Ruptura Gênica de Alta Eficiência em Macrófagos Primários Derivados da Medula Óssea Usando Complexos Eletroporados Cas9-sgRNA

Resumo

Este protocolo descreve o procedimento de edição do genoma em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos usando complexos ribonucleoprotéicos Cas9-sgRNA montados in vitro e liberados por eletroporação.

Resumo

Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) de camundongos são uma ferramenta chave para o estudo da complexa biologia de macrófagos teciduais. Como células primárias, elas modelam a fisiologia de macrófagos in vivo mais de perto do que linhagens celulares de macrófagos imortalizadas e podem ser derivadas de camundongos já portadores de alterações genéticas definidas. No entanto, a interrupção da função gênica em BMDMs permanece tecnicamente desafiadora. Aqui, fornecemos um protocolo para edição eficiente do genoma CRISPR/Cas9 em BMDMs, que permite a introdução de pequenas inserções e deleções (indels) que resultam em mutações frameshift que interrompem a função do gene. O protocolo descreve como sintetizar RNAs de guia único (sgRNA-Cas9) e formar complexos de ribonucleoproteínas (RNPs) purificados de sgRNA-Cas9 que podem ser liberados por eletroporação. Ele também fornece um método eficiente para monitorar a eficiência da edição usando o sequenciamento de rotina do Sanger e um programa de análise on-line disponível gratuitamente. O protocolo pode ser realizado em até 1 semana e não requer a construção de plasmídeos; normalmente resulta em 85% a 95% de eficiência de edição.

Introdução

Os macrófagos são células imunes inatas que desempenham papéis críticos no reparo tecidual e na imunidade ^1,2. Linhagens celulares de macrófagos imortalizadas, como células RAW 264.7 de camundongos ou células THP-1 humanas, têm várias características benéficas, incluindo crescimento robusto e facilidade de ruptura gênica por meio da entrega de vetores para interferência de RNA ou CRISPR/Cas9 ^3,4. Entretanto, a transformação oncogênica altera drasticamente sua fisiologia, o que resulta na ativação aberrante de algumas vias e respostas silenciadas de^outras5,6. Macrófagos primários derivados da medula óssea (BMDMs) recapitulam mais de perto a fisiologia de macrófagos in vivo, mas permanecem desafiadores para manipular geneticamente devido à baixa eficiência tanto da transfecção de plasmídios quanto da transdução viral nessas células imunes^{primárias 7,8}. Assim, métodos mais eficientes para interromper a função gênica são necessários.

A edição do genoma CRISPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa para manipulação genética em uma variedade de sistemas biológicos, incluindo células de mamíferos 9,10,11,12. A proteína Cas9 do Streptococcus pyogenes cliva de forma eficiente e específica o DNA de fita dupla quando complexada com um RNA-guia específico de sequência. O reparo do DNA através da junção final não homóloga (NHEJ) do DNA clivado resulta em pequenas inserções ou deleções (indels) que criam mutações frameshift. Nos primeiros estudos, Cas9 e sgRNAs foram liberados através de vetores plasmidiais ou lentivirais, que são métodos de liberação eficazes para muitas linhagens celulares ^9,10. No entanto, as células primárias e, em particular, as células imunes primárias são frequentemente refratárias a esses métodos devido à baixa eficiência da liberação do vetor por transfecção ou transdução. Posteriormente, métodos foram desenvolvidos para gerar complexos sgRNA-Cas9 in vitro e liberá-los via eletroporação, e esses métodos alcançaram alta eficiência em uma variedade de tipos celulares^13,14. Os resultados sugerem a possibilidade de usar esta abordagem para realizar a edição do genoma em macrófagos primários.

Aqui, nós fornecemos um protocolo para o uso de complexos ribonucleoproteicos sgRNA-Cas9 (RNPs) para realizar a edição do genoma em BMDMs primárias. Ele contém etapas para mitigar a ativação dos sensores imunológicos presentes nas células imunes primárias e resulta em até 95% de edição em loci alvo com toxicidade mínima. Esse protocolo também inclui fluxos de trabalho para avaliar a eficiência de edição usando reação em cadeia da polimerase (PCR) de rotina e sequenciamento de Sanger, seguido de análise in silico por Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)¹⁵, uma ferramenta de software on-line bem validada.

Protocolo

1. Projeto do sgRNA

Observação : esta etapa descreve a seleção das sequências de destino e o design dos sgRNAs. É útil projetar guias que estão no primeiro grande éxon de codificação, para que qualquer proteína traduzida seja interrompida no início do quadro de leitura aberto. Também é útil selecionar sequências de destino que estejam dentro do mesmo exon, pois isso agilizará a análise da eficiência de edição (etapa 6). Os exemplos de edição do genoma fornecidos com este protocolo usaram sgRNAs visando o primeiro exon do gene Src e o gene Cblb , bem como no locus Rosa26 não-codificante do genoma do camundongo.

1. Identifique 20 sequências genômicas de nucleotídeos como alvo, usando uma das várias ferramentas gratuitas de design on-line (Tabela 1). Selecione quatro a cinco guias que não se sobreponham dentro de cada gene, pois a atividade de Cas9 varia de acordo com o guia específico escolhido, e a previsão a priori de um guia altamente ativo não é possível.
   NOTA: É fundamental garantir a orientação adequada do guia em relação à sequência do locus visado. As ferramentas de projeto normalmente fornecem a sequência guia em uma orientação de 5' a 3', independentemente de qual fita cromossômica é alvo. Para verificar a orientação da fita, verifique se há uma sequência de motivos adjacentes (PAM) do protoespaçador para S. pyogenes Cas9 (nGG) imediatamente 3' da sequência genômica alvo. A sequência de sgRNA não inclui o PAM.

2. Síntese de sgRNA

NOTA: Esta etapa descreve como sintetizar sgRNAs usando PCR para gerar um molde para transcrição in vitro (IVT) e, em seguida, purificar o sgRNA usando colunas de spin (Figura 1A). Os sgRNAs sintéticos personalizados estão disponíveis comercialmente através de vários fornecedores como uma alternativa ao PCR/IVT.

1. Realizar PCR para gerar o molde de IVT para T7 RNA polimerase. A reação de PCR utiliza primers universais que contêm um promotor de RNA polimerase T7 e uma sequência transativadora de RNA CRISPR (tracrRNA) (Tabela 2), além de primers individuais curtos com a sequência guia gene-específica.
   1. Esta é a etapa de extensão de sobreposição não amplificadora. Diluir o tampão de PCR para 1x e adicionar mais 1 mM MgCl₂. Em seguida, adicionar 0,25 μL de DNA polimerase de alta fidelidade, 0,5 mM de desoxinucleotídeo trifosfato (dNTP), 0,02 mM de primer guia-específico e 0,02 mM T7 de primer universal longo reverso (Tabela 2) a um volume total de 46 μL. Em seguida, coloque o tubo no termociclador e execute dois ciclos de: 95 °C por 15 s, 37 °C por 15 s e 72 °C por 15 s. Resfriar as reações no gelo.
   2. Esta é a etapa de amplificação da PCR. A cada reação, adicionar 2 μL de primer de amplificação direta de 25 mM e 2 μL de primer de amplificação reversa de 25 mM. O volume final da reação é de 50 μL. Desnaturar por 30 s a 95 °C. Em seguida, execute 35 ciclos de: 95 °C por 15 s, 65 °C por 20 s e 72 °C por 15 s. Executar uma extensão adicional a 72 °C por 2 min.
   3. Verifique o produto da reação de PCR em gel de agarose a 2%. A PCR de sobreposição de extensão resulta em uma molécula de dsDNA de 127 pb com o promotor T7 a montante do guia de nucleotídeos 20 gene-específico e o tracrRNA imediatamente a jusante (Figura 1B).
2. Purificação do modelo de TIV: Existem inúmeros protocolos e kits que funcionam bem para isso. Este protocolo utiliza esferas de imobilização reversível em fase sólida (SPRI). Misturar 50 μL do produto PCR com 90 μL de contas e seguir as instruções do fabricante. Eluir o DNA adicionando 40 μL de tampão (5 mM Tris, 0,1 mM ácido etilenodiaminotetracético [EDTA]) e aquecer a 65 °C por 5 min.
3. Medir a concentração de DNA do molde de TIV usando absorção em um comprimento de onda de 260 nm. Uma concentração de DNA de pelo menos 50 ng/μL é necessária para a TIV. O molde IVT pode ser armazenado a -20 °C.
4. Reação de TIV
   1. Use um kit comercial projetado para produzir altos rendimentos de IVT (consulte a Tabela de Materiais). Siga as recomendações do fabricante para realizar a reação de TIV. Usando 250 ng de molde de IVT em uma reação de 20 μL, incubar a 37 °C por 4-16 h.
   2. Verifique o produto IVT sgRNA executando 1 μL da reação em um gel de agarose a 2%. Uma banda de RNA brilhante deve ser observada, funcionando de forma semelhante ao dsDNA de 70 pb (Figura 1C). Embora não seja obrigatório, para obter bandas afiadas e mais resolvidas, use um tampão de amostra de RNA com ureia e desnature a amostra a 65 °C por 5 minutos antes do carregamento.
      NOTA: Bandas de peso molecular mais tênues e pequenas diferenças de migração podem ser observadas com alguns RNAs guia devido a diferenças na estrutura secundária do RNA.
5. Desfosforilar o produto de IVT de sgRNA para minimizar a ativação de RIG-I (um sensor de RNA estranho) e subsequente morte celular após eletroporação. Para cada 20 μL de reação IVT, adicionar 69 μL de água de grau molecular e 15 U de fosfatase intestinal (CIP) de bezerro em 1x tampão CIP. Incubar durante 2 h a 37 °C.
6. Degradar o molde de TIV para minimizar a ativação de sensores de DNA celular, que desencadeiam a morte celular após eletroporação. A cada reação de TIV, adicionar 2 U de DNase livre de RNase. Incubar durante 15 min a 37 °C. O produto IVT pode ser armazenado a -20 °C por 1 dia ou -80 °C por vários meses.
7. Purificar o produto IVT usando colunas de spin. Para esta etapa, os kits de purificação de contas SPRI são inferiores.
   1. Ligar o RNA à coluna adicionando 220 μL de tampão de ligação ao produto IVT, seguido por 1 mL de etanol 100% grau biologia molecular. Misture bem e carregue a coluna. Depois disso, siga as instruções do fabricante. Realizar a lavagem final em um gabinete de biossegurança de fluxo laminar para evitar a contaminação do sgRNA.
   2. Realizar a eluição na capela de fluxo laminar para evitar contaminação. Eluir o RNA usando 30 μL de tampão Tris 10 mM estéril (pH 8,0).
8. Medir a concentração de sgRNA medindo a absorbância a um comprimento de onda de 260 nm.
   NOTA: Os rendimentos típicos de sgRNA são de pelo menos 100 μg.
9. Conservar o sgRNA a -80 °C. Faça alíquotas para evitar mais de três ciclos de congelamento-descongelamento.

3. Preparação para eletroporação

OBS: Todas as etapas devem ser realizadas em capela de fluxo laminar para evitar contaminação. Este protocolo utiliza um sistema de eletroporação disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) com pontas de 10 μL.

1. Descongelar as BMDMs 48-72 h antes do uso e expandi-las em placas não tratadas com cultura de tecidos (CT).
   NOTA: Por reação, são necessárias 4 x 10⁵ células.
2. Esterilizar tubos de PCR para montagem de reação. Prepare um tubo de PCR por reação e aqueça-os em um termociclador por 10 min a 98 °C. Prepare os tubos em lotes e guarde-os fechados. Coloque os tubos de PCR esterilizados no gelo quando estiver pronto para uso.
3. Limpe a estação de pipetas com etanol 70% e coloque-a na capela de fluxo laminar. Defina os parâmetros para 1.900 V, 20 ms e um pulso.
4. Retire um tubo de transfecção da embalagem com cuidado para mantê-lo estéril e preencha-o com 3 mL de tampão "E". Certifique-se de que o tampão E esteja à temperatura ambiente antes da eletroporação. Insira o tubo na estação e empurre-o para baixo até clicar.
5. Para cada reação, alíquota 2,5 μL de sgRNA a uma concentração de 1.100 ng/μL. Diluir o sgRNA em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a frio com CaCl₂ 0,9 mM e MgCl₂ 0,5 mM (PBS + Ca/Mg). Deixe no gelo.
6. Prepare duas placas: uma placa de 12 poços sem revestimento para as células e uma placa adicional de 24 poços para segurar o meio de cultura. Alíquota 1,5 mL de meio livre de antibiótico por reação nos poços da placa de 24 poços.
7. Preparar proteína Cas9. Existem vários fornecedores comerciais e acadêmicos de proteína Cas9 purificada estéril. Diluir Cas9 até uma concentração final de 20 μM com PBS frio + Ca/Mg. Para cada reação de eletroporação, alíquota 1 μL de 20 μM Cas9 em tubos de PCR estéreis. Deixe no gelo.
8. Preparar células para eletroporação.
   1. Remova o meio de crescimento. Lavar as células com PBS sem CaCl₂ e MgCl₂ (PBS-Ca/Mg) para remover o soro e cátions divalentes que promovem a adesão. Em seguida, adicione PBS + 1 mM EDTA e incube à temperatura ambiente por cerca de 5 min até que as células comecem a se desprender.
   2. Pipetar suavemente para cima e para baixo para separar as células. Transfira as células para um tubo de 15 mL de baixa ligação às proteínas. Pellet as células a 500 x g por 5 min.
      NOTA: Os macrófagos são aderentes aos plásticos. O uso de tubos de centrífuga de baixa ligação a proteínas melhora significativamente o rendimento celular.
   3. Trabalhe rapidamente para evitar a incubação prolongada das células em PBS + EDTA. Remova a maior parte do sobrenadante, deixando cerca de 1 mL de sobrenadante no tubo. Ressuspenda as células no sobrenadante restante e, em seguida, transfira para um tubo de microfuge de 1,5 ml de baixa ligação às proteínas.
   4. Remova uma pequena alíquota de células para contar. Pellet as células restantes centrifugando a 500 x g à temperatura ambiente por 5 min.
   5. Durante a centrifugação, conte as células e aqueça os tubos Cas9 e sgRNA à temperatura ambiente.
   6. Retire todo o sobrenadante do pellet celular. Ressuspender as células em PBS + Ca/Mg na concentração de 4 x 10⁷ células/mL (4 x 10⁵ células por reação de 10 μL).
      NOTA: Cada kit é fornecido com uma quantidade limitada de tampão de eletroporação (Buffer R, Buffer T). No entanto, descobrimos que a eficiência da eletroporação usando PBS + Ca/Mg é equivalente aos buffers proprietários.
   7. Ao eletroporar sgRNAs para genes diferentes, aliquota as células em diferentes tubos de baixa ligação a proteínas para cada gene para evitar a contaminação cruzada entre os sgRNAs. Manter as células à temperatura ambiente até que estejam prontas para a eletroporação.

4. Montagem da RNP

1. Manter o sgRNA e Cas9 à temperatura ambiente para evitar precipitação. Adicionar 2,5 μL de sgRNA a 1 μL de Cas9 diluído em tubos de PCR esterilizados. Dispense o sgRNA lentamente ao longo de 15 s com mistura para evitar precipitação.
2. Incubar por 5 min à temperatura ambiente para permitir a formação do complexo RNP.

5. Entrega da RNP por eletroporação

1. Prepare a ponta de eletroporação (cubeta). Pressione o êmbolo para estender a haste. Insira a haste na ponta.
   NOTA: Certifique-se de que a ponta está segura e que o êmbolo desliza suavemente e se estende além da bainha da ponta. Se a ponta não estiver posicionada corretamente, bolhas de ar podem ser introduzidas na ponta, causando falha na ponta.
2. Ressuspenda as células pipetando para cima e para baixo e, em seguida, carregue a ponta de eletroporação com as células. Retire toda a capacidade volumétrica de 10 μL da ponteira, evitando bolhas.
3. A partir do sgRNA de controle negativo, transfira 10 μL de células na ponta de eletroporação para o tubo de amostra contendo 3,5 μL de RNP a partir da etapa 4. Pipetar para cima e para baixo três vezes para misturar bem. Retirar 10 μL da mistura de volta para a ponta, garantindo que não haja bolhas.
4. Coloque a ponta na estação de eletroporação, abaixando-a no tampão. Evite entrar em contato com superfícies plásticas com a ponta para manter a esterilidade. Pressione Start na tela sensível ao toque.
5. Após a conclusão, o visor indicará um pulso bem-sucedido. Retire a pipeta do dispositivo e coloque as células em um poço seco da placa de 12 poços marcada e não revestida.
6. Enxágue a ponta pipetando para cima e para baixo duas vezes em 15 mL de PBS + Ca/Mg. Reserve a pipeta com a ponta ainda presa. Certifique-se de que a ponta não toque em nada e permaneça estéril.
   NOTA: Em muitos experimentos, é possível reutilizar a ponta para várias amostras, como após a amostra de sgRNA de controle negativo inativo, ou durante as avaliações iniciais da atividade do guia quando quatro a cinco sgRNAs são testados por gene e a única leitura é a eficiência de edição. No entanto, durante a análise funcional em células editadas, uma nova dica é recomendada para cada gene, pois pequenas quantidades de sgRNA ou carryover celular poderiam impactar os resultados experimentais.
7. Adicionar imediatamente 1 ml de meio isento de antibióticos (aliquotado no passo 3.6) às células e agitar suavemente a placa para misturar.
8. Repita as etapas 5.2-5.6 para as reações restantes.
9. Devolva as células à incubadora.
10. Verificar a viabilidade das células 1-2 h pós-eletroporação. As células devem ter >90% de aderência. Opcional: Adicionar gentamicina (5 μg/mL) às células 1-2 h após a eletroporação para ajudar a evitar contaminação, se isso não interferir com os experimentos a jusante.

6. Avaliando a eficiência da edição

NOTA: A maioria das edições é concluída após 48 h.

1. Verificar a monocamada celular 48 h após a eletroporação. Se as células estiverem acima de 50% confluentes, prossiga. Se as células estiverem <50% confluentes, aguarde mais 1-2 dias. A análise de DNA genômico para determinar a eficiência de edição requer 1 x 10⁵ células, além das células necessárias para o experimento a jusante.
2. Preparar DNA genômico (gDNA).
   1. Lave as células com PBS(-Ca/Mg). Adicionar 1 mL de PBS + 1 mM de EDTA. Incubar à temperatura ambiente por cerca de 5 min até que as células comecem a se desprender da placa.
   2. Separe as células por pipetagem. Transfira para um tubo de microfuga de baixa ligação a proteínas.
   3. Conte as células e remova uma alíquota de 1 x 10⁵ células. As células restantes podem ser replaqueadas para uso em experimentos posteriores. Geralmente, os experimentos são realizados 5 dias após a eletroporação, a fim de permitir o decaimento da proteína.
   4. Pelotar as células para análise de gDNA por 15 s na velocidade máxima em um tubo de microfuga.
   5. Ressuspender o pellet em 50 μL de tampão de lise. Vórtice para separar quaisquer células presas às paredes do tubo e aquecer a 98 °C por 10 min para lisar as células e inativar a DNase endógena.
   6. Coloque os tubos sobre o gelo.
   7. Adicionar 1 μL de proteinase K (20 mg/mL). Incubar durante pelo menos 1 h a 37 °C; pode ser deixado durante a noite por conveniência.
   8. Aquecer a 98 °C durante 10 min para inactivar a proteinase K.
   9. Centrifugar à temperatura ambiente durante 5 min à velocidade máxima. Remova o sobrenadante, que contém o DNA. Esta preparação bruta sem purificação adicional funciona bem para a maioria das reações de PCR.
3. Avalie a eficiência da edição com o sequenciamento do Sanger.
   1. Projete primers PCR 200-300 bp a montante da maioria dos sites de guia de 5' e 200-300 pb a jusante dos sites de guia de mais de 3'. O tamanho típico do amplicon é de ~500 pb. Projete um primer de sequenciamento aninhado a pelo menos 125 pb de distância do local guia mais próximo (Figura 2A).
   2. Realizar PCR usando 2 μL de gDNA.
4. Preparar o produto PCR para sequenciamento. Este protocolo utiliza um tratamento com exonuclease I/fosfatase alcalina de camarão (ExoI/SAP). Os kits comerciais de purificação de DNA também funcionam, mas exigem mais tempo prático.
   1. Preparar 15 μL do produto PCR. Adicionar 7,5 μL de água, 1 μL de tampão ExoI 10x, 10 U de ExoI e 1 U de SAP para degradar os dNTPs e primers que interferem no sequenciamento de Sanger.
   2. Incubar a 37 °C durante 30 minutos, seguido de 85 °C durante 20 minutos para desativar as enzimas.
5. Realizar o sequenciamento de Sanger no produto de PCR tratado com Exo/SAP; usar uma quantidade conhecida de marcador de tamanho de DNA para estimar o tamanho do produto de PCR presente na amostra. As reações de sequenciamento podem exigir otimização, pois o software TIDE precisa de cromatogramas de sequência de alta qualidade para estimar com precisão a eficiência de edição. O cromatograma de sequência para o locus não editado deve fornecer picos claros com fundo mínimo (Figura 2B, C).
6. Para estimar a eficiência da edição, use o TIDE para analisar os arquivos de cromatograma de sequenciamento de Sanger usando o gDNA editado e o gDNA de controle não editado. (Tabela 1, Figura 2). Carregue os arquivos de sequenciamento do Sanger e execute o software com as configurações padrão.

Resultados

O molde IVT é um produto de PCR de 127 pb (Figura 1B). O produto da TIV de comprimento total é um RNA de 98 nt, que migra de forma semelhante a um fragmento de DNA de fita dupla de 70 pb (Figura 1C).

Após a eletroporação, as células deveriam estar >90% viáveis, com contagem total de células de >70% do número inicial de células. O pool resultante de células mutantes deve ter um conjunto diversificado de indels, começando pe...

Discussão

A edição do genoma usando complexos Cas9-sgRNA eletroporados permite a interrupção efetiva da função gênica em BMDMs. A eficiência de edição varia de acordo com a sequência alvo e o gene. Normalmente, quatro a cinco sgRNAs são geralmente rastreados para identificar um que é altamente ativo. Alguns loci têm menor eficiência de edição, provavelmente devido à estrutura da cromatina. Nesses casos, várias modificações podem ser feitas para aumentar a eficiência da edição. A co-entrega de dois sgRNAs at...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-MCSF Cell Line	Gift from Russell Vance	not applicable
Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer	IDT	1075915
Ampure XP Reagent Beads	Beckman Coulter	A63880
Calf intestinal alkaline phosphatase	NEB	M0525S
DNase	NEB	M0303S
DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2)	Thermo Fisher	14040-133
DPBS -Ca/Mg	Thermo Fisher	14190-144
ExoI	NEB	M0293S
Fetal Calf Serum (FCS)	Corning	35-015-CV
Herculase DNA polymerase & buffer	Agilent	600677
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2040S
LoBind conical tubes 15 mL	Eppendorf	30122216
LoBind Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	22431102
NEBuffer r2.1	NEB	B6002S
Neon Transfection System	Thermo Fisher	MPK5000, MPP100, MPS100
Neon Transfection System 10 uL Tips	Thermo Fisher	MPK1025 or MPK1096
PBS + 1mM EDTA	Lonza	BE02017F
Proteinase K	Thermo Fisher	EO0491
rCutSmart Buffer for ExoI	NEB	B6004S
Ribolock	Thermo Fisher	EO0384
RNA loading dye	NEB	B0363S
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
S. pyogenes Cas9-NLS	University of California Macro Lab	not applicable	Available to non-UC investigators through  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation	IDT	1081059
SAP	NEB	M0371S