単核シーケンシングまたは免疫染色のための成体マウス脈条血管の解剖

要約

脈管筋は内蝸牛電位の生成に不可欠です。ここでは、単核シーケンシングまたは免疫染色のための成体マウス脈条血管の解剖を紹介します。

要約

脈管脈によって生成される内蝸牛電位は、適切な有毛細胞のメカノトランスダクション、そして最終的には聴覚を助長する環境を維持するために不可欠です。脈理血管の病状は聴力の低下をもたらす可能性があります。成体脈条血管の解剖は、焦点を絞った単一核捕捉とそれに続く単一核シーケンシングおよび免疫染色を可能にする。これらの技術は、単一細胞レベルで脈理血管の病態生理学を研究するために使用されます。

単一核シーケンシングは、脈管脈の転写解析の設定に使用できます。一方、免疫染色は、細胞の特定の集団を同定するのに引き続き有用です。どちらの方法も、前提条件として適切な脈理血管郭清を必要としますが、これは技術的に困難であることが判明する可能性があります。

概要

蝸牛は、スカラ前庭、スカラ中膜、およびスカラティンパニの3つの液体で満たされたチャンバーで構成されています。スカラ前庭とスカラティンパニにはそれぞれ外リンパが含まれており、外リンパには高濃度のナトリウム(138 mM)と低濃度のカリウム(6.8 mM)^{が含まれています1}。スカラ培地には内リンパが含まれており、内リンパには高濃度のカリウム(154 mM)と低濃度のナトリウム(0.91 mM)が含まれています^1,2,3。このイオン濃度の違いは、内蝸牛電位(EP)と呼ぶことができ、主に蝸牛の側壁に沿った脈管線条(SV)^のさまざまなイオンチャネルとギャップ結合を通るカリウムイオンの移動によって生成されます4,5,6,7,8,9,10,11

プロトコル

すべての動物実験および手順は、国立神経疾患および脳卒中研究所の動物管理および使用委員会および国立衛生研究所の難聴およびその他のコミュニケーション障害に関する国立研究所によって承認されたプロトコルに従って実施されました。すべての実験プロトコルは、国立神経疾患および脳卒中研究所の動物管理および使用委員会および国立衛生研究所の国立難聴およびその他のコミュニケーション障害研究所によって承認されました。すべての方法は、国立神経疾患および脳卒中研究所の動物管理および使用委員会および国立衛生研究所の国立難聴およびその他のコミュニケーション障害研究所の関連するガイドラインおよび規制に従って実施された。

1.動物の安楽死

1. C57BL / 6Jまたは Kcnj10-ZsGreenトランスジェニックマウス、生後30+(P30 +)、体重15〜20 gを使用します。
2. 承認されたプロトコル(ここではCO₂ 窒息)を使用して成体マウス(年齢P30以上)を安楽死させる。二次ステップとして斬首を実行します。
   注:免疫染色の場合、一部の抗体は、SVの毛細血管内の血液への非特異的結合のためにバックグラウンドシグナルを有する可能性があります。固定液による心臓灌流は、SVの毛細血管から血液を除去することによってこの問題に対処することができます。ただし、ほとんどの抗体はこの方法がなくても良好な結果を....

ディスカッション

シングルセルシーケンシングが登場する前は、多くの研究者がバルク組織分析を使用していましたが、細胞全体で平均化されたトランスクリプトームの分析しかできませんでした。特に、単一細胞およびsNuc-Seqは、それぞれ単一細胞または単一核のトランスクリプトームを単離することを可能にした³²。この場合、単一核トランスクリプトームは、辺縁細胞、中間細胞、およ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections