Disrupción génica de alta eficiencia en macrófagos primarios derivados de la médula ósea mediante complejos Cas9-sgRNA electroporados

Resumen

Este protocolo describe el procedimiento para la edición del genoma en macrófagos derivados de la médula ósea de ratón utilizando complejos de ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA ensamblados in vitro y administrados por electroporación.

Resumen

Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) de ratones son una herramienta clave para estudiar la compleja biología de los macrófagos tisulares. Como células primarias, modelan la fisiología de los macrófagos in vivo más de cerca que las líneas celulares de macrófagos inmortalizados y pueden derivarse de ratones que ya portan cambios genéticos definidos. Sin embargo, la alteración de la función génica en los BMDM sigue siendo un reto técnico. Aquí, proporcionamos un protocolo para la edición eficiente del genoma CRISPR/Cas9 en BMDM, que permite la introducción de pequeñas inserciones y deleciones (indels) que dan lugar a mutaciones de cambio de marco que interrumpen la función génica. El protocolo describe cómo sintetizar ARN de una sola guía (sgRNA-Cas9) y formar complejos de ribonucleoproteínas (RNP) sgRNA-Cas9 purificados que pueden administrarse por electroporación. También proporciona un método eficiente para monitorear la eficiencia de la edición utilizando la secuenciación rutinaria de Sanger y un programa de análisis en línea disponible gratuitamente. El protocolo se puede realizar en 1 semana y no requiere la construcción de plásmidos; Por lo general, da como resultado una eficiencia de edición del 85% al 95%.

Introducción

Los macrófagos son células inmunitarias innatas que desempeñan un papel fundamental en la reparación de tejidos y la inmunidad ^1,2. Las líneas celulares de macrófagos inmortalizadas, como las células RAW 264.7 de ratón o las células THP-1 humanas, tienen varias características beneficiosas, incluido el crecimiento robusto y la facilidad de disrupción génica mediante la administración de vectores de interferencia de ARN o CRISPR/Cas9 ^3,4. Sin embargo, la transformación oncogénica altera drásticamente su fisiología, lo que resulta en la activación aberra....

Protocolo

1. Diseño de sgRNA

NOTA: Este paso describe la selección de las secuencias diana y el diseño de los sgRNAs. Es útil diseñar guías que se encuentren en el primer exón codificante grande, de modo que cualquier proteína traducida se interrumpa temprano en el marco de lectura abierto. También es útil seleccionar secuencias objetivo que se encuentren dentro del mismo exón, ya que esto agilizará el análisis de la eficiencia de la edición (paso 6). Los ejemplos de edición genómica proporcionados con este protocolo utilizaron sgRNAs dirigidos al primer exón del gen Src y al gen Cblb , así como en el locus no codific....

Discusión

La edición del genoma mediante complejos Cas9-sgRNA electroporados permite una interrupción eficaz de la función génica en los BMDM. La eficiencia de edición varía según la secuencia diana y el gen. Por lo general, se analizan de cuatro a cinco sgRNAs para identificar uno que es altamente activo. Algunos loci tienen eficiencias de edición más bajas, muy probablemente debido a la estructura de la cromatina. En estos casos, se pueden realizar varias modificaciones para aumentar la eficiencia de la edición. La ent.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-MCSF Cell Line	Gift from Russell Vance	not applicable
Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer	IDT	1075915
Ampure XP Reagent Beads	Beckman Coulter	A63880
Calf intestinal alkaline phosphatase	NEB	M0525S
DNase	NEB	M0303S
DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2)	Thermo Fisher	14040-133
DPBS -Ca/Mg	Thermo Fisher	14190-144
ExoI	NEB	M0293S
Fetal Calf Serum (FCS)	Corning	35-015-CV
Herculase DNA polymerase & buffer	Agilent	600677
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2040S
LoBind conical tubes 15 mL	Eppendorf	30122216
LoBind Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	22431102
NEBuffer r2.1	NEB	B6002S
Neon Transfection System	Thermo Fisher	MPK5000, MPP100, MPS100
Neon Transfection System 10 uL Tips	Thermo Fisher	MPK1025 or MPK1096
PBS + 1mM EDTA	Lonza	BE02017F
Proteinase K	Thermo Fisher	EO0491
rCutSmart Buffer for ExoI	NEB	B6004S
Ribolock	Thermo Fisher	EO0384
RNA loading dye	NEB	B0363S
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
S. pyogenes Cas9-NLS	University of California Macro Lab	not applicable	Available to non-UC investigators through  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation	IDT	1081059
SAP	NEB	M0371S