية والقاعدية وتسهل نقل البوتاسيوم عبر SV باستخدام KCNJ10 (Kir 4.1) ^15,16. تقع الخلايا القاعدية على مقربة من الجدار الجانبي للقوقعة وترتبط ارتباطا وثيقا بالخلايا الليفية في الرباط الحلزوني لتعزيز إعادة تدوير البوتاسيوم من perilymph¹². وقد تورط علم الأمراض من SV في العديد من اضطرابات الأذن^17،18. يمكن أن تسبب الطفرات في الجينات المعبر عنها في أنواع خلايا SV الرئيسية ، مثل Kcnq1 و Kcne1 و Kcnj10 و Cldn11 ، الصمم واختلال SV ، بما في ذلك فقدان EP¹⁹،²⁰،21^،22،23. بالإضافة إلى أنواع الخلايا الرئيسية الثلاثة ، هناك أنواع أخرى من الخلايا أقل دراسة في SV ، مثل خلايا المغزل 22 ، وخلايا الجذر^12,24 ، والبلاعم 25 ، والخلايا المحيطة 26 ، والخلايا البطانية 27 ، التي لها أدوار غير محددة بشكل كامل تتضمن التوازن الأيوني وتوليد EP ²⁸.

بالمقارنة مع تسلسل الحمض النووي الريبي السائب ، يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى (sNuc-Seq) معلومات حول عدم تجانس الخلية ، بدلا من متوسط mRNA عبر مجموعة من الخلايا²⁹ ، ويمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص عند دراسة SV³⁰ غير المتجانس. على سبيل المثال ، أنتجت sNuc-Seq تحليلا نسخيا يشير إلى أنه قد يكون هناك دور لخلايا المغزل والجذر في توليد EP وفقدان السمع ومرض Meniere¹⁸. يمكن أن يزودنا التوصيف النسخي الإضافي لأنواع خلايا SV المختلفة بمعلومات لا تقدر بثمن حول الفيزيولوجيا المرضية الكامنة وراء الآليات والأنواع الفرعية المختلفة لتقلب السمع وفقدان السمع المرتبط ب SV. إن حصاد هياكل الأذن الداخلية الحساسة هذه له أهمية قصوى لتحليل الأنسجة الأمثل.

في هذه الدراسة ، تم وصف نهج التشريح المجهري للوصول إلى السطور الوعائية وعزلها من قوقعة الفئران البالغة من أجل sNuc-Seq أو التلوين المناعي. مطلوب تشريح الفأر البالغ SV لفهم أنواع خلايا SV المختلفة وتوصيف دورها في السمع.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب والإجراءات على الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان التابعة للمعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية والمعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى ، المعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان التابعة للمعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية والمعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى ، المعاهد الوطنية للصحة. تم تنفيذ جميع الطرق وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة للجنة رعاية واستخدام الحيوان التابعة للمعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية والمعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى ، المعاهد الوطنية للصحة.

1. القتل الرحيم للحيوانات

1. استخدم الفئران المعدلة وراثيا C57BL / 6J أو Kcnj10-ZsGreen ، يوم ما بعد الولادة 30+ (P30+) ، والتي يتراوح وزنها بين 15-20 جم.
2. القتل الرحيم للفأر البالغ (العمر P30 أو أكبر) باستخدام بروتوكول معتمد (هنا CO₂ الاختناق). أداء قطع الرأس كخطوة ثانوية.
   ملاحظة: في حالة التلوين المناعي ، قد يكون لبعض الأجسام المضادة إشارة خلفية بسبب الارتباط غير المحدد بالدم في الشعيرات الدموية في SV. يمكن أن يعالج التروية القلبية مع المثبت هذه المشكلة عن طريق إزالة الدم من الشعيرات الدموية في SV. ومع ذلك ، يمكن لمعظم الأجسام المضادة تحقيق نتائج جيدة بدون هذه الطريقة ، ولن يتم تغطيتها في هذا البروتوكول.

2. فضح المتاهة العظمية

1. نظف الماوس عن طريق الرش بنسبة 70٪ من الإيثانول والمسح بمنشفة ورقية. إيلاء اهتمام خاص لمنطقة الرأس للحد من خطر التلوث. إزالة الجلد من الجمجمة عن طريق سحب الجلد نحو الأنف.
2. باستخدام مقص حاد ، قم بتقسيم الجمجمة على طول المستوى السهمي لفصل الأجزاء اليمنى واليسرى.
3. إزالة الدماغ من الجمجمة لكشف المتاهة العظمية.

3. استخراج الأذن الداخلية

1. تحديد الأذن الداخلية داخل العظم الصدغي (الشكل 2 أ) وكشط الأعصاب القحفية باستخدام # 55 ملقط.
   ملاحظة: يجب على المستخدم تثبيت العينة بيده غير المهيمنة باستخدام مجموعة ثانية من ملقط # 55. يمكن إمساك مناطق مختلفة من العينة بالملقط المثبت في جميع أنحاء التشريح إذا تم تجنب المناطق الحرجة من العينة (على سبيل المثال ، لا تسحق القوقعة).
2. باستخدام ملقط # 55 ، قم بتشريح الفقاعة والكبسولة ، وفصلها عن العظام المحيطة. قم بإزالة أي أنسجة رخوة متبقية من سطح الأذن الداخلية.
3. انقل العينة إلى طبق زراعة الأنسجة الصافية الذي يحتوي على 1x PBS بارد (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) ، ودرجة الحموضة 7.4 ، وضعها تحت نطاق تشريح (الشكل 2 ب).

4. تشريح SV

ملاحظة: مع الممارسة ، من الممكن تشريح SV كقطعة واحدة طويلة تشبه الشريط. SV هش ، لذلك إذا انقسم إلى قطع ، فقد يتم تخزينها معا. بدلا من ذلك ، يمكن تخزينها في آبار مصنفة بشكل منفصل وفقا لدورها (على سبيل المثال ، القاعدية والمتوسطة والقمية).

1. إذا كان من الممكن تحريك مصادر ضوء نطاق التشريح ، فضع ضوءا واحدا فوق الطبق ومصدر الضوء الثاني من الجانب ، بالتوازي مع سطح التشريح. هذا يسمح بتباين أفضل للأنسجة تحت عظم القوقعة.
2. باستخدام ملقط # 55 ، أمسك العينة من الجزء الدهليزي مع توجيه القوقعة لأعلى.
3. باستخدام ملقط # 55 ، اخترق عظم القوقعة في القمة.
   ملاحظة: # 5 ملقط أكثر سمكا من # 55 ويمكن استخدامه لكسر العظام ، لكن الزيادة في الحجم / القوة تضحي بصفاء الملقط والقدرة على التلاعب بالأنسجة الصغيرة. ضع في اعتبارك استخدام ملقط مصنوع من مادة مثل الإينو أو دوموستار لتجنب الضرر الذي قد يحدث للملقط الأكثر حساسية. تجنب دفع الملقط عميقا جدا تحت العظم لتجنب إتلاف SV.
4. باستخدام ملقط # 55 ، اكشط على طول المنعطف القمي (الشكل 2C) ، مع تطبيق قوة لطيفة لكسر قطع صغيرة من طبقة العظام الخارجية. ارفع العظم برفق وافصله عن الجدار الجانبي.
   ملاحظة: قد يكون من المفيد التفكير في هذا التشريح على أنه "إزالة كل شيء بعيدا عن SV" ، بدلا من "تشريح SV خارج القوقعة".
5. استمر في استخدام ملقط #55 لإزالة قطع عظم القوقعة من المنعطفات القمية والوسطى (الشكل 2D ، E). ادفع الجدار الجانبي برفق لأسفل ، وانزع قطع الجدار العظمي وأزلها باتجاه المنعطف الأوسط لكشف الجدار الجانبي للمنعطفات القمية والوسطى.
6. الاستمرار في استخدام ملقط # 55 ، ادفع الجدار الجانبي القمي برفق جانبا لفضح العقدة الحلزونية. افصل الجدار الجانبي للمنعطفات القمية والمتوسطة عن العقدة الحلزونية على طول طبقة خلايا الشعر الخارجية. إزالة قطع من العقدة الحلزونية من داخل القوقعة.
   ملاحظة: # 55 ملقط أصغر وتوفر ميزة عند التعامل مع الأنسجة الصغيرة والحساسة. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب ثنيها أو إتلافها.
7. للوصول بشكل أفضل إلى الجدار الجانبي للمنعطف القاعدي ، افصل القوقعة عن الجزء الدهليزي من العظم الصدغي باستخدام # 55 ملقط. ضع ملقط # 55 في النافذة المستديرة والبيضاوية وادفع لأسفل نحو الدهليز. سوف تنفصل القوقعة. قم بإزالة الجزء الدهليزي من الأذن الداخلية.
8. الاستمرار في استخدام # 55 ملقط ، قم الآن بإزالة قطع من عظم القوقعة القاعدية ، بدءا من منطقة الانعطاف الأوسط. ادفع طبقة الجدار الجانبي برفق أسفل العظم لفصلها.
9. قم بإزالة الجزء القاعدي الأبعد من الجدار الجانبي عن طريق التحديق وسحب الأنسجة برفق. قد يكون العظم في هذه المنطقة سميكا جدا بحيث لا يمكن إزالته دون إتلاف الأنسجة الرخوة أدناه.
10. الآن ، مع فصل الجزء القاعدي من الجدار الجانبي ، افصل أكبر قدر ممكن من الجدار الجانبي عن القوقعة. يمكن القيام بذلك عن طريق تتبع ملقط # 55 على طول الجدار الجانبي. قم بتنظيف الملقط برفق بين العظم والجدار الجانبي المتبقي. يمكن القيام بذلك على طول الطريق إلى القمة في قطعة واحدة إذا كان المستخدم من ذوي الخبرة. انقل الجدار الجانبي إلى برنامج تلفزيوني جديد.
    ملاحظة: على الرغم من أن القطع الأكبر من SV قد يكون من الأسهل تصويرها ، نظرا للطبيعة الحساسة للأنسجة ، يمكن التقاط قطع أصغر (الشكل 2F ، G) ، واعتمادا على الحجم ، يمكن أن تعمل أيضا للتصوير.
11. استخدم # 55 ملقط لوضع الجدار الجانبي بشكل مسطح. يجب أن يكون SV مرئيا كطبقة داكنة من الأنسجة على الجانب الداخلي للجدار الجانبي.
    ملاحظة: قد يجد المستخدمون ، خاصة بالقرب من النهاية القمية ، أن بعض أنسجة SV تنفصل عن الجدار الجانبي طوال فترة التشريح.
12. انزع طبقة SV برفق لفصلها عن الجدار الجانبي في نهايتها القاعدية (الشكل 2H). ادفع برفق SV المنفصل جانبا وحرك الملقط أكثر نحو الطرف القمي للجدار الجانبي ، وافصل SV كشريط طويل إن أمكن (الشكل 2I). لا تضغط على SV بالملقط لسحبه. إذا كان النسيج هشا جدا بحيث لا يمكن الإمساك به ، فيمكن بدلا من ذلك جمعه باستخدام مغرفة مناديل ، مثل مكشطة البردة.
    ملاحظة: يجب أن يتم تحريك SV دائما تحت المجهر الضوئي لضمان عدم فقده. كن حذرا دائما عند الاستيلاء باستخدام الملقط بسبب خطر التلف. قد يجد المستخدمون أن استخدام كشط البردة يخفف من خطر تلف أنسجة SV. لتسلسل النواة المفردة ، انتقل إلى القسم 5. بالنسبة للتلوين المناعي SV ، انتقل إلى القسم 7.

