Tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için yetişkin fare stria vascularis'in diseksiyonu

Özet

Stria vascularis, endokoklear potansiyelin oluşumu için hayati öneme sahiptir. Burada, yetişkin fare stria vascularis'in tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için diseksiyonu sunulmuştur.

Özet

Stria vascularis tarafından üretilen endokoklear potansiyel, uygun saç hücresi mekanotransdüksiyonuna ve nihayetinde işitmeye elverişli bir ortamı korumak için gereklidir. Stria vascularisin patolojileri işitmenin azalmasına neden olabilir. Erişkin stria vaskülarisin diseksiyonu, odaklanmış tek çekirdekli yakalamaya ve ardından tek çekirdekli dizileme ve immün boyamaya izin verir. Bu teknikler stria vascularis patofizyolojisini tek hücre düzeyinde incelemek için kullanılır.

Tek çekirdekli dizileme, stria vascularisin transkripsiyonel analizi ayarında kullanılabilir. Bu arada, immün boyama, spesifik hücre popülasyonlarını tanımlamada yararlı olmaya devam etmektedir. Her iki yöntem de ön koşul olarak uygun stria vascularis diseksiyonu gerektirir ve bu da teknik olarak zor olabilir.

Giriş

Koklea sıvı dolu üç odadan oluşur: scala vestibuli, scala media ve scala timpani. Scala vestibuli ve scala timpaninin her biri, yüksek konsantrasyonda sodyum (138 mM) ve düşük konsantrasyonda potasyum (6,8 mM)¹ içeren perilenf içerir. Scala ortamı, yüksek konsantrasyonda potasyum (154 mM) ve düşük konsantrasyonda sodyum (0,91 mM)^1,2,3 içeren endolenf içerir. İyon konsantrasyonundaki bu fark endokoklear potansiyel (EP) olarak adlandırılabilir ve esas olarak potasyum iyonlarının çeşitli iyon kanalları ve stria vascularis'teki (SV) boşluk kavşakları boyunca kokleanın lateral duvarı boyunca hareketi ile üretilir 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV, kokleanın lateral duvarının medial yönünü kaplayan heterojen, yüksek vaskülarize bir dokudur ve üç ana hücre tipi içerir: marjinal, orta ve bazal hücreler¹² (Şekil 1).

Marjinal hücreler, SV'nin en medial yüzeyini oluşturmak için sıkı bağlantılarla bağlanır. Apikal membran, scala media'nın endolenfine bakar ve KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 ve Na + -K ⁺ -ATPaz (NKA) ^5,10,13,14 dahil olmak üzere çeşitli kanalları kullanarak endolenf içine potasyum iyonu taşınmasına katkıda bulunur. Ara hücreler, marjinal ve bazal hücreler arasında bulunan ve KCNJ10 (Kir 4.1)^15,16 kullanarak SV yoluyla potasyum taşınmasını kolaylaştıran pigmentli hücrelerdir. Bazal hücreler kokleanın lateral duvarına yakın bir yerde bulunur ve perilenf^12'den potasyum geri dönüşümünü teşvik etmek için spiral ligamentin fibrositleri ile yakından ilişkilidir. SV'nin patolojisi çok sayıda otolojik bozuklukla ilişkilendirilmiştir^17,18. Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 ve Cldn11 gibi majör SV hücre tiplerinde eksprese edilen genlerdeki mutasyonlar, EP 19,20,21,22,23 kaybı da dahil olmak üzere sağırlık ve SV disfonksiyonuna neden olabilir. Üç ana hücre tipine ek olarak, SV'de, iğ hücreleri 22, kök hücreler^12,24, makrofajlar 25, perisitler 26 ve endotel hücreleri 27 gibi^, iyonik homeostazı ve EP ²⁸ oluşumunu içeren eksik tanımlanmış rollere sahip daha az çalışılmış başka hücre tipleri de vardır.

Toplu RNA dizilimine kıyasla, tek çekirdekli RNA dizilimi (sNuc-Seq), bir grup hücre^29'daki mRNA'nın ortalamasından ziyade hücre heterojenliği hakkında bilgi sağlar ve heterojen SV^30'u incelerken özellikle yararlı olabilir. Örneğin, sNuc-Seq, EP üretiminde, işitme kaybında ve Meniere hastalığında iğ ve kök hücrelerin rolü olabileceğini düşündüren transkripsiyonel analiz üretmiştir¹⁸. Çeşitli SV hücre tiplerinin daha ileri transkripsiyonel karakterizasyonu, SV ile ilişkili işitme dalgalanması ve işitme kaybının farklı mekanizmalarının ve alt tiplerinin altında yatan patofizyoloji hakkında bize paha biçilmez bilgiler sağlayabilir. Bu hassas iç kulak yapılarının toplanması, optimal doku analizi için büyük önem taşımaktadır.

Bu çalışmada, sNuc-Seq veya immün boyama için stria vaskülaris'e erişen ve izole eden yetişkin fare kokleasından izole etmek için mikrodiseksiyon yaklaşımı tanımlanmıştır. Yetişkin fare SV'nin diseksiyonu, çeşitli SV hücre tiplerini anlamak ve işitmedeki rollerini daha da karakterize etmek için gereklidir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri ve prosedürleri, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi ve Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirilmiştir. Tüm deneysel protokoller, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından onaylanmıştır. Tüm yöntemler, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin ilgili kılavuz ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hayvan ötenazisi

1. 15-20 g ağırlığında C57BL / 6J veya Kcnj10-ZsGreen transgenik fareler, doğum sonrası gün 30+ (P30+) kullanın.
2. Onaylanmış bir protokol kullanarak yetişkin bir fareyi (P30 yaş ve üstü) ötenazi yapın (burada CO₂ boğulması). İkincil bir adım olarak kafa kesmeyi gerçekleştirin.
   NOT: İmmün boyama varsa, SV'nin kılcal damarlarındaki kana spesifik olmayan bağlanma nedeniyle bazı antikorlar arka plan sinyaline sahip olabilir. Fiksatif ile kardiyak perfüzyon, SV'nin kılcal damarlarından kan alarak bu sorunu çözebilir. Bununla birlikte, çoğu antikor bu yöntem olmadan iyi sonuçlar elde edebilir ve bu protokolde ele alınmayacaktır.

2. Kemikli labirentin açığa çıkarılması

1. Fareyi% 70 etanol püskürterek ve bir kağıt havluyla silerek temizleyin. Kontaminasyon riskini azaltmak için kafa bölgesine özellikle dikkat edin. Cildi buruna doğru çekerek cildi kafatasından çıkarın.
2. Keskin makas kullanarak, sol ve sağ kısımları ayırmak için kafatasını orta sagital düzlem boyunca bölün.
3. Kemikli labirenti ortaya çıkarmak için beyni kafatasından çıkarın.

3. İç kulak çekimi

1. Temporal kemik içindeki iç kulağı tanımlayın (Şekil 2A) ve #55 forseps kullanarak kraniyal sinirleri kazıyın.
   NOT: Kullanıcı, ikinci bir #55 forseps seti kullanarak numuneyi baskın olmayan elleriyle stabilize etmelidir. Numunenin kritik alanlarından kaçınılırsa, diseksiyon boyunca stabilize edici forseps ile numunenin farklı alanları tutulabilir (örneğin, kokleayı ezmeyin).
2. # 55 forseps kullanarak, bulla ve kapsülü parçalara ayırın, onları çevreleyen kemikten ayırın. Kalan yumuşak dokuları iç kulak yüzeyinden çıkarın.
3. Numuneyi 1x soğuk PBS (fosfat tamponlu salin), pH 7.4 içeren berrak bir doku kültürü kabına aktarın ve bir diseksiyon kapsamı altına yerleştirin (Şekil 2B).

4. SV diseksiyonu

NOT: Uygulamada, SV'yi bir kurdeleye benzeyen uzun bir parça olarak incelemek mümkündür. SV kırılgandır, bu nedenle parçalara ayrılırsa, bunlar birlikte saklanabilir. Alternatif olarak, bunlar sıralarına göre ayrı ayrı etiketlenmiş kuyucuklarda saklanabilir (örneğin, bazal, orta, apikal).

1. Diseksiyon kapsamı ışık kaynakları hareket ettirilebiliyorsa, bir ışığı çanağın üzerine ve ikinci ışık kaynağını diseksiyon yüzeyine paralel olarak yandan yerleştirin. Bu, koklear kemiğin altındaki dokunun daha iyi bir kontrastını sağlar.
2. #55 forseps kullanarak, numuneyi koklea yukarı bakacak şekilde vestibüler kısımdan tutun.
3. #55 forseps kullanarak, tepedeki koklear kemiği delin.
   NOT: # 5 forseps, # 55'ten daha kalındır ve kemiği kırmak için kullanılabilir, ancak boyut / güçteki artış, forsepslerin inceliğini ve küçük dokuları manipüle etme yeteneğini feda eder. Daha hassas forsepslerde oluşabilecek hasarı önlemek için inox veya dumostar gibi bir malzemeden yapılmış forseps kullanmayı düşünün. SV'ye zarar vermemek için forsepsleri kemiğin altına çok derin itmekten kaçının.
4. # 55 forseps kullanarak, apikal dönüş boyunca kazıyın (Şekil 2C), dış kemik tabakasının küçük parçalarını ayırmak için hafif bir kuvvet uygulayın. Kemiği yavaşça kaldırın ve yanal duvardan ayırın.
   NOT: Bu diseksiyonu "SV'yi kokleanın dışına çıkarmak" yerine "SV'den her şeyi çıkarmak" olarak düşünmek yararlı olabilir.
5. Koklear kemik parçalarını apikal ve orta dönüşlerden çıkarmak için #55 forseps kullanmaya devam edin (Şekil 2D, E). Yanal duvarı yavaşça aşağı iterek, apikal ve orta dönüşlerin lateral duvarını ortaya çıkarmak için kemik duvar parçalarını orta dönüşe doğru gözetin ve çıkarın.
6. # 55 forseps kullanmaya devam ederek, spiral ganglionu ortaya çıkarmak için apikal dönüş yanal duvarını yavaşça bir kenara itin. Apikal ve orta dönüşlerin lateral duvarını, dış kıl hücresi tabakası boyunca spiral gangliondan ayırın. Spiral ganglion parçalarını kokleanın içinden çıkarın.
   NOT: # 55 forseps daha küçüktür ve küçük ve hassas dokuları manipüle ederken avantaj sağlar. Bükülmelerini veya zarar görmelerini önlemek için ekstra özen gösterilmelidir.
7. Bazal dönüşün lateral duvarına daha iyi erişebilmek için, kokleayı #55 forseps kullanarak temporal kemiğin vestibüler kısmından ayırın. #55 forsepsleri yuvarlak ve oval pencereye koyun ve girişe doğru aşağı doğru itin. Koklea ayrılacaktır. İç kulağın vestibüler kısmını çıkarın.
8. #55 forseps kullanmaya devam ederek, şimdi orta dönüş bölgesinden başlayarak bazal koklear kemik parçalarını çıkarın. Yanal duvar tabakasını ayırmak için kemiğin altına yavaşça itin.
9. Yanal duvarın en uzak bazal kısmını, dokuyu meraklandırarak ve hafifçe çekerek çıkarın. Bu bölgedeki kemik, aşağıdaki yumuşak dokuya zarar vermeden çıkarılamayacak kadar kalın olabilir.
10. Şimdi, lateral duvarın bazal kısmı ayrılmışken, lateral duvarın mümkün olduğunca çoğunu kokleadan ayırın. Bu, yanal duvar boyunca # 55 forsepsleri izleyerek yapılabilir. Forsepsleri kemik ile kalan lateral duvar arasında yavaşça fırçalayın. Bu, kullanıcı deneyimliyse tek parça halinde tepeye kadar yapılabilir. Yanal duvarı taze PBS'ye taşıyın.
    NOT: SV'nin daha büyük parçalarının görüntülenmesi daha kolay olsa da, dokuların hassas doğası göz önüne alındığında, daha küçük parçalar alınabilir (Şekil 2F, G) ve boyuta bağlı olarak görüntüleme için de kullanılabilir.
11. Yanal duvarı düz bir şekilde döşemek için # 55 forseps kullanın. SV, yanal duvarın iç tarafında daha koyu bir doku tabakası olarak görülebilmelidir.
    NOT: Kullanıcılar, özellikle apikal uca daha yakın bir yerde, SV dokusunun bir kısmının diseksiyon boyunca tesadüfen lateral duvardan ayrıldığını görebilirler.
12. SV tabakasını bazal ucundaki yanal duvardan ayırmak için yavaşça kaldırın (Şekil 2H). Ayrılmış SV'yi yavaşça bir kenara itin ve forsepsleri lateral duvarın apikal ucuna doğru hareket ettirin, mümkünse SV'yi uzun bir şerit olarak ayırın (Şekil 2I). SV'yi çekmek için forseps ile sıkmayın. Doku yakalanamayacak kadar kırılgansa, alternatif olarak şalazyon küreti gibi bir doku kepçesi kullanılarak toplanabilir.
    NOT: SV'nin taşınması, kaybolmamasını sağlamak için her zaman ışık mikroskobu altında yapılmalıdır. Hasar riski nedeniyle forseps kullanarak yakalarken her zaman dikkatli olun. Kullanıcılar, şalazyon küreti kullanmanın SV dokusuna zarar verme riskini azalttığını görebilirler. Tek çekirdekli dizileme için, bölüm 5'e geçin. SV immün boyama için bölüm 7'ye geçin.

5. SV tek çekirdekli süspansiyon

NOT: Bu protokol, SV dokusu için özellikle yayınlanmış bir üreticinin tek çekirdekli süspansiyon protokolünden uyarlanmıştır. Farklı üreticilerin platformları kullanılabilir³¹. Platforma özgü varyasyon göz önüne alındığında, ekipmanla birlikte sağlanan üreticiye özgü protokolün gözden geçirilmesi önerilir. sNuc-Seq için en uygun sonuçları elde etmek ve RNA yıkımını en aza indirmek için, doku diseksiyonu ne kadar hızlı olursa o kadar iyidir (ötenaziden 15-20 dakika içinde önerilir). Bir seferde bir hayvanı ötenazi yapmak ve sadece disseke etmeye hazır olduğunda yararlı olabilir. Diseksiyonlar üzerinde aynı anda birden fazla kişinin çalışması da bozulma süresini ortadan kaldırabilir (örneğin, bir laboratuvar personeli sol kulakta çalışırken, diğeri sağ kulakta çalışır).

1. SV dokusu sNuc-Seq için kullanılacaksa, dokuyu soğutulmuş lizis tamponuna yerleştirin (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl², nükleaz içermeyen suda% 0.005 nonidet P40).
   NOT: Diseksiyondan hemen sonra sekanslama yapılacaksa, protokole devam edin. Protokolün duraklatılması istenirse, SV'nin RNAlater'a yerleştirilmesiyle SV koruması mümkündür. Gece boyunca 4 ° C'de saklayın, ardından sıvı azotta dondurun ve kullanıma hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın. Kullanıma hazır olduğunda, PBS'de her biri 5 dakika boyunca iki kez çözün ve yıkayın, ardından homojenizasyona devam edin (adım 5.2).
2. Buz üzerinde 10-20 vuruşla 2 mL'lik bir sıçrama homojenizatöründe dokuyu homojenize edin.
   NOT: Cam silindir, SV'yi parçalayarak cam tüpün tabanına manuel olarak temas edecektir. SV hassastır, bu nedenle 20 strok genellikle başarılı homojenizasyon sağlar.
3. Dokuyu 25 dakika boyunca buz üzerinde lize edin.
   NOT: Lizis süresi doku tipine göre değişir. SV dokusunda 25 dakikalık bir lizis, düşük bir hücre canlılığı (% 4'ten az) elde edebilir, ancak hücre canlılığı çok yüksekse zaman adapte edilebilir (adım 5.8).
4. 30 μm'lik bir filtreden süzün ve filtreyi 500 x g'de 4 ° C'de 5 dakika döndürün.
5. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 1 mL çekirdek yıkama ve resüspansiyon tamponunda (1x PBS,% 1 sığır serum albümini [BSA], 0.2U / μL RNaz inhibitörü) yeniden askıya alın.
6. Hücreleri 10 μm'lik bir filtreden geçirin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın.
7. Süpernatantı çıkarın ve 50 μL çekirdek yıkama ve yeniden süspansiyon tamponunda yeniden askıya alın.
8. Bir hücre sayacı ve tripan mavisi boyama kullanarak çekirdekleri sayın. Hücre sayımı için hücre süspansiyonunun 5 μL'sini 50 μL 1x PBS'ye seyreltin; Bu noktada canlılık minimum düzeyde (%3-%4) olmalıdır. Canlılığın daha yüksek olduğu tespit edilirse, protokolü adım 5.3 (lizis) için uyarlayın ve hücrelerin yeterli parçalanmasını sağlamak için lizis süresini standartlaştırın.
   NOT: Tek bir çekirdek preparatında yüksek hücre canlılığı, istenenden daha fazla sağlam hücre olduğu ve ek sindirim gerekebileceği anlamına gelir.
9. İstenilen nükleer yoğunluktaki numuneyi üreticinin cihazına/çipine yükleyin (üretici kılavuzuna bakın). Tek çekirdekli yakalamalar artık hazır.
   NOT: Bir yetişkin fare SV'den, genellikle 150.000 çekirdek/mL konsantrasyonda süspansiyonun 50 μL'si elde edilir.

6. SV tek çekirdekli dizileme

1. Örnekleri sıralama için çekirdek tesise gönderin.
   NOT: Protokolün bu kısmı, (1) jel boncuk içinde emülsiyon (GEM) üretimi ve barkodlama, (2) GEM-RT sonrası temizleme ve cDNA amplifikasyonu ve (3) 3' gen ekspresyon kütüphanesi yapımının genel adımlarını izlemektedir. sNuc-Seq protokolünün geri kalanı nispeten uzundur ve okuyucuların üreticiye özgü protokollerini kullanmaları önerilir. Üretici kılavuzu büyük olasılıkla belirli ayrıntıları ve beraberindeki görüntüleri içeren adımları açıklayacaktır. Üreticinin web sitesinde 'nasıl yapılır' videoları da olabilir. Oluşturulan veri kümeleri, tek tip manifold yaklaşımı ve projeksiyonu gibi boyutsal olarak azaltılmış bir şekilde temsil edilebilir (UMAP; Şekil 3). Birçok laboratuvar, kullanıcılar için bu protokolü gerçekleştirebilecek bir sıralama çekirdeği kullanır.

7. SV immün boyama ve doku montajı

1. Doku immün boyama için kullanılacaksa, 24 delikli bir plakaya aktarın, 1x PBS'de 200 μL% 4 paraformaldehit (PFA) içine batırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
   NOT: Tüm sıvı giderme, yıkama ve immün boyama işlemlerini mikroskop altında yapmak yararlıdır. Pipetleme sırasında dokuyu görselleştirmek, sıvının çıkarılması sırasında yanlışlıkla kaybolmamasını sağlayacaktır. Antikorların ve yıkamaların hacimleri, hacim SV dokusunu çözelti içine batıracak kadar büyük olduğu sürece ayarlanabilir.
2. Sabitleme adımından sonra, düşük (30-50) RPM'de bir orbital çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca 4 ° C'de 1x PBS'de (yaklaşık 500 μL) iki kısa yıkama yaparak PFA'yı çıkarın. Saklanıyorsa, doku 4 ° C'de 1x PBS'de saklanabilir.
3. PBS'yi çıkarın ve yaklaşık 300 μL PBS-T çözeltisinde (% 10 fetal sığır serumu ile 1x PBS'de 0.05 Tween20) oda sıcaklığında en az 1 saat geçirgenleştirin ve bloke edin.
   NOT: Birincil ve ikincil antikorlar bu bloke edici çözelti içinde seyreltilmelidir.
4. Dokuyu, kullanılan belirli antikorun özelliklerine göre, genellikle gece boyunca 4 ° C'de birincil antikor ile lekeleyin. Kalan PBS'yi çıkarın ve seyreltilmiş birincil antikoru ekleyin.
   NOT: Seyreltme, üretici önerilerine, yayınlanan verilere, önceki deneyimlere vb. Göre seçilmelidir. Genellikle, test edilecek ilk konsantrasyon 1:100-200 seyreltmedir. Bu makalede sunulan örnekte, GS-IB4 ve DAPI antikorlarının her biri 1:200'de seyreltilmiştir. Birden fazla protein için boyama yapılırsa, ikincil antikorların çapraz reaktivitesini önlemek için her birincil antikorun farklı bir konakçısı olduğu sürece, birden fazla birincil antikor aynı çözeltide birleştirilebilir.
5. Birincil antikoru, düşük RPM'de bir orbital çalkalayıcıda her biri 10 dakika boyunca iki kez yaklaşık 500 μL 1x PBS kullanarak dokudan yıkayın.
   NOT: SV dokusunun çözeltiye batırıldığından ve kuyunun yan tarafına sıkışmadığından emin olmaya devam edin.
6. Kullanılan belirli bir antikorun özelliklerine göre ikincil bir antikor ile leke, genellikle düşük RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 2 saat boyunca. 24 delikli plakayı örtün, böylece floresan olarak etiketlenmiş ikincil antikor ışıktan korunur.
   NOT: Birden fazla ikincil antikora ihtiyaç duyulursa, ikincil antikorları aynı çözeltide birleştirin. Çapraz etiketlemeden kaçındığınızdan emin olun.
7. İkincil antikoru, düşük RPM'de bir orbital çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca dört kez yaklaşık 500 μL 1x PBS kullanarak dokudan yıkayın. 24 delikli plakayı ışıktan korumak için kapalı tutun.
8. 25 mm eksen boyunca, 18 mm x 18 mm daha küçük cam kapak kaymasından sadece daha küçük olan iki küçük yapıştırıcı çizgisi yerleştirerek daha büyük mikro slaytı (75 mm x 25 mm) hazırlayın. Tutkal çizgilerinin arasına bir damla montaj reaktifi (yaklaşık 50 μL) yerleştirin.
   NOT: Tutkal az miktarda dikey alan oluşturur, böylece ikinci kapak kayması üste yerleştirildiğinde, SV doku örneği güvenli bir şekilde var olabilir, ancak yerinde kalmaya devam edebilir. Stria kalınlığı 30-40 mikron iken, morfolojiyi korumak için cam yüzeyler arasındaki dokunun sıkılmasından kaçınılmalıdır. Alternatif olarak, şeffaf bant da kullanılabilir.
9. #55 forseps kullanarak, SV'nin bir ucunda mümkün olduğunca az doku tutun ve PBS'den daha büyük mikroslayttaki (75 mm x 25 mm) montaj reaktifinin damlasına aktarın. Daha küçük bir cam kapak kapağının (18 mm x 18 mm) bir ucunu, bir yapıştırıcı çizgisinin yerleştirildiği slayta yerleştirin ve hava kabarcıkları oluşturmamak için yavaşça serbest bırakın. Kapak kayması diğer tutkal çizgisine düşecek ve SV dokusunu kaplayacaktır.
10. Montajın her köşesine bir damla şeffaf oje sürerek montajı kapatın. Numuneyi, görselleştirme alanından uzaktaki cam kapak üzerinde uygun şekilde etiketleyin. Artık konfokal mikroskopi için hazırdır (Şekil 4).
11. SV dokusunu, herhangi bir hava kabarcığının yakınında değil, düz bir şekilde uzandığından emin olmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak görselleştirin. SV dokusu doğru yönlendirilmemişse, kullanıcı hava kabarcıklarını dışarı itmeyi deneyebilir veya daha küçük cam kapak kaymasını dikkatlice çıkarabilir ve SV'yi yeniden konumlandırabilir. Bu, cam kapakların kırılmasını önlemek için nazikçe yapılmalıdır.

Sonuçlar

Bu çalışmada, SV'yi sNuc-Seq veya immün boyama için kullanılacak şekilde izole etmek için bir yöntem sunuyoruz. Kokleanın SV'ye göre ilgili anatomisi (Şekil 1), kullanıcıların SV'nin organizasyonunu ve diseksiyon protokolünün adımlarını daha iyi anlamalarına yardımcı olabilir.

SV'nin bir P30 fareden bu mikrodiseksiyonunun her adımı ilişkili videoda detaylandırılmıştır ve SV'nin bu diseksiyonu ve izolasyonunun temel adımlarının anl...

Tartışmalar

Tek hücreli dizilemenin ortaya çıkmasından önce, birçok araştırmacı toplu doku analizi kullandı, bu da sadece hücreler arasında ortalama transkriptomları analiz etmeyi mümkün kıldı. Özellikle, tek hücreli ve sNuc-Seq, sırasıyla tek bir hücrenin veya tek çekirdeğin transkriptomunu izole etmeyi mümkün kılmıştır³². Bu örnekte, marjinal, ara ve bazal hücrelerin yanı sıra iğ hücreleri³⁰ için tek çekirdekli transkriptomlar tanımlanabilir. Bu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections