解剖成年小鼠血管纹以进行单核测序或免疫染色

摘要

血管纹对于内耳蜗电位的产生至关重要。在这里，我们介绍了成年小鼠血管纹的解剖以进行单核测序或免疫染色。

摘要

由血管纹产生的内耳蜗电位对于维持有利于适当的毛细胞机械转导和最终听力的环境至关重要。血管纹的病变可导致听力下降。解剖成体血管纹可以集中捕获单核，随后进行单核测序和免疫染色。这些技术用于在单细胞水平上研究血管纹的病理生理学。

单核测序可用于血管纹的转录分析。同时，免疫染色在识别特定细胞群方面仍然有用。这两种方法都需要适当的血管纹夹层作为先决条件，这可能被证明在技术上具有挑战性。

引言

耳蜗由三个充满液体的腔室组成，即前庭鳞片、中鳞片和鼓鳞片。前庭鳞片和鼓鳞片均含有外淋巴液，其具有高浓度的钠（138 mM）和低浓度的钾（6.8 mM）¹。Scala介质含有内淋巴液，其具有高浓度的钾（154mM）和低浓度的钠（0.91mM）^1,2,3。这种离子浓度的差异可以称为耳蜗内电位（EP），主要是由钾离子沿着耳蜗侧壁通过血管纹（SV）中的各种离子通道和间隙连接产生的4,5,6,7,8,9,10,11 .SV是一种异质的，高度血管化的组织，排列在耳蜗侧壁的内侧，包含三种主要细胞类型：边缘细胞，中间细胞和基底细胞¹²（

研究方案

所有动物实验和程序均按照美国国立神经系统疾病和中风研究所动物护理和使用委员会以及国立卫生研究院国家耳聋和其他沟通障碍研究所批准的协议进行。所有实验方案均由美国国立神经系统疾病和中风研究所动物护理和使用委员会以及美国国立卫生研究院国家耳聋和其他沟通障碍研究所批准。所有方法均按照美国国立神经系统疾病和中风研究所动物护理和使用委员会以及国立卫生研究院国家耳聋和其他沟通障碍研究所的相关指南和规定进行。

1. 动物安乐死

1. 使用C57BL / 6J或 Kcnj10-ZsGreen转基因小鼠，出生后第30 +天（P30 +），重量在15-20g之间。
2. 使用批准的方案对成年小鼠（P30 岁或以上）实施安乐死（此处为 CO₂ 窒息）。执行斩首作为次要步骤。
   注意：如果进行免疫染色，由于与SV毛细血管中的血液非特异性结合，某些抗体可能具有背景信号。用固定剂进行心脏灌注可以通过从SV毛细血管中去除血液来解决这个问题。但是，大多数抗体可以在没有这种方法的情况下获得良好的结果，并且不会在本协议中涵盖。

2. 露出骨迷宫

1. 通过喷洒70%乙醇并用纸巾擦拭来清洁鼠标。特别注意头部区域以降低污染风险。通过将皮肤拉向鼻子来去除颅骨上的皮肤。
2. 使用锋利的剪....

讨论

在单细胞测序出现之前，许多研究人员使用批量组织分析，这只能分析跨细胞平均的转录组。特别是，单细胞和sNuc-Seq使得分离单细胞或单核的转录组成为可能，分别³²。在这种情况下，可以鉴定边缘细胞、中间细胞和基底细胞以及梭形细胞的单核转录组³⁰。这使得能够研究SV细胞类型之间的转录异质性，并可用于将来研究这些细胞类型对SV功能的贡献，包括EP的?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections