Distruzione genica ad alta efficienza nei macrofagi primari derivati dal midollo osseo utilizzando complessi elettroporati Cas9-sgRNA

Riepilogo

Questo protocollo descrive la procedura per l'editing del genoma nei macrofagi derivati dal midollo osseo di topo utilizzando complessi ribonucleoproteici Cas9-sgRNA assemblati in vitro e somministrati mediante elettroporazione.

Abstract

I macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) dei topi sono uno strumento chiave per studiare la complessa biologia dei macrofagi tissutali. Come cellule primarie, modellano la fisiologia dei macrofagi in vivo più da vicino rispetto alle linee cellulari di macrofagi immortalizzate e possono essere derivate da topi già portatori di cambiamenti genetici definiti. Tuttavia, l'interruzione della funzione genica nei BMDM rimane tecnicamente impegnativa. Qui, forniamo un protocollo per l'editing efficiente del genoma CRISPR/Cas9 nei BMDM, che consente l'introduzione di piccole inserzioni e delezioni (indel) che si traducono in mutazioni frameshift che interrompono la funzione genica. Il protocollo descrive come sintetizzare RNA a guida singola (sgRNA-Cas9) e formare complessi ribonucleoproteici (RNP) sgRNA-Cas9 purificati che possono essere rilasciati mediante elettroporazione. Fornisce inoltre un metodo efficiente per monitorare l'efficienza dell'editing utilizzando il sequenziamento Sanger di routine e un programma di analisi online disponibile gratuitamente. Il protocollo può essere eseguito entro 1 settimana e non richiede la costruzione di plasmidi; In genere si traduce in un'efficienza di editing dall'85% al 95%.

Introduzione

I macrofagi sono cellule immunitarie innate che svolgono un ruolo fondamentale nella riparazione dei tessuti e nell'immunità ^1,2. Le linee cellulari di macrofagi immortalizzate, come le cellule RAW 264.7 di topo o le cellule THP-1 umane, hanno diverse caratteristiche benefiche, tra cui una crescita robusta e la facilità di distruzione genica fornendo vettori per l'interferenza dell'RNA o CRISPR/Cas9 ^3,4. Tuttavia, la trasformazione oncogenica altera drammaticamente la loro fisiologia, il che si traduce nell'attivazione aberrante di alcune vie e nelle r....

Protocollo

1. Progettazione dell'sgRNA

NOTA: Questo passaggio descrive la selezione delle sequenze bersaglio e la progettazione degli sgRNA. È utile progettare guide che si trovino nel primo grande esone codificante, in modo che qualsiasi proteina tradotta venga interrotta all'inizio del frame di lettura aperto. È anche utile selezionare sequenze target che si trovano all'interno dello stesso esone, in quanto ciò semplificherà l'analisi dell'efficienza di editing (fase 6). Gli esempi di editing genomico forniti con questo protocollo hanno utilizzato sgRNA mirati al primo esone del gene Src e al gene Cblb , nonché nel l....

Discussione

L'editing del genoma utilizzando complessi Cas9-sgRNA elettroporati consente un'efficace interruzione della funzione genica nei BMDM. L'efficienza di editing varia in base alla sequenza e al gene target. In genere, quattro o cinque sgRNA vengono generalmente sottoposti a screening per identificarne uno altamente attivo. Alcuni loci hanno un'efficienza di editing inferiore, molto probabilmente a causa della struttura della cromatina. In questi casi, è possibile apportare diverse modifiche per aumentare l'efficienza dell'.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-MCSF Cell Line	Gift from Russell Vance	not applicable
Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer	IDT	1075915
Ampure XP Reagent Beads	Beckman Coulter	A63880
Calf intestinal alkaline phosphatase	NEB	M0525S
DNase	NEB	M0303S
DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2)	Thermo Fisher	14040-133
DPBS -Ca/Mg	Thermo Fisher	14190-144
ExoI	NEB	M0293S
Fetal Calf Serum (FCS)	Corning	35-015-CV
Herculase DNA polymerase & buffer	Agilent	600677
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2040S
LoBind conical tubes 15 mL	Eppendorf	30122216
LoBind Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	22431102
NEBuffer r2.1	NEB	B6002S
Neon Transfection System	Thermo Fisher	MPK5000, MPP100, MPS100
Neon Transfection System 10 uL Tips	Thermo Fisher	MPK1025 or MPK1096
PBS + 1mM EDTA	Lonza	BE02017F
Proteinase K	Thermo Fisher	EO0491
rCutSmart Buffer for ExoI	NEB	B6004S
Ribolock	Thermo Fisher	EO0384
RNA loading dye	NEB	B0363S
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
S. pyogenes Cas9-NLS	University of California Macro Lab	not applicable	Available to non-UC investigators through  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation	IDT	1081059
SAP	NEB	M0371S