5. تعليق SV أحادي النواة

ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول لأنسجة SV على وجه التحديد من بروتوكول تعليق أحادي النواة للشركة المصنعة المنشورة. يمكن استخدام منصات من مختلف الصانعين³¹. نظرا للاختلاف الخاص بالنظام الأساسي ، يوصى بمراجعة البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة المقدم مع الجهاز. لتحقيق أفضل النتائج ل sNuc-Seq وتقليل تدهور الحمض النووي الريبي ، كلما كان تشريح الأنسجة أسرع كان ذلك أفضل (يوصى به في غضون 15-20 دقيقة من القتل الرحيم). قد يكون من المفيد القتل الرحيم لحيوان واحد في كل مرة وفقط عندما يكون جاهزا للتشريح. يمكن أن يؤدي وجود عدة أشخاص يعملون في وقت واحد على التشريح أيضا إلى القضاء على وقت التدهور (على سبيل المثال ، يعمل أحد موظفي المختبر على الأذن اليسرى بينما يعمل آخر على الأذن اليمنى).

1. إذا تم استخدام أنسجة SV ل sNuc-Seq ، فضع الأنسجة في محلول تحلل مبرد (10 mM Tris-HCl ، 10 mM NaCl ، 3 mM MgCl² ، 0.005٪ nonidet P40 في الماء الخالي من النيوكلياز).
   ملاحظة: إذا كان سيتم إجراء التسلسل مباشرة بعد التشريح ، فتابع البروتوكول. إذا كنت ترغب في إيقاف البروتوكول مؤقتا ، فيمكن الحفاظ على SV عن طريق وضع SV في RNAlater. يحفظ طوال الليل على حرارة 4 درجات مئوية ، ثم يوضع في الفلاش ويحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام. عندما تكون جاهزا للاستخدام ، قم بإذابة الثلج وغسله مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما ، ثم تابع التجانس (الخطوة 5.2).
2. تجانس الأنسجة في الخالط dounce 2 مل مع 10-20 السكتات الدماغية على الجليد.
   ملاحظة: ستتصل الأسطوانة الزجاجية يدويا بالجزء السفلي من الأنبوب الزجاجي ، مما يؤدي إلى تفتيت SV. SV حساس ، لذلك عادة ما تحقق 20 ضربة تجانسا ناجحا.
3. تحلل المنديل على الثلج لمدة 25 دقيقة.
   ملاحظة: يختلف وقت التحلل وفقا لنوع الأنسجة. قد يحقق التحلل لمدة 25 دقيقة في أنسجة SV قابلية منخفضة للخلية (أقل من 4٪) ، ولكن قد يتم تكييف الوقت إذا كانت صلاحية الخلية عالية جدا (الخطوة 5.8).
4. قم بالتصفية من خلال مرشح 30 ميكرومتر وقم بتدوير المرشح عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من محلول غسل النوى وإعادة التعليق (1x PBS ، 1٪ ألبومين مصل بقري [BSA] ، مثبط RNase 0.2U / μL).
6. قم بتصفية الخلايا من خلال مرشح 10 ميكرومتر وأجهزة طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
7. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليقها في 50 ميكرولتر من النوى والغسيل وإعادة التعليق العازلة.
8. عد النوى باستخدام عداد الخلية وتلطيخ التريبان الأزرق. تمييع 5 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 50 ميكرولتر من 1x PBS لعد الخلايا ؛ يجب أن تكون الجدوى ضئيلة (3٪ -4٪) في هذه المرحلة. إذا تبين أن الصلاحية أعلى ، فقم بتكييف البروتوكول للخطوة 5.3 (التحلل) وتوحيد وقت التحلل لضمان التحلل الكافي للخلايا.
   ملاحظة: تعني قابلية بقاء الخلية العالية في تحضير نواة واحدة أن هناك خلايا سليمة أكثر من المطلوب ، وقد تكون هناك حاجة إلى هضم إضافي.
9. قم بتحميل العينة بالكثافة النووية المطلوبة على جهاز / شريحة الشركة المصنعة (انظر دليل الشركات المصنعة). الالتقاط أحادي النوى جاهز الآن.
   ملاحظة: من فأر بالغ واحد SV ، عادة ما يتم تحقيق 50 ميكرولتر من المعلق بتركيز 150000 نواة / مل.

6. تسلسل SV أحادي النواة

1. إرسال العينات إلى المرفق الأساسي للتسلسل.
   ملاحظة: يتبع هذا الجزء من البروتوكول الخطوات العامة ل (1) توليد مستحلب الخرز الهلامي (GEM) والترميز الشريطي ، (2) تنظيف ما بعد GEM-RT وتضخيم cDNA ، و (3) 3 'بناء مكتبة التعبير الجيني. ما تبقى من بروتوكول sNuc-Seq طويل نسبيا ، ويوصى بأن يستخدم القراء بروتوكولهم الخاص بالشركة المصنعة. من المحتمل أن يصف دليل الشركة المصنعة الخطوات بتفاصيل محددة وصور مصاحبة. قد تكون هناك أيضا مقاطع فيديو "إرشادية" على موقع الشركة المصنعة. يمكن تمثيل مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها بطريقة مخفضة الأبعاد ، مثل تقريب وإسقاط مشعب موحد (UMAP; الشكل 3). تستخدم العديد من المختبرات نواة تسلسل قد تؤدي هذا البروتوكول للمستخدمين.

7. SV المناعي وتركيب الأنسجة

1. إذا تم استخدام الأنسجة للتلطيخ المناعي ، فقم بنقلها إلى صفيحة 24 بئرا ، مغمورة في 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في 1x PBS ، واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: من المفيد إجراء جميع عمليات إزالة السوائل والغسيل والبقع المناعية تحت المجهر. سيضمن التصور أثناء سحب الأنسجة عدم فقدانها عن طريق الخطأ أثناء إزالة السائل. يمكن تعديل أحجام الأجسام المضادة والغسالات طالما أن الحجم كبير بما يكفي لغمر أنسجة SV داخل المحلول.
2. بعد خطوة التثبيت ، قم بإزالة PFA عن طريق إجراء غسلتين قصيرتين في 1x PBS (حوالي 500 ميكرولتر) عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لكل منهما على شاكر مداري عند عدد دورات منخفض (30-50) دورة في الدقيقة. في حالة التخزين ، يمكن تخزين الأنسجة في 1x PBS عند 4 درجات مئوية.
3. قم بإزالة PBS وتخلل وحجب لمدة لا تقل عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في حوالي 300 ميكرولتر من محلول PBS-T (0.05 Tween20 في 1x PBS مع 10٪ مصل بقري جنيني).
   ملاحظة: يجب تخفيف الأجسام المضادة الأولية والثانوية في محلول الحجب هذا.
4. تلطيخ الأنسجة بالأجسام المضادة الأولية وفقا لمواصفات الجسم المضاد المستخدم ، عادة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة PBS المتبقي وإضافة الجسم المضاد الأساسي المخفف.
   ملاحظة: يجب اختيار التخفيف بناء على اقتراحات الشركة المصنعة والبيانات المنشورة والخبرة السابقة وما إلى ذلك. عادة ما يكون التركيز الأول للاختبار هو تخفيف 1: 100-200. بالنسبة للمثال المقدم في هذه الورقة ، تم تخفيف كل من الأجسام المضادة GS-IB4 و DAPI عند 1: 200. في حالة تلطيخ أكثر من بروتين واحد، يمكن دمج أجسام مضادة أولية متعددة في المحلول نفسه، طالما أن كل جسم مضاد أولي له مضيف مختلف لتجنب التفاعل المتبادل للأجسام المضادة الثانوية.
5. اغسل الجسم المضاد الأساسي من الأنسجة باستخدام ما يقرب من 500 ميكرولتر من 1x PBS مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما على شاكر مداري عند عدد دورات منخفض في الدقيقة.
   ملاحظة: استمر في التأكد من أن أنسجة SV مغمورة في المحلول ، وليست عالقة على جانب البئر.
6. بقعة مع الجسم المضاد الثانوي وفقا لمواصفات الجسم المضاد المعين المستخدم ، عادة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري عند عدد دورات منخفضة في الدقيقة. قم بتغطية اللوحة المكونة من 24 بئرا بحيث يكون الجسم المضاد الثانوي الموسوم بالفلورسنت محميا من الضوء.
   ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى أكثر من جسم مضاد ثانوي واحد ، فقم بدمج الأجسام المضادة الثانوية في نفس المحلول. تأكد من تجنب وضع العلامات المتقاطعة.
7. اغسل الجسم المضاد الثانوي من الأنسجة باستخدام ما يقرب من 500 ميكرولتر من 1x PBS أربع مرات لمدة 5 دقائق لكل منها على شاكر مداري عند عدد دورات منخفض في الدقيقة. حافظ على اللوحة المكونة من 24 بئرا مغطاة لحمايتها من الضوء.
8. قم بإعداد الشريحة الصغيرة الأكبر (75 مم × 25 مم) عن طريق وضع خطين صغيرين من الغراء على طول المحور 25 مم ، أصغر بقليل من غطاء زجاجي أصغر 18 مم × 18 مم. ضع قطرة واحدة من كاشف التركيب (حوالي 50 ميكرولتر) بين خطوط الغراء.
   ملاحظة: يخلق الغراء مساحة صغيرة من المساحة الرأسية بحيث عند وضع الغطاء الثاني في الأعلى ، يمكن أن توجد عينة أنسجة SV بأمان ، ولكنها تستمر في البقاء في مكانها. في حين أن سمك السطور هو 30-40 ميكرون ، يجب تجنب الضغط على الأنسجة بين الأسطح الزجاجية للحفاظ على التشكل. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام شريط شفاف.
9. باستخدام ملقط # 55 ، أمسك بأقل قدر ممكن من الأنسجة على أحد طرفي SV وانقله من PBS إلى قطرة كاشف التركيب على الشريحة الصغيرة الأكبر (75 مم × 25 مم). ضع أحد طرفي غطاء زجاجي أصغر (18 مم × 18 مم) على الشريحة حيث تم وضع خط واحد من الغراء وحرره برفق لتجنب تكوين فقاعات هواء. سوف يسقط غطاء الغطاء على خط الغراء الآخر وسيغطي نسيج SV.
10. أغلق الحامل عن طريق وضع قطرة من طلاء الأظافر الشفاف على كل ركن من أركان الحامل. قم بتسمية العينة وفقا لذلك على الغطاء الزجاجي بعيدا عن حقل التصور. إنه جاهز الآن للفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 4).
11. تصور أنسجة SV باستخدام مجهر تشريح للتأكد من أنها مسطحة وليست بالقرب من أي فقاعات هواء. إذا لم يتم توجيه نسيج SV بشكل صحيح ، يمكن للمستخدم محاولة دفع فقاعات الهواء أو إزالة الغطاء الزجاجي الأصغر بعناية وإعادة وضع SV. يجب أن يتم ذلك برفق لتجنب كسر أغطية الزجاج.

النتائج

نقدم طريقة لعزل SV لاستخدامها إما في sNuc-Seq أو تلطيخ المناعة. يمكن أن يساعد التشريح ذي الصلة (الشكل 1) للقوقعة بالنسبة إلى SV المستخدمين على فهم تنظيم SV وخطوات بروتوكول التشريح بشكل أفضل.

يتم تفصيل كل خطوة من خطوات هذا التشريح الدقيق ل SV من ماوس P30 في الفيديو المرت?...

Discussion

قبل ظهور تسلسل الخلية الواحدة ، استخدم العديد من الباحثين تحليل الأنسجة السائبة ، مما جعل من الممكن فقط تحليل النسخ المتوسط عبر الخلايا. على وجه الخصوص ، جعلت الخلية المفردة و sNuc-Seq من الممكن عزل نسخة خلية واحدة أو نواة واحدة ، على التوالي³². في هذه الحالة ، يمكن تحديد النسخ أحاد...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections