単核シーケンシングまたは免疫染色のための成体マウス脈条血管の解剖

要約

脈管筋は内蝸牛電位の生成に不可欠です。ここでは、単核シーケンシングまたは免疫染色のための成体マウス脈条血管の解剖を紹介します。

要約

脈管脈によって生成される内蝸牛電位は、適切な有毛細胞のメカノトランスダクション、そして最終的には聴覚を助長する環境を維持するために不可欠です。脈理血管の病状は聴力の低下をもたらす可能性があります。成体脈条血管の解剖は、焦点を絞った単一核捕捉とそれに続く単一核シーケンシングおよび免疫染色を可能にする。これらの技術は、単一細胞レベルで脈理血管の病態生理学を研究するために使用されます。

単一核シーケンシングは、脈管脈の転写解析の設定に使用できます。一方、免疫染色は、細胞の特定の集団を同定するのに引き続き有用です。どちらの方法も、前提条件として適切な脈理血管郭清を必要としますが、これは技術的に困難であることが判明する可能性があります。

概要

蝸牛は、スカラ前庭、スカラ中膜、およびスカラティンパニの3つの液体で満たされたチャンバーで構成されています。スカラ前庭とスカラティンパニにはそれぞれ外リンパが含まれており、外リンパには高濃度のナトリウム(138 mM)と低濃度のカリウム(6.8 mM)^{が含まれています1}。スカラ培地には内リンパが含まれており、内リンパには高濃度のカリウム(154 mM)と低濃度のナトリウム(0.91 mM)が含まれています^1,2,3。このイオン濃度の違いは、内蝸牛電位(EP)と呼ぶことができ、主に蝸牛の側壁に沿った脈管線条(SV)^のさまざまなイオンチャネルとギャップ結合を通るカリウムイオンの移動によって生成されます4,5,6,7,8,9,10,11 .SVは、蝸牛の側壁の内側を覆う不均一な高度に血管新生された組織であり、辺縁細胞、中間細胞、基底細胞の3つの主要な細胞タイプが含まれています¹²(図1)。

辺縁細胞はタイトジャンクションによって接続され、SVの最も内側の表面を形成します。頂端膜はスカラ中膜の内リンパに面しており、KCNE1/KCNQ1、SLC12A2、Na⁺-K^+-ATPアーゼ(NKA)5,10,13,14などの様々なチャネルを用いて内リンパへのカリウムイオン輸送に寄与しています。中間細胞は、辺縁細胞と基底細胞の間に存在し、KCNJ10(Kir 4.1)^15,16を用いてSVを介したカリウム輸送を促進する色素細胞である。基底細胞は蝸牛の側壁に近接しており、螺旋靭帯の線維細胞と密接に関連して外リンパからのカリウムリサイクルを促進する¹²。SVの病理は、多数の耳鼻咽喉科疾患に関与している^17,18。Kcnq1、Kcne1、Kcnj10、Cldn11などの主要なSV細胞型で発現する遺伝子の変異は、EP 19,20,21,22,23の喪失を含む難聴およびSV機能障害を引き起こす可能性があります。3つの主要な細胞型に加えて、SVには、紡錘細胞22、根細胞¹²、²⁴、マクロファージ25、周皮細胞26、内皮細胞²⁷など^、イオン恒常性と^EP28の生成を含む役割が不完全に定義された他の細胞タイプがあります。

バルクRNAシーケンシングと比較して、一核RNAシーケンシング(sNuc−Seq)は、細胞群²⁹にわたるmRNAの平均ではなく、細胞の不均一性に関する情報を提供し、異質^SV30を研究する場合に特に有用であり得る。たとえば、sNuc-Seqは、EP生成、難聴、およびメニエール病における紡錘体細胞と根細胞の役割がある可能性があることを示唆する転写分析を作成しました¹⁸。さまざまなSV細胞タイプのさらなる転写特性評価は、SV関連の聴力変動および難聴のさまざまなメカニズムおよびサブタイプの根底にある病態生理学に関する貴重な情報を提供します。これらの繊細な内耳構造の収穫は、最適な組織分析にとって最も重要です。

