ربط الأذين الأيسر في جنين الطيور كنموذج لتغير الحمل الديناميكي للدورة الدموية أثناء نمو الأوعية الدموية المبكر

Summary

نقدم هنا بروتوكولا مرئيا مفصلا لتنفيذ نموذج ربط الأذين الأيسر (LAL) في جنين الطيور. يغير نموذج LAL التدفق داخل القلب ، مما يغير تحميل إجهاد قص الجدار ، ويحاكي متلازمة القلب الأيسر ناقص التنسج. يتم تقديم نهج للتغلب على تحديات نموذج الجراحة المجهرية الصعب هذا.

Abstract

نظرا لتكوين البطين الناضج المكون من أربع غرف ، وسهولة المزرعة ، والوصول إلى التصوير ، والكفاءة ، فإن جنين الطيور هو نموذج حيواني مفضل للفقاريات لدراسة تطور القلب والأوعية الدموية. الدراسات التي تهدف إلى فهم التطور الطبيعي وتشخيص عيوب القلب الخلقية تعتمد هذا النموذج على نطاق واسع. يتم إدخال التقنيات الجراحية المجهرية لتغيير أنماط التحميل الميكانيكية الطبيعية في نقطة زمنية جنينية محددة وتتبع الشلال الجزيئي والجيني في اتجاه مجرى النهر. التدخلات الميكانيكية الأكثر شيوعا هي ربط الوريد الأيسر ، وربط conotruncal ، وربط الأذين الأيسر (LAL) ، وتعديل ضغط الأوعية الدموية داخل الفم وإجهاد قص الجدار بسبب تدفق الدم. LAL ، خاصة إذا تم إجراؤه في البويضات ، هو التدخل الأكثر تحديا ، مع إنتاجية عينة صغيرة جدا بسبب العمليات الجراحية المجهرية المتسلسلة الدقيقة للغاية. على الرغم من مخاطره العالية ، إلا أن LAL في البويضات ذو قيمة علمية كبيرة لأنه يحاكي التسبب في متلازمة القلب الأيسر الناقص التنسج (HLHS). HLHS هو مرض قلبي خلقي معقد ذو صلة سريريا لوحظ عند الأطفال حديثي الولادة. تم توثيق بروتوكول مفصل ل في ovo LAL في هذه الورقة. لفترة وجيزة ، تم تحضين أجنة الطيور المخصبة عند 37.5 درجة مئوية ورطوبة ثابتة بنسبة 60٪ عادة حتى وصلت إلى مراحل هامبرغر هاملتون (HH) من 20 إلى 21. تم تكسير قشر البيض ، وإزالة الأغشية الخارجية والداخلية. تم تدوير الجنين برفق لكشف المصباح الأذيني الأيسر للأذين المشترك. تم وضع العقد الدقيقة المجمعة مسبقا من 10-0 خيوط نايلون برفق وربطها حول برعم الأذين الأيسر. أخيرا ، أعيد الجنين إلى موضعه الأصلي ، وتم الانتهاء من LAL. أظهر البطينان الطبيعيان والبطينان المزودان ب LAL اختلافات ذات دلالة إحصائية في ضغط الأنسجة. سيساهم خط أنابيب توليد نموذج LAL الفعال في الدراسات التي تركز على التلاعب الميكانيكي والجيني المتزامن أثناء التطور الجنيني لمكونات القلب والأوعية الدموية. وبالمثل ، سيوفر هذا النموذج مصدرا للخلايا المضطربة لأبحاث زراعة الأنسجة وبيولوجيا الأوعية الدموية.

Introduction

عيوب القلب الخلقية (CHDs) هي اضطرابات هيكلية تحدث بسبب التطور الجنيني غير الطبيعي¹. بالإضافة إلى الظروف الوراثية ، يتأثر التسبب في المرض بالتحميل الميكانيكي المتغير ^2,3. تؤدي متلازمة القلب الأيسر الناقص التنسج (HLHS) ، وهو مرض خلقي في القلب ، إلى تخلف البطين / الشريان الأورطي عند الولادة⁴ مع ارتفاع معدل الوفيات ^5,6. على الرغم من التطورات الأخيرة في إدارتها السريرية ، لا تزال ديناميكيات نمو الأوعية الدموية وتطورها في HLHS غير واضحة⁷. في التطور الجنيني الطبيعي ، ينشأ شغاف البطين الأي....

Protocol

يتم الحصول على بيض Leghorn الأبيض الخصب من موردين موثوقين ويتم تحضينه وفقا للإرشادات المعتمدة من الجامعة. لا تعتبر أجنة الفرخ ، المراحل من 18 (اليوم 3) إلى 24 (اليوم 4) (المراحل المعروضة في هذه الورقة) فقارية حية بموجب توجيه الاتحاد الأوروبي (EU) 2010/63 / EU وإرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في الولايات المتحدة. تعتبر أجنة الكتاكيت "حية" بعد اليوم 19 من الحضانة وفقا لقوانين الولايات المتحدة ، ولكن ليس للاتحاد الأوروبي. يتم تمييز كل بيضة بتاريخ بدء الفقس ومن المقرر أن تفقس في موعد لا^{يتجاوز 10} أيام من الحضانة. بعد أن يفقس البيض ، تتم إزالة الكتاكيت من الحاضنة. يