اضطراب جيني عالي الكفاءة في البلاعم الأولية المشتقة من نخاع العظم باستخدام مجمعات Cas9-sgRNA الكهربائية

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراء تحرير الجينوم في البلاعم المشتقة من نخاع عظم الفأر باستخدام مجمعات البروتين النووي الريبي Cas9-sgRNA المجمعة في المختبر وتسليمها عن طريق التثقيب الكهربائي.

Abstract

تعد البلاعم المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) من الفئران أداة رئيسية لدراسة البيولوجيا المعقدة لبلاعم الأنسجة. كخلايا أولية ، فإنها تمثل فسيولوجيا البلاعم في الجسم الحي بشكل أوثق من خطوط خلايا البلاعم الخالدة ويمكن اشتقاقها من الفئران التي تحمل بالفعل تغييرات جينية محددة. ومع ذلك ، فإن تعطيل وظيفة الجينات في BMDMs لا يزال يمثل تحديا تقنيا. هنا ، نقدم بروتوكولا لتحرير جينوم CRISPR / Cas9 الفعال في BMDMs ، والذي يسمح بإدخال عمليات إدخال وحذف صغيرة (indels) تؤدي إلى طفرات إزاحة الإطار التي تعطل وظيفة الجينات. يصف البروتوكول كيفية تجميع الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA-Cas9) وتشكيل مجمعات البروتين النووي الريبي sgRNA-Cas9 المنقاة (RNPs) التي يمكن توصيلها عن طريق التثقيب الكهربائي. كما يوفر طريقة فعالة لمراقبة كفاءة التحرير باستخدام تسلسل سانجر الروتيني وبرنامج تحليل متاح مجانا عبر الإنترنت. يمكن تنفيذ البروتوكول في غضون 1 أسبوع ولا يتطلب بناء البلازميد. ينتج عنه عادة كفاءة تحرير تتراوح من 85٪ إلى 95٪.

Introduction

البلاعم هي خلايا مناعية فطرية تلعب أدوارا حاسمة في إصلاح الأنسجة والمناعة ^1,2. تتميز خطوط خلايا البلاعم الخالدة ، مثل خلايا الماوس RAW 264.7 أو خلايا THP-1 البشرية ، بالعديد من الخصائص المفيدة ، بما في ذلك النمو القوي وسهولة تعطيل الجينات عن طريق توصيل ناقلات لتداخل الحمض النووي الريبي أو CRISPR / Cas9 ^3,4. ومع ذلك ، فإن التحول السرطاني يغير بشكل كبير فسيولوجيتها ، مما يؤدي إلى التنشيط الشاذ لبعض المسارات والاستجابات الصامتة للآخرين ^5,6. تلخص البلاعم الأولية المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) بشكل أ....

Protocol

1. تصميم sgRNA

ملاحظة: تصف هذه الخطوة اختيار التسلسلات المستهدفة وتصميم sgRNAs. من المفيد تصميم أدلة موجودة في أول إكسون ترميز كبير ، بحيث يتم تعطيل أي بروتين مترجم في وقت مبكر من إطار القراءة المفتوح. من المفيد أيضا تحديد التسلسلات المستهدفة التي تقع ضمن نفس exon ، حيث سيؤدي ذلك إلى تبسيط تحليل كفاءة التحرير (الخطوة 6). استخدمت أمثلة تحرير الجينوم المقدمة مع هذا البروتوكول sgRNAs التي تستهدف أول إكسون لجين Src وجين Cblb ، وكذلك في موضع Rosa26 غير المشفر لجينوم الفأر.

1. حدد 20 تسلسلا جينوميا للنيوكليوتيدات لاستهدافها ، باستخدام واحدة من عدة أدوات تصميم مجانية عبر الإنترنت (الجدول 1....

النتائج

قالب IVT هو منتج PCR 127 bp (الشكل 1B). منتج IVT كامل الطول هو 98 nt RNA ، والذي يهاجر بشكل مشابه لجزء DNA مزدوج تقطعت به السبل 70 bp (الشكل 1C).

بعد التثقيب الكهربائي ، يجب أن تكون الخلايا قابلة للحياة بنسبة >90٪ ، مع إجمالي عدد الخلايا بنسبة >70٪ من رقم خلية البداية.......

Discussion

يسمح تحرير الجينوم باستخدام مجمعات Cas9-sgRNA المكهربة بالتعطيل الفعال لوظيفة الجينات في BMDMs. تختلف كفاءة التحرير حسب التسلسل المستهدف والجين. عادة ، يتم فحص أربعة إلى خمسة sgRNAs بشكل عام لتحديد واحد نشط للغاية. تتمتع بعض المواضع بكفاءة تحرير أقل ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى بنية الكروماتين. في هذه.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-MCSF Cell Line	Gift from Russell Vance	not applicable
Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer	IDT	1075915
Ampure XP Reagent Beads	Beckman Coulter	A63880
Calf intestinal alkaline phosphatase	NEB	M0525S
DNase	NEB	M0303S
DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2)	Thermo Fisher	14040-133
DPBS -Ca/Mg	Thermo Fisher	14190-144
ExoI	NEB	M0293S
Fetal Calf Serum (FCS)	Corning	35-015-CV
Herculase DNA polymerase & buffer	Agilent	600677
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2040S
LoBind conical tubes 15 mL	Eppendorf	30122216
LoBind Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	22431102
NEBuffer r2.1	NEB	B6002S
Neon Transfection System	Thermo Fisher	MPK5000, MPP100, MPS100
Neon Transfection System 10 uL Tips	Thermo Fisher	MPK1025 or MPK1096
PBS + 1mM EDTA	Lonza	BE02017F
Proteinase K	Thermo Fisher	EO0491
rCutSmart Buffer for ExoI	NEB	B6004S
Ribolock	Thermo Fisher	EO0384
RNA loading dye	NEB	B0363S
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
S. pyogenes Cas9-NLS	University of California Macro Lab	not applicable	Available to non-UC investigators through  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation	IDT	1081059
SAP	NEB	M0371S