この研究では、sNuc-Seqまたは免疫染色のために成体マウス蝸牛から脈管線条にアクセスして分離するためのマイクロダイセクションアプローチについて説明します。成体マウスSVの解剖は、様々なSV細胞型を理解し、聴覚におけるそれらの役割をさらに特徴付けるために必要とされる。

プロトコル

すべての動物実験および手順は、国立神経疾患および脳卒中研究所の動物管理および使用委員会および国立衛生研究所の難聴およびその他のコミュニケーション障害に関する国立研究所によって承認されたプロトコルに従って実施されました。すべての実験プロトコルは、国立神経疾患および脳卒中研究所の動物管理および使用委員会および国立衛生研究所の国立難聴およびその他のコミュニケーション障害研究所によって承認されました。すべての方法は、国立神経疾患および脳卒中研究所の動物管理および使用委員会および国立衛生研究所の国立難聴およびその他のコミュニケーション障害研究所の関連するガイドラインおよび規制に従って実施された。

1.動物の安楽死

1. C57BL / 6Jまたは Kcnj10-ZsGreenトランスジェニックマウス、生後30+(P30 +)、体重15〜20 gを使用します。
2. 承認されたプロトコル(ここではCO₂ 窒息)を使用して成体マウス(年齢P30以上)を安楽死させる。二次ステップとして斬首を実行します。
   注:免疫染色の場合、一部の抗体は、SVの毛細血管内の血液への非特異的結合のためにバックグラウンドシグナルを有する可能性があります。固定液による心臓灌流は、SVの毛細血管から血液を除去することによってこの問題に対処することができます。ただし、ほとんどの抗体はこの方法がなくても良好な結果を達成でき、このプロトコルではカバーされません。

2.骨の迷路を露出させる

1. 70%エタノールをスプレーし、ペーパータオルで拭いてマウスをきれいにします。汚染のリスクを減らすために、ヘッド領域に特に注意してください。皮膚を鼻に向かって引っ張って、頭蓋骨から皮膚を取り除きます。
2. 鋭利なハサミを使用して、頭蓋骨を矢状面に沿って分割し、左右の部分を分離します。
3. 頭蓋骨から脳を取り除き、骨の迷路を露出させます。

3.内耳抽出

1. 側頭骨内の内耳を特定し(図2A)、#55鉗子を使用して脳神経をこすり落とします。
   注意: ユーザーは、#55鉗子の2番目のセットを使用して、利き手以外の手で試験片を安定させる必要があります。標本の重要な領域が回避されている場合(たとえば、蝸牛を押しつぶさないでください)、解剖全体で安定化鉗子で標本のさまざまな領域をつかむことができます。
2. #55鉗子を使用して、ブラとカプセルを解剖し、周囲の骨から取り外します。内耳の表面から残っている軟部組織を取り除きます。
3. 検体を1倍の冷PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、pH 7.4を含む透明な組織培養皿に移し、解剖スコープの下に置きます(図2B)。

4. SV解剖

注:練習すれば、SVをリボンに似た1つの長いピースとして解剖することができます。SVは壊れやすいので、バラバラになった場合は一緒に保管することもあります。あるいは、これらは、それらの順番(例えば、基底、中間、頂端)に応じて別々にラベル付けされたウェルに保存することができる。

1. 解剖スコープの光源を移動できる場合は、1つのライトを皿の上に置き、2番目の光源を側面から解剖面に平行に配置します。これにより、蝸牛骨の下の組織のコントラストが向上します。
2. #55鉗子を使用して、蝸牛を上に向けて前庭部分で標本を保持します。
3. #55鉗子を使用して、頂点の蝸牛骨を突き刺します。
   注:#5鉗子は#55よりも厚く、骨を折るために使用できますが、サイズ/強度の増加により、鉗子の細かさと小さな組織を操作する能力が犠牲になります。より繊細な鉗子に発生する可能性のある損傷を避けるために、inoxやdumostarなどの材料で作られた鉗子の使用を検討してください。SVの損傷を避けるために、鉗子を骨の下に深く押しすぎないようにしてください。
4. #55鉗子を使用して、頂端ターンに沿ってこすり(図2C)、穏やかな力を加えて外側の骨層の小片を剥がします。骨をそっと持ち上げて、側壁から外します。
   注:この解剖は、「SVを蝸牛から解剖する」のではなく、「SVからすべてを取り除く」と考えると役立つ場合があります。
5. 引き続き#55鉗子を使用して、頂端および中回転から蝸牛骨片を除去します(図2D、E)。側壁をそっと押し下げ、骨壁片を中央ターンに向かってこじ開けて取り外し、頂端と中間ターンの側壁を露出させます。
6. #55鉗子を使い続け、頂端ターン側壁をそっと脇に押して、らせん神経節を露出させます。頂端と中回転の側壁を外有毛細胞層に沿ってらせん神経節から切り離します。蝸牛の内側かららせん神経節の断片を取り除きます。
   注:#55鉗子は小さく、小さくて繊細な組織を操作するときに有利です。それらを曲げたり損傷したりしないように特別な注意を払う必要があります。
7. 基底ターンの側壁へのアクセスを改善するには、#55鉗子を使用して側頭骨の前庭部分から蝸牛を外します。#55鉗子を円形の楕円形の窓に入れ、前庭に向かって押し下げます。蝸牛が外れます。内耳の前庭部分を取り除きます。
8. #55鉗子を引き続き使用し、中央のターン領域から開始して、基底蝸牛の骨の断片を取り除きます。骨の下の側壁層をそっと押して取り外します。
9. 組織をこじ開けてそっと引っ張って、側壁の最も遠い基底部分を取り除きます。この領域の骨は、下の軟部組織を損傷せずに除去するには厚すぎる可能性があります。
10. 次に、側壁の基底部分を切り離した状態で、側壁をできるだけ蝸牛から分離します。これは、側壁に沿って#55鉗子をトレースすることによって行うことができます。骨と残りの側壁の間の鉗子をそっと磨きます。これは、ユーザーが経験があれば、頂点まで一度に行うことができます。側壁を新しいPBSに移動します。
    注:SVの大きい断片は画像化しやすい場合がありますが、組織の繊細な性質を考えると、小さな断片を撮影することができ(図2F、G)、サイズによっては画像化にも適しています。
11. #55鉗子を使用して、側壁を平らに置きます。SVは、側壁の内側にある組織のより暗い層として見えるはずです。
    注:ユーザーは、特に頂端に近づくと、SV組織の一部が解剖全体を通して側壁から偶然に剥離することに気付く場合があります。
12. SV層をそっとこじ開けて、基底端の側壁から取り外します(図2H)。取り外したSVをそっと脇に押し、鉗子を側壁の先端に向かってさらに動かし、可能であればSVを1つの長いリボンとして取り外します(図2I)。SVを鉗子で絞って引っ張らないでください。組織が壊れやすくてつかむことができない場合は、カロジーオンキュレットなどの組織スクープを使用して収集することもできます。
    注意: SVの移動は、紛失しないように、常に光学顕微鏡下で行う必要があります。鉗子を使用してつかむときは、損傷の危険性があるため、常に注意してください。ユーザーは、カレージオンキュレットを使用すると、SV組織の損傷のリスクが軽減されることに気付く場合があります。単一核シーケンシングの場合は、セクション5に進みます。SV免疫染色については、セクション7に進んでください。

5. SV単核サスペンション

注:このプロトコルは、特に公開されたメーカーの単一核懸濁プロトコルからSV組織に適合しています。異なるメーカーのプラットフォームを使用できます³¹。プラットフォーム固有のバリエーションを考えると、機器に付属のメーカー固有のプロトコルを確認することをお勧めします。sNuc-Seqの最適な結果を達成し、RNAの分解を最小限に抑えるには、組織解剖が速いほど良いです(安楽死から15〜20分以内に推奨)。一度に1匹の動物を安楽死させ、解剖する準備ができたときにのみ安楽死させると役立つ場合があります。複数の人が同時に解剖に取り組むことで、劣化時間をなくすこともできます(たとえば、1人のラボ担当者が左耳で作業し、別の検査員が右耳で作業します)。

1. SV組織をsNuc-Seqに使用する場合は、冷却溶解バッファー(ヌクレアーゼフリー水中の10 mM Tris-HCl、10 mM NaCl、3 mM MgCl²、0.005%ノニデットP40)に入れます。
   注:解剖直後にシーケンスを実行する場合は、プロトコルを続行します。プロトコルを一時停止したい場合は、SVをRNAlaterに入れることでSVの保存が可能です。4°Cで一晩保存した後、液体窒素で瞬間凍結し、使用できるようになるまで-80°Cで保管します。使用する準備ができたら、解凍してPBSで5回ずつ5分間洗浄してから、均質化に進みます(ステップ5.2)。
2. 2 mLのダウンスホモジナイザーで組織を氷上で10〜20ストロークでホモジナイズします。
   注意: ガラスシリンダーは手動でガラス管の底に接触し、SVを断片化します。SVはデリケートなので、通常20ストロークで均質化に成功します。
3. 組織を氷上で25分間溶解します。
   注:溶解時間は組織の種類によって異なります。SV組織で25分間溶解すると、低い細胞生存率(4%未満)を達成できますが、細胞生存率が高すぎる場合は時間を調整できます(ステップ5.8)。
4. 30 μmのフィルターでろ過し、ろ液を500 x g で4°Cで5分間回転させます。
5. 上清を除去し、細胞ペレットを1 mLの核洗浄液および再懸濁バッファー(1x PBS、1%ウシ血清アルブミン[BSA]、0.2U/μL RNase阻害剤)に再懸濁します。
6. 細胞を10 μmフィルターでろ過し、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
7. 上清を除去し、50 μLの核洗浄および再懸濁バッファーに再懸濁します。
8. セルカウンターとトリパンブルー染色を使用して核をカウントします。細胞計数のために、5 μLの細胞懸濁液を50 μLの1x PBSに希釈します。この時点で、実行可能性は最小限(3%〜4%)である必要があります。生存率が高いことが判明した場合は、ステップ5.3(溶解)のプロトコルを適応させ、溶解時間を標準化して細胞の適切な溶解を確保します。
   注:単一核調製物における高い細胞生存率は、必要以上に無傷の細胞が存在することを意味し、追加の消化が必要になる可能性があります。
9. 目的の核密度のサンプルをメーカーの装置/チップにロードします(メーカーガイドを参照)。これで、単一核の捕獲の準備が整いました。
   注:1匹の成体マウスSVから、通常、150,000 nuclei/mLの濃度で50 μLの懸濁液が得られます。

6. SV単核シーケンシング

1. シーケンシングのためにサンプルをコア施設に送ります。
   注:プロトコルのこの部分は、(1)ゲルビーズインエマルジョン(GEM)の生成とバーコード化、(2)GEM-RT後のクリーンアップとcDNA増幅、および(3)3'遺伝子発現ライブラリの構築の一般的な手順に従います。sNuc-Seq プロトコルの残りの部分は比較的長いため、読者は製造元固有のプロトコルを使用することをお勧めします。製造元ガイドでは、特定の詳細と付随する画像を含む手順が説明される可能性があります。製造元のWebサイトに「ハウツー」ビデオがある場合もあります。生成されたデータセットは、一様多様体近似および射影(UMAP; 図3)。多くのラボでは、ユーザーのためにこのプロトコルを実行する可能性のあるシーケンシングコアを利用しています。

7. SV免疫染色と組織マウント

1. 組織を免疫染色に使用する場合は、24ウェルプレートに移し、1x PBS中の200 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)に浸し、室温で20分間インキュベートします。
   注:すべての液体除去、洗浄、および免疫染色を顕微鏡の下で行うことは有用です。組織をピペッティングしながら視覚化することで、液体除去中に誤って組織が失われることがなくなります。抗体および洗浄液の容量は、SV組織を溶液内に沈めるのに十分な容量である限り調整することができる。
2. 固定ステップの後、1x PBS(約500 μL)中で4°Cで低(30-50)RPMのオービタルシェーカー上でそれぞれ5分間、2回の短い洗浄を行ってPFAを除去します。保存する場合、組織は4°Cで1x PBSに保存できます。
3. PBSを除去し、約300 μLのPBS-T溶液(10%ウシ胎児血清を含む1x PBS中の0.05 Tween20)で室温で最低1時間透過処理およびブロックします。
   注:一次抗体と二次抗体は、このブロッキング溶液で希釈する必要があります。
4. 使用する特定の抗体の仕様に従って一次抗体で組織を染色し、通常は4°Cで一晩投与する。残りのPBSを除去し、希釈した一次抗体を添加します。
   注:希釈は、メーカーの提案、公開データ、以前の経験などに基づいて選択する必要があります。通常、テストする最初の濃度は1:100-200希釈です。この論文で提示した例では、GS-IB4抗体とDAPI抗体をそれぞれ1:200で希釈しました。複数のタンパク質を染色する場合、二次抗体の交差反応性を避けるために、各一次抗体が異なる宿主を有する限り、複数の一次抗体を同じ溶液に組み合わせることができます。
5. 約500 μLの1x PBSを低RPMのオービタルシェーカーで10分間ずつ2回使用して、一次抗体を組織から洗い流します。
   注意: SV組織が溶液に沈められ、ウェルの側面に詰まっていないことを引き続き確認してください。
6. 使用する特定の抗体の仕様に従って二次抗体で染色し、通常は低RPMのオービタルシェーカー上で室温で2時間染色します。蛍光タグ付きの二次抗体が光から保護されるように、24ウェルプレートを覆います。
   注:複数の二次抗体が必要な場合は、二次抗体を同じ溶液に結合します。クロスラベリングは避けてください。
7. 約500 μLの1x PBSを低RPMのオービタルシェーカーで5分間ずつ4回使用して、組織から二次抗体を洗い流します。24ウェルプレートは、光から保護するためにカバーしたままにしてください。
8. 18 mm x 18 mm小さいガラスカバースリップよりもわずかに小さい、25 mm軸に沿って2本の小さな接着剤の縞を配置して、大きなマイクロスライド(75 mm x 25 mm)を準備します。1滴の封入試薬(約50μL)を接着剤の筋の間に置きます。
   注:接着剤は少量の垂直方向のスペースを作成するため、2番目のカバーガラスを上に置くと、SV組織サンプルは安全に存在することができますが、所定の位置に留まり続けます。線条体の厚さは30〜40ミクロンですが、形態を維持するためにガラス表面間の組織を圧迫することは避けてください。あるいは、透明なテープを使用してもよい。
9. #55鉗子を使用して、SVの一端の組織をできるだけ少なくつかみ、PBSから大きなマイクロスライド(75 mm x 25 mm)上のマウント試薬の滴に移します。小さなガラスカバースリップ(18 mm x 18 mm)の一方の端を、接着剤の1本の筋が置かれたスライドに置き、気泡が発生しないようにゆっくりと解放します。カバーガラスは他の接着剤の筋に落ち、SV組織を覆います。
10. マウントの各コーナーに透明なマニキュアを一滴軽くたたき、マウントを密封します。それに応じて、視覚化フィールドから離れたガラスカバースリップに試料にラベルを付けます。これで、共焦点顕微鏡の準備が整いました(図4)。
11. 解剖顕微鏡を使用してSV組織を視覚化し、気泡の近くに平らに置かれていないことを確認します。SV組織が正しく配向していない場合、ユーザーは気泡を押し出すか、小さなガラスカバースリップを慎重に取り外してSVの位置を変えることができます。これは、ガラスのカバースリップを壊さないように穏やかに行う必要があります。

結果

sNuc-Seqまたは免疫染色に使用するSVを単離する方法を紹介します。SVに関連する蝸牛の関連する解剖学的構造(図1)は、ユーザーがSVの構成と解剖プロトコルのステップをよりよく理解するのに役立ちます。

P30マウスからのSVのこのマイクロダイセクションの各ステップは、関連するビデオで詳しく説明されており、この解剖とSVの分離の主要なステッ?...

ディスカッション

シングルセルシーケンシングが登場する前は、多くの研究者がバルク組織分析を使用していましたが、細胞全体で平均化されたトランスクリプトームの分析しかできませんでした。特に、単一細胞およびsNuc-Seqは、それぞれ単一細胞または単一核のトランスクリプトームを単離することを可能にした³²。この場合、単一核トランスクリプトームは、辺縁細胞、中間細胞、およ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections