דיסקציה של Stria vascularis עכבר בוגר עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining

Summary

הסטריה וסקולריס חיונית ליצירת הפוטנציאל האנדוקוכליארי. כאן, אנו מציגים את הדיסקציה של העכבר הבוגר stria vascularis עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining.

Abstract

הפוטנציאל האנדוקוכליארי, אשר נוצר על ידי כלי הדם stria, הוא חיוני כדי לשמור על סביבה תורמת mechanotransduction תאי שיער מתאים ובסופו של דבר שמיעה. פתולוגיות של כלי הדם stria יכול לגרום לירידה בשמיעה. דיסקציה של הסטריה וסקולריס הבוגרת מאפשרת לכידה ממוקדת של גרעין יחיד ולאחר מכן ריצוף גרעין יחיד וצביעת חיסון. טכניקות אלה משמשות לחקר פתופיזיולוגיה של סטריה וסקולריס ברמת התא היחיד.

ריצוף גרעין יחיד יכול לשמש בהגדרה של ניתוח שעתוק של כלי הדם stria. בינתיים, צביעת מערכת החיסון ממשיכה להיות שימושית בזיהוי אוכלוסיות ספציפיות של תאים. שתי השיטות דורשות דיסקציה נכונה של stria vascularis כתנאי מוקדם, אשר יכול להוכיח להיות מאתגר מבחינה טכנית.

Introduction

השבלול מורכב משלושה תאים מלאים בנוזל, סקאלה וסטיבולי, סקאלה מדיה וסקלה טימפני. סקאלה וסטיבולי וסקלה טימפאני מכילים כל אחד פרילימפה, אשר יש ריכוז גבוה של נתרן (138 mM) וריכוז נמוך של אשלגן (6.8 mM)¹. מדיה סקאלה מכיל endolymph, אשר יש ריכוז גבוה של אשלגן (154 mM) וריכוז נמוך של נתרן (0.91 mM)^1,2,3. הבדל זה בריכוז היונים יכול להיקרא פוטנציאל אנדוקוכליארי (EP), והוא נוצר בעיקר על ידי תנועה של יוני אשלגן דרך תעלות יונים שונות וצמתים מרווחים בסטריה וסקולריס (SV) לאורך הדופן הצידית של השבלול 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV היא רקמה הטרוגנית, מאוד וסקולרית, שמרפדת את האספקט המדיאלי של הדופן הצידית של השבלול ומכילה שלושה סוגי תאים עיקריים: תאים שוליים, תאי ביניים ותאי בסיס¹² (איור 1).

תאי שוליים מחוברים על ידי צמתים הדוקים כדי ליצור את המשטח המדיאלי ביותר של SV. הממברנה האפיקלית פונה לאנדולימפה של מדיה סקאלה ותורמת להעברת יוני אשלגן לתוך האנדולימפה באמצעות ערוצים שונים, כולל KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 ו-Na+-K⁺-ATPase (NKA)^5,10,13,14. תאי ביניים הם תאים פיגמנטיים השוכנים בין תאים שוליים לתאי בסיס ומאפשרים העברת אשלגן דרך SV באמצעות KCNJ10 (Kir 4.1)^15,16. תאי הבסיס נמצאים בסמיכות לדופן הצידית של השבלול וקשורים קשר הדוק עם פיברוציט של הרצועה הספירלית כדי לקדם מחזור אשלגן מהפרילימפה¹². פתולוגיה של SV הייתה מעורבת בהפרעות אוטולוגיות רבות^17,18. מוטציות בגנים המתבטאים בסוגי תאי SV העיקריים, כגון Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 ו-Cldn11, עלולות לגרום לחירשות ולתפקוד לקוי של SV, כולל אובדן EP 19,20,21,22,23. בנוסף לשלושת סוגי התאים העיקריים, ישנם סוגי תאים אחרים פחות נחקרים ב-SV, כגון תאי ציר 22, תאי שורש^12,24, מקרופאגים 25, פריציטים 26 ותאי אנדותל 27^, שיש להם תפקידים לא מוגדרים לחלוטין הקשורים להומאוסטזיס יוני וליצירת EP ²⁸.

בהשוואה לריצוף רנ"א בתפזורת, ריצוף רנ"א חד-גרעיני (sNuc-Seq) מספק מידע על הטרוגניות התא, ולא ממוצע של mRNA על פני קבוצת תאים²⁹, ויכול להיות שימושי במיוחד כאשר חוקרים את SV³⁰ ההטרוגני. לדוגמה, sNuc-Seq הפיק ניתוח שעתוק המצביע על כך שייתכן שיש תפקיד לתאי ציר ושורש ביצירת EP, אובדן שמיעה ומחלת מנייר¹⁸. אפיון שעתוק נוסף של סוגי תאי SV השונים יכול לספק לנו מידע רב ערך על הפתופיזיולוגיה העומדת בבסיס מנגנונים ותת-סוגים שונים של תנודות שמיעה הקשורות ל-SV ואובדן שמיעה. הקציר של מבני האוזן הפנימית העדינים הללו הוא בעל חשיבות עליונה לניתוח רקמות אופטימלי.

במחקר זה מתוארת גישת המיקרודיסקציה לגישה ולבידוד של כלי הדם הסטריה משברלול העכבר הבוגר עבור sNuc-Seq או immunostaining. דיסקציה של SV עכבר בוגר נדרשת כדי להבין סוגים שונים של תאי SV ולאפיין עוד יותר את תפקידם בשמיעה.

Protocol

כל הניסויים וההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי והמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכונים הלאומיים לבריאות. כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי והמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכונים הלאומיים לבריאות. כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות של הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי והמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכונים הלאומיים לבריאות.

1. המתת חסד של בעלי חיים

1. השתמש C57BL/6J או Kcnj10-ZsGreen עכברים טרנסגניים, יום לאחר הלידה 30+ (P30+), כי לשקול בין 15-20 גרם.
2. יש להרדים עכבר בוגר (מגיל P30 ומעלה) באמצעות פרוטוקול מאושר (כאן חנק CO₂ ). בצע עריפת ראש כשלב משני.
   הערה: במקרה של immunostaining, נוגדנים מסוימים עשויים להיות אות רקע עקב קשירה לא ספציפית לדם בנימים של SV. זילוח לב עם קיבוע יכול לטפל בבעיה זו על ידי הסרת דם מן הנימים של SV. עם זאת, רוב הנוגדנים יכולים להשיג תוצאות טובות ללא שיטה זו, וזה לא יהיה מכוסה בפרוטוקול זה.

2. חשיפת מבוך גרמי

1. נקו את העכבר על ידי ריסוס באתנול 70% וניגוב במגבת נייר. שימו לב במיוחד לאזור הראש כדי להפחית את הסיכון לזיהום. הסר את העור מהגולגולת על ידי משיכת העור לכיוון האף.
2. בעזרת מספריים חדים, פצלו את הגולגולת לאורך מישור הקשת האמצעית כדי להפריד בין החלק השמאלי לחלק הימני.
3. הסר את המוח מהגולגולת כדי לחשוף את המבוך הגרמי.

3. מיצוי האוזן הפנימית

1. זהו את האוזן הפנימית בתוך העצם הרקתית (איור 2A) וגרדו את עצבי הגולגולת באמצעות מלקחיים #55.
   הערה: המשתמש צריך לייצב את הדגימה עם היד הלא דומיננטית שלו באמצעות קבוצה שנייה של #55 מלקחיים. אזורים שונים של הדגימה עשויים להיתפס עם המלקחיים המייצבים לאורך כל הדיסקציה אם נמנעים מאזורים קריטיים של הדגימה (למשל, לא למחוץ את השבלול).
2. באמצעות #55 מלקחיים, לנתח את הבולה ואת הקפסולה, לנתק אותם מן העצם שמסביב. יש להסיר את שאריות הרקמה הרכה משטח האוזן הפנימית.
3. העבירו את הדגימה לצלחת תרבית רקמה שקופה המכילה 1x PBS קר (מלח חוצץ פוספט), pH 7.4, והניחו תחת תחום דיסקציה (איור 2B).

4. דיסקציה SV

הערה: עם תרגול, ניתן לנתח את SV כמו חתיכה אחת ארוכה הדומה לסרט. ה-SV שביר, כך שאם הוא נשבר לחתיכות, ניתן לאחסן אותן יחד. לחלופין, ניתן לאחסן אותם בבארות המסומנות בנפרד בהתאם לתורם (למשל, בזאלי, אמצעי, אפיקלי).

1. אם ניתן להזיז את מקורות האור של טווח הדיסקציה, הניחו מקור אור אחד מעל הצלחת ואת מקור האור השני מהצד, במקביל למשטח הניתוח. זה מאפשר ניגודיות טובה יותר של הרקמה מתחת לעצם השבלול.
2. באמצעות מלקחיים #55, החזיקו את הדגימה בחלק שיווי המשקל כשהשבלול פונה כלפי מעלה.
3. באמצעות #55 מלקחיים, לחדור דרך עצם השבלול בקודקוד.
   הערה: #5 מלקחיים עבים יותר מ #55 וניתן להשתמש בהם לשבירת עצם, אך הגידול בגודל / כוח מקריב את עדינות המלקחיים ואת היכולת לתפעל רקמות קטנות. שקול להשתמש במלקחיים העשויים מחומר כגון inox או dumostar כדי למנוע נזק שעלול להתרחש למלקחיים עדינים יותר. הימנע מדחיפת המלקחיים עמוק מדי מתחת לעצם כדי למנוע נזק ל- SV.
4. באמצעות מלקחיים #55, גרדו לאורך הסיבוב האפי (איור 2C), תוך הפעלת כוח עדין כדי לשבור חתיכות קטנות של שכבת העצם החיצונית. הרימו בעדינות את העצם ונתקו אותה מהדופן הצידית.
   הערה: ייתכן שיהיה מועיל לחשוב על נתיחה זו כעל "הסרת הכל מה-SV", במקום "לנתח את ה-SV מתוך השבלול".
5. המשיכו להשתמש במלקחיים #55 כדי להסיר חתיכות עצם שבלול מהפניות האפיקליות והאמצעיות (איור 2D,E). דוחפים בעדינות את הקיר הרוחבי, מחטטים ומסירים חתיכות דופן עצם לכיוון הפנייה האמצעית כדי לחשוף את הקיר הצידי של הסיבובים האפיקליים והאמצעיים.
6. ממשיכים להשתמש במלקחיים #55, דוחפים בעדינות את הקיר הצידי של הסיבוב האפי הצידה כדי לחשוף את הגנגליון הספירלי. נתקו את הדופן הצידית של סיבובים אפיים ואמצעיים מהגנגליון הספירלי לאורך שכבת תא השערה החיצונית. הסר חתיכות של גנגליון ספירלי מתוך השבלול.
   הערה: #55 מלקחיים קטנים יותר ומספקים יתרון בעת מניפולציה של רקמות קטנות ועדינות. יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע כיפוף או פגיעה בהם.
7. כדי לקבל גישה טובה יותר לדופן הצידית של סיבוב הבסיס, נתק את השבלול מהחלק הווסטיבולרי של העצם הטמפורלית באמצעות מלקחיים #55. הכניסו את המלקחיים #55 לחלון העגול והסגלגל ודחפו כלפי מטה לכיוון הפרוזדור. השבלול יתנתק. הסר את החלק הווסטיבולרי של האוזן הפנימית.
8. המשך שימוש #55 מלקחיים, עכשיו להסיר חתיכות של עצם השבלול הבסיסית, החל מאזור הסיבוב האמצעי. דחפו בעדינות את שכבת הדופן הצידית מתחת לעצם כדי לנתק אותה.
9. הסר את החלק הבסיסי הרחוק ביותר של הדופן הצידית על ידי חטטנות ומשיכה עדינה של הרקמה. העצם באזור זה עשויה להיות עבה מכדי שניתן יהיה להסיר אותה מבלי לפגוע ברקמה הרכה שמתחתיה.
10. כעת, כאשר החלק הבסיסי של הדופן הצידית מנותק, יש להפריד ככל האפשר את הדופן הצידית מהשבלול. ניתן לעשות זאת על ידי מעקב אחר המלקחיים #55 לאורך הקיר הרוחבי. מברישים בעדינות את המלקחיים בין העצם לדופן הצידית הנותרת. ניתן לעשות זאת עד לשיא בחתיכה אחת אם המשתמש מנוסה. העבר את הקיר הצידי ל- PBS טרי.
    הערה: אף על פי שחתיכות SV גדולות יותר עשויות להיות קלות יותר לצילום, בהתחשב באופי העדין של הרקמות, ניתן לצלם חתיכות קטנות יותר (איור 2F,G), ובהתאם לגודל, הן יכולות לעבוד גם להדמיה.
11. השתמש #55 מלקחיים כדי להניח את הקיר לרוחב שטוח. ה- SV צריך להיראות כשכבה כהה יותר של רקמה בצד הפנימי של הקיר הצידי.
    הערה: משתמשים עשויים לגלות, במיוחד קרוב יותר לקצה האפיקאלי, שחלק מרקמת SV מתנתקת אגב מהדופן הצידית לאורך כל הדיסקציה.
12. חטטו בעדינות בשכבת SV כדי לנתק אותה מהדופן הצידית בקצה הבסיסי שלה (איור 2H). דחפו הצידה בעדינות את ה-SV המנותק והזיזו את המלקחיים עוד יותר לכיוון הקצה האפי של הקיר הצידי, תוך ניתוק ה-SV כסרט אחד ארוך במידת האפשר (איור 2I). אין לסחוט את ה-SV עם מלקחיים כדי למשוך אותו. אם הרקמה שברירית מכדי שניתן יהיה לתפוס אותה, ניתן לחילופין לאסוף אותה באמצעות סקופ רקמה, כגון גרידת כלזיון.
    הערה: הזזת SV צריכה להיעשות תמיד תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח שהוא לא יאבד. היזהר תמיד בעת אחיזה באמצעות מלקחיים בשל הסיכון לנזק. משתמשים עשויים לגלות כי שימוש בגרידת chalazion מפחית את הסיכון לנזק לרקמת SV. לריצוף גרעין יחיד, המשך לסעיף 5. עבור SV immunostaining, המשך לסעיף 7.

5. מתלה SV בעל גרעין יחיד

הערה: פרוטוקול זה מותאם לרקמת SV במיוחד מפרוטוקול השעיה של גרעין יחיד של יצרן שפורסם. ניתן להשתמש בפלטפורמות של יצרנים שונים³¹. בהינתן וריאציה ספציפית לפלטפורמה, מומלץ לסקור את הפרוטוקול הספציפי ליצרן שסופק עם הציוד. כדי להשיג תוצאות אופטימליות עבור sNuc-Seq ולמזער את פירוק ה-RNA, ככל שדיסקציה של הרקמה מהירה יותר כך טוב יותר (מומלץ תוך 15-20 דקות מהמתת חסד). זה עשוי להיות מועיל להרדים בעל חיים אחד בכל פעם ורק כאשר מוכן לנתח. העובדה שמספר אנשים עובדים בו זמנית על הנתיחות יכולה גם למנוע את זמן ההשפלה (למשל, צוות מעבדה אחד עובד על אוזן שמאל בעוד שאחר עובד על אוזן ימין).

1. אם רקמת SV תשמש עבור sNuc-Seq, מקם את הרקמה במאגר ליזה מקורר (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl², 0.005% nonidet P40 במים ללא נוקלאז).
   הערה: אם יש לבצע ריצוף מיד לאחר הנתיחה, המשך את הפרוטוקול. אם רוצים להשהות את הפרוטוקול, שימור SV אפשרי על ידי הכנסת SV ל-RNAlater. יש לאחסן למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C, ולאחר מכן להקפיא במהירות הבזק בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש מוכן. כאשר המוצר מוכן לשימוש, יש להפשיר ולשטוף פעמיים ב-PBS למשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן להמשיך בהומוגניזציה (שלב 5.2).
2. הומוגניזציה של הרקמה בהומוגנייזר 2 מ"ל עם 10-20 פעימות על קרח.
   הערה: גליל הזכוכית יבוא במגע ידני עם תחתית צינור הזכוכית ויקטע את ה-SV. SV הוא עדין, ולכן 20 שבץ בדרך כלל משיג הומוגניזציה מוצלחת.
3. מפזרים את הרקמה על קרח במשך 25 דקות.
   הערה: זמן הליזה משתנה בהתאם לסוג הרקמה. ליזה של 25 דקות ברקמת SV עשויה להשיג כדאיות תאים נמוכה (פחות מ -4%), אך הזמן עשוי להיות מותאם אם הכדאיות התאית גבוהה מדי (שלב 5.8).
4. סנן דרך מסנן 30 מיקרומטר וסובב את התסנין ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
5. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 1 מ"ל של גרעינים לשטוף חיץ השעיה (1x PBS, 1% אלבומין בסרום בקר [BSA], 0.2U / μL מעכב RNase).
6. סנן את התאים דרך מסנן 10 מיקרומטר וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
7. הסר את supernatant ו resuspend ב 50 μL של גרעינים לשטוף ואת חיץ התלייה.
8. ספרו את הגרעינים באמצעות מונה תאים וצביעה כחולה טריפאן. לדלל 5 μL של תרחיף התא לתוך 50 μL של 1x PBS לספירת תאים; הכדאיות צריכה להיות מינימלית (3%-4%) בשלב זה. אם הכדאיות נמצאה גבוהה יותר, התאימו את הפרוטוקול לשלב 5.3 (ליזיס) ותקננו את זמן הליזה כדי להבטיח ליזה נאותה של התאים.
   הערה: יכולת קיום גבוהה של תאים בהכנת גרעין יחיד פירושה שיש יותר תאים שלמים מהרצוי, וכי ייתכן שיהיה צורך בעיכול נוסף.
9. טען את הדגימה עם הצפיפות הגרעינית הרצויה על המנגנון/שבב של היצרן (ראה מדריך יצרנים). לכידות של גרעינים בודדים מוכנות כעת.
   הערה: מעכבר בוגר אחד SV, 50 μL של התרחיף בריכוז של 150,000 גרעינים/מ"ל מושגת בדרך כלל.

6. ריצוף גרעין יחיד SV

1. שלח את הדגימות למתקן הליבה לריצוף.
   הערה: חלק זה של הפרוטוקול עוקב אחר השלבים הכלליים של (1) יצירה וקידוד של חרוזי ג'ל בתחליב (GEM), (2) ניקוי לאחר GEM-RT והגברת cDNA, ו-(3) בניית ספריית ביטוי גנים 3 אינץ'. שאר פרוטוקול sNuc-Seq ארוך יחסית, ומומלץ לקוראים להשתמש בפרוטוקול הספציפי ליצרן שלהם. סביר להניח שמדריך היצרן יתאר שלבים עם פרטים ספציפיים ותמונות נלוות. ייתכנו גם סרטוני 'כיצד לבצע' באתר היצרן. מערכי נתונים שנוצרו עשויים להיות מיוצגים באופן מופחת ממדים, כגון קירוב סעפת אחיד והקרנה (UMAP; איור 3). מעבדות רבות משתמשות בליבת ריצוף שעשויה לבצע פרוטוקול זה עבור משתמשים.

7. SV immunostaining והרכבת רקמות

1. אם הרקמה תשמש לצביעת חיסון, העבירו אותה לצלחת בת 24 בארות, שקועה ב-200 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-1x PBS, ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: כדאי לבצע את כל ההסרה, השטיפה והצביעה החיסונית של נוזלים מתחת למיקרוסקופ. הדמיה תוך כדי פיפטינג הרקמה תבטיח שהיא לא תאבד בטעות במהלך הסרת נוזלים. ניתן להתאים את נפחי הנוגדנים והשטיפות כל עוד הנפח גדול מספיק כדי להטביע את רקמת SV בתוך התמיסה.
2. לאחר שלב הקיבוע, הסר את ה- PFA על ידי ביצוע שתי שטיפות קצרות ב- 1x PBS (כ- 500 μL) ב- 4 ° C למשך 5 דקות כל אחת על שייקר מסלול בסל"ד נמוך (30-50). אם מאחסנים, ניתן לאחסן את הרקמה ב-1x PBS ב-4°C.
3. יש להסיר את ה-PBS ולחדור ולחסום למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר בכ-300 מיקרוליטר של תמיסת PBS-T (0.05 Tween20 ב-1x PBS עם 10% נסיוב בקר עוברי).
   הערה: יש לדלל נוגדנים ראשוניים ומשניים בתמיסת חסימה זו.
4. מכתימים את הרקמה בנוגדן ראשוני בהתאם למפרט של הנוגדן המסוים בו משתמשים, בדרך כלל לילה ב 4 מעלות צלזיוס . הסר את PBS הנותרים והוסף את הנוגדן הראשוני המדולל.
   הערה: יש לבחור את הדילול על סמך הצעות היצרן, הנתונים שפורסמו, ניסיון קודם וכו'. בדרך כלל, הריכוז הראשון שיש לבדוק הוא דילול של 1:100-200. לדוגמה המוצגת במאמר זה, נוגדני GS-IB4 ו- DAPI דוללו כל אחד בשעה 1:200. אם מכתימים יותר מחלבון אחד, ניתן לשלב נוגדנים ראשוניים מרובים לאותה תמיסה, כל עוד לכל נוגדן ראשוני יש מארח שונה כדי למנוע תגובתיות צולבת של נוגדנים משניים.
5. שטפו את הנוגדן הראשוני מהרקמה באמצעות כ-500 μL של 1x PBS פעמיים למשך 10 דקות כל אחת על שייקר אורביטלי בסל"ד נמוך.
   הערה: המשך לוודא שרקמת SV שקועה בתמיסה, ולא תקועה בצד הבאר.
6. מכתים בנוגדן משני בהתאם למפרט הנוגדן המסוים בו משתמשים, בדרך כלל למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי בסל"ד נמוך. כסו את צלחת 24 הבארות כך שהנוגדן המשני המתויג פלואורסצנטית מוגן מפני אור.
   הערה: אם יש צורך ביותר מנוגדן משני אחד, שלב את הנוגדנים המשניים לאותה תמיסה. הקפד להימנע מתיוג צולב.
7. שטפו את הנוגדן המשני מהרקמה באמצעות כ-500 מיקרוליטר של PBS 1x ארבע פעמים למשך 5 דקות כל אחת על שייקר אורביטלי בסל"ד נמוך. שמור את צלחת 24 בארות מכוסה כדי להגן עליו מפני אור.
8. הכינו את המגלשה הגדולה יותר (75 מ"מ x 25 מ"מ) על ידי הנחת שני פסים קטנים של דבק לאורך ציר ה-25 מ"מ, קטנים רק מכיסויי הזכוכית הקטנים יותר בגודל 18 מ"מ x 18 מ"מ. הניחו טיפה אחת של מגיב הרכבה (כ-50 מיקרוליטר) בין פסי הדבק.
   הערה: הדבק יוצר כמות קטנה של רווח אנכי כך שכאשר מניחים את הכיסוי השני למעלה, דגימת רקמת SV יכולה להתקיים בבטחה, אך להמשיך להישאר במקומה. בעוד שעובי הסטריה הוא 30-40 מיקרון, יש להימנע מסחיטת הרקמה בין משטחי הזכוכית כדי לשמר מורפולוגיה. לחלופין, ניתן להשתמש גם בסרט שקוף.
9. באמצעות #55 מלקחיים, לתפוס כמה שפחות רקמות על קצה אחד של SV ולהעביר מן PBS כדי טיפה של מגיב הרכבה על microslide גדול יותר (75 מ"מ x 25 מ"מ). הניחו קצה אחד של מכסה זכוכית קטן יותר (18 מ"מ x 18 מ"מ) על המגלשה שבה הונח פס דבק אחד ושחררו בעדינות כדי למנוע יצירת בועות אוויר. הכיסוי ייפול לפס הדבק השני ויכסה את רקמת SV.
10. אטמו את התושבת על ידי טבילת טיפה של לק שקוף בכל פינה של התושב. תייגו את הדגימה בהתאם על כיסוי הזכוכית הרחק משדה ההדמיה. כעת הוא מוכן למיקרוסקופ קונפוקלי (איור 4).
11. דמיינו את רקמת SV באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה כדי לוודא שהיא מונחת שטוחה ולא ליד בועות אוויר. אם רקמת SV אינה מכוונת כראוי, המשתמש יכול לנסות לדחוף החוצה בועות אוויר או להסיר בזהירות את כיסוי הזכוכית הקטן יותר ולמקם מחדש את ה- SV. יש לעשות זאת בעדינות כדי למנוע שבירת כיסויי הזכוכית.

תוצאות

אנו מציגים שיטה לבודד את SV לשימוש עבור sNuc-Seq או immunostaining. האנטומיה הרלוונטית (איור 1) של השבלול ביחס ל-SV יכולה לעזור למשתמשים להבין טוב יותר את הארגון של SV ואת השלבים של פרוטוקול הדיסקציה.

כל שלב של מיקרו-דיסקציה זו של SV מעכבר P30 מפורט בווידיאו המשויך, ותצלומי בזק...

Discussion

לפני הופעתו של ריצוף תא יחיד, חוקרים רבים השתמשו בניתוח רקמות בתפזורת, אשר איפשר רק לנתח תעתיקים ממוצעים על פני תאים. בפרט, תא בודד ו- sNuc-Seq אפשרו לבודד את התעתיק של תא בודד או גרעין יחיד, בהתאמה³². במקרה זה, ניתן לזהות תעתיקי גרעין יחיד עבור תאים שוליים, בינוניים ובזאליים, כמו גם ת?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections