Hocheffiziente Genzerstörung in primären Makrophagen aus dem Knochenmark unter Verwendung elektroporierter Cas9-sgRNA-Komplexe

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Genom-Editierung in aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Makrophagen unter Verwendung von Cas9-sgRNA-Ribonukleoproteinkomplexen, die in vitro zusammengesetzt und durch Elektroporation verabreicht werden.

Zusammenfassung

Aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen (BMDMs) von Mäusen sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der komplexen Biologie von Gewebemakrophagen. Als Primärzellen modellieren sie die Physiologie von Makrophagen in vivo genauer als immortalisierte Makrophagen-Zelllinien und können von Mäusen abgeleitet werden, die bereits definierte genetische Veränderungen tragen. Die Störung der Genfunktion in BMDMs ist jedoch nach wie vor eine technische Herausforderung. Hier stellen wir ein Protokoll für die effiziente CRISPR/Cas9-Genom-Editierung in BMDMs zur Verfügung, das die Einführung kleiner Insertionen und Deletionen (Indels) ermöglicht, die zu Frameshift-Mutationen führen, die die Genfunktion stören. Das Protokoll beschreibt, wie Single-Guide-RNAs (sgRNA-Cas9) synthetisiert und gereinigte sgRNA-Cas9-Ribonukleoproteinkomplexe (RNPs) gebildet werden, die durch Elektroporation verabreicht werden können. Es bietet auch eine effiziente Methode zur Überwachung der Bearbeitungseffizienz mithilfe der routinemäßigen Sanger-Sequenzierung und eines frei verfügbaren Online-Analyseprogramms. Das Protokoll kann innerhalb von 1 Woche durchgeführt werden und erfordert keine Plasmidkonstruktion; Dies führt in der Regel zu einer Bearbeitungseffizienz von 85 % bis 95 %.

Einleitung

Makrophagen sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die eine entscheidende Rolle bei der Gewebereparatur und Immunität spielen ^1,2. Immortalisierte Makrophagen-Zelllinien, wie z. B. RAW 264.7-Zellen der Maus oder menschliche THP-1-Zellen, haben mehrere vorteilhafte Eigenschaften, darunter robustes Wachstum und einfache Genstörung durch die Bereitstellung von Vektoren für RNA-Interferenz oder CRISPR/Cas9 ^3,4. Die onkogene Transformation verändert jedoch dramatisch ihre Physiologie, was zu einer abnormen Aktivierung einiger Signalwege und zu gedämpften....

Protokoll

1. sgRNA-Design

HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt die Auswahl der Zielsequenzen und das Design der sgRNAs. Es ist hilfreich, Leitfäden zu entwerfen, die sich im ersten großen kodierenden Exon befinden, so dass jedes translatierte Protein früh im offenen Leserahmen gestört wird. Es ist auch hilfreich, Zielsequenzen auszuwählen, die innerhalb desselben Exons liegen, da dies die Analyse der Bearbeitungseffizienz rationalisiert (Schritt 6). Die Beispiele für Genom-Editierung, die mit diesem Protokoll zur Verfügung gestellt wurden, verwendeten sgRNAs, die auf das erste Exon des Src-Gens und des Cblb-Gens sowie a....

Diskussion

Die Genom-Editierung mit elektroporierten Cas9-sgRNA-Komplexen ermöglicht eine effektive Störung der Genfunktion in BMDMs. Die Editiereffizienz variiert je nach Zielsequenz und Gen. In der Regel werden vier bis fünf sgRNAs gescreent, um eine hochaktive zu identifizieren. Einige Loci weisen eine geringere Editiereffizienz auf, was höchstwahrscheinlich auf die Chromatinstruktur zurückzuführen ist. In diesen Fällen können mehrere Änderungen vorgenommen werden, um die Bearbeitungseffizienz zu erhöhen. Die gleichzei.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-MCSF Cell Line	Gift from Russell Vance	not applicable
Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer	IDT	1075915
Ampure XP Reagent Beads	Beckman Coulter	A63880
Calf intestinal alkaline phosphatase	NEB	M0525S
DNase	NEB	M0303S
DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2)	Thermo Fisher	14040-133
DPBS -Ca/Mg	Thermo Fisher	14190-144
ExoI	NEB	M0293S
Fetal Calf Serum (FCS)	Corning	35-015-CV
Herculase DNA polymerase & buffer	Agilent	600677
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2040S
LoBind conical tubes 15 mL	Eppendorf	30122216
LoBind Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	22431102
NEBuffer r2.1	NEB	B6002S
Neon Transfection System	Thermo Fisher	MPK5000, MPP100, MPS100
Neon Transfection System 10 uL Tips	Thermo Fisher	MPK1025 or MPK1096
PBS + 1mM EDTA	Lonza	BE02017F
Proteinase K	Thermo Fisher	EO0491
rCutSmart Buffer for ExoI	NEB	B6004S
Ribolock	Thermo Fisher	EO0384
RNA loading dye	NEB	B0363S
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
S. pyogenes Cas9-NLS	University of California Macro Lab	not applicable	Available to non-UC investigators through  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation	IDT	1081059
SAP	NEB	M0371S