Tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için yetişkin fare stria vascularis'in diseksiyonu

Özet

Stria vascularis, endokoklear potansiyelin oluşumu için hayati öneme sahiptir. Burada, yetişkin fare stria vascularis'in tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için diseksiyonu sunulmuştur.

Özet

Stria vascularis tarafından üretilen endokoklear potansiyel, uygun saç hücresi mekanotransdüksiyonuna ve nihayetinde işitmeye elverişli bir ortamı korumak için gereklidir. Stria vascularisin patolojileri işitmenin azalmasına neden olabilir. Erişkin stria vaskülarisin diseksiyonu, odaklanmış tek çekirdekli yakalamaya ve ardından tek çekirdekli dizileme ve immün boyamaya izin verir. Bu teknikler stria vascularis patofizyolojisini tek hücre düzeyinde incelemek için kullanılır.

Tek çekirdekli dizileme, stria vascularisin transkripsiyonel analizi ayarında kullanılabilir. Bu arada, immün boyama, spesifik hücre popülasyonlarını tanımlamada yararlı olmaya devam etmektedir. Her iki yöntem de ön koşul olarak uygun stria vascularis diseksiyonu gerektirir ve bu da teknik olarak zor olabilir.

Giriş

Koklea sıvı dolu üç odadan oluşur: scala vestibuli, scala media ve scala timpani. Scala vestibuli ve scala timpaninin her biri, yüksek konsantrasyonda sodyum (138 mM) ve düşük konsantrasyonda potasyum (6,8 mM)¹ içeren perilenf içerir. Scala ortamı, yüksek konsantrasyonda potasyum (154 mM) ve düşük konsantrasyonda sodyum (0,91 mM)^1,2,3 içeren endolenf içerir. İyon konsantrasyonundaki bu fark endokoklear potansiyel (EP) olarak adlandırılabilir ve esas olarak potasyum iyonlarının çeşitli iyon kanalları ve stria vascularis'teki (SV) boşluk kavşakları boyun....

Protokol

Tüm hayvan deneyleri ve prosedürleri, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi ve Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirilmiştir. Tüm deneysel protokoller, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından onaylanmıştır. Tüm yöntemler, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri'n....

Tartışmalar

Tek hücreli dizilemenin ortaya çıkmasından önce, birçok araştırmacı toplu doku analizi kullandı, bu da sadece hücreler arasında ortalama transkriptomları analiz etmeyi mümkün kıldı. Özellikle, tek hücreli ve sNuc-Seq, sırasıyla tek bir hücrenin veya tek çekirdeğin transkriptomunu izole etmeyi mümkün kılmıştır³². Bu örnekte, marjinal, ara ve bazal hücrelerin yanı sıra iğ hücreleri³⁰ için tek çekirdekli transkriptomlar tanımlanabilir. Bu.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections