Disección de estrías vasculares de ratón adulto para secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción

Resumen

La estría vascular es vital para la generación de potencial endococlear. Aquí, presentamos la disección de la estría vascular del ratón adulto para la secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción.

Resumen

El potencial endococlear, que es generado por la estría vascular, es esencial para mantener un entorno propicio para la mecanotransducción adecuada de las células ciliadas y, en última instancia, la audición. Las patologías de la estría vascular pueden resultar en una disminución de la audición. La disección de la estría vascular adulta permite la captura focalizada de un solo núcleo y la posterior secuenciación e inmunotinción de un solo núcleo. Estas técnicas se utilizan para estudiar la fisiopatología de la estría vascular a nivel unicelular.

La secuenciación de un solo núcleo se puede utilizar en el contexto del análisis transcripcional de la estría vascular. Mientras tanto, la inmunotinción sigue siendo útil para identificar poblaciones específicas de células. Ambos métodos requieren una disección adecuada de la estría vascular como requisito previo, lo que puede resultar técnicamente desafiante.

Introducción

La cóclea consiste en tres cámaras llenas de líquido, la scala vestibuli, la scala media y la scala tympani. La scala vestibuli y la scala tympani contienen perilinfa, que tiene una alta concentración de sodio (138 mM) y una baja concentración de potasio (6,8 mM)¹. La escala media contiene endolinfa, que tiene una alta concentración de potasio (154 mM) y una baja concentración de sodio (0,91 mM)^1,2,3. Esta diferencia en la concentración de iones puede denominarse potencial endococlear (EP), y se genera principalmente por el movimiento de iones de potas....

Protocolo

Todos los experimentos y procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerd....

Discusión

Antes del advenimiento de la secuenciación de células individuales, muchos investigadores utilizaron el análisis de tejido a granel, que solo hizo posible analizar transcriptomas promediados en las células. En particular, la célula única y sNuc-Seq permitieron aislar el transcriptoma de una sola célula o de un solo núcleo, respectivamente³². En este caso, se pueden identificar transcriptomas de un solo núcleo para células marginales, intermedias y basales, así como para células fusifor.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections