使用电穿孔Cas9-sgRNA复合物对原代骨髓来源的巨噬细胞进行高效基因破坏

摘要

该协议描述了使用 体外 组装并通过电穿孔递送的Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物在小鼠骨髓来源的巨噬细胞中进行基因组编辑的过程。

摘要

来自小鼠的骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）是研究组织巨噬细胞复杂生物学的关键工具。作为原代细胞，它们比永生化的巨噬细胞系更接近 于体内 巨噬细胞的生理学模型，并且可以从已经携带特定遗传变化的小鼠中提取。然而，破坏BMDM的基因功能在技术上仍然具有挑战性。在这里，我们提供了一种在BMDM中进行高效CRISPR / Cas9基因组编辑的协议，该协议允许引入小的插入和缺失（插入缺失），从而导致破坏基因功能的移码突变。该方案描述了如何合成单向导RNA（sgRNA-Cas9）并形成纯化的sgRNA-Cas9核糖核蛋白复合物（RNP），这些复合物可以通过电穿孔递送。它还提供了一种使用常规 Sanger 测序和免费提供的在线分析程序来监控编辑效率的有效方法。该方案可在1周内进行，不需要质粒构建;它通常会导致 85% 到 95% 的编辑效率。

引言

巨噬细胞是先天免疫细胞，在组织修复和免疫中起关键作用 ^1,2。永生化的巨噬细胞系，如小鼠 RAW 264.7 细胞或人 THP-1 细胞，具有多种有益特性，包括通过递送 RNA 干扰或 CRISPR/Cas9 载体来促进生长和易于基因破坏 ^3,4。然而，致癌转化会显着改变它们的生理机能，这导致某些通路的异常激活和其他通路的沉默反应 ^5,6。原代骨髓来源的巨噬细胞 （BMDM） 更接近地概括了体内巨噬细胞的生理学，但由于这些原代免疫细胞中的质粒转染和病毒转导效率低，因此在遗传操作方面仍然具有挑战性 ^7,8。因此，需要更有效的方法来破坏基因功能。

CRISPR/Cas9 基因组编辑是跨一系列生物系统（包括哺乳动物细胞^9、10、

研究方案

1. sgRNA设计

注意：此步骤描述了靶序列的选择和sgRNA的设计。设计位于第一个大编码外显子中的指南是有帮助的，这样任何翻译的蛋白质在开放阅读框的早期就会被破坏。选择位于同一外显子内的靶序列也很有帮助，因为这将简化编辑效率的分析（步骤6）。该协议提供的基因组编辑示例使用靶向 Src 基因和 Cblb 基因的第一个外显子以及小鼠基因组的非编码 Rosa26 位点的sgRNA。

1. 使用几种免费的在线设计工具之一鉴定 20 个要靶向的核苷酸基因组序列（表 1）。选择每个基因内不重叠的四到五个向导，因为 Cas9 活性因所选的特定向导而异，并且无法 先 验预测高活性向导。
   注意：确保指南相对于目标位点序列的正确方向至关重要。设计工具通常以 5' 到 3' 的方向提供引导序列，而不管靶向哪条染色体链。要验证链方向，请检查靶向基因组序列的 3' 处是否存在 化脓性链球 菌 Cas9 （nGG） 的原间隔相邻基序 （PAM） 序列。sgRNA 序列不包括 PAM。

2. sgRNA合成

注意：此步骤描述了如何使用PCR合成sgRNA以生成 用于体....

讨论

使用电穿孔Cas9-sgRNA复合物进行基因组编辑可以有效破坏BMDM中的基因功能。编辑效率因靶序列和基因而异。通常，通常会筛选四到五个 sgRNA，以鉴定出一种高活性的 sgRNA。一些基因座的编辑效率较低，很可能是由于染色质结构。在这些情况下，可以进行一些修改以提高编辑效率。将两个活性 sgRNA 共同递送至同一外显子可改善某些基因的编辑。然而，当两个向导共转染时，我们观察到 TIDE 可能会失?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-MCSF Cell Line	Gift from Russell Vance	not applicable
Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer	IDT	1075915
Ampure XP Reagent Beads	Beckman Coulter	A63880
Calf intestinal alkaline phosphatase	NEB	M0525S
DNase	NEB	M0303S
DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2)	Thermo Fisher	14040-133
DPBS -Ca/Mg	Thermo Fisher	14190-144
ExoI	NEB	M0293S
Fetal Calf Serum (FCS)	Corning	35-015-CV
Herculase DNA polymerase & buffer	Agilent	600677
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2040S
LoBind conical tubes 15 mL	Eppendorf	30122216
LoBind Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	22431102
NEBuffer r2.1	NEB	B6002S
Neon Transfection System	Thermo Fisher	MPK5000, MPP100, MPS100
Neon Transfection System 10 uL Tips	Thermo Fisher	MPK1025 or MPK1096
PBS + 1mM EDTA	Lonza	BE02017F
Proteinase K	Thermo Fisher	EO0491
rCutSmart Buffer for ExoI	NEB	B6004S
Ribolock	Thermo Fisher	EO0384
RNA loading dye	NEB	B0363S
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
S. pyogenes Cas9-NLS	University of California Macro Lab	not applicable	Available to non-UC investigators through  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation	IDT	1081059
SAP	NEB	M0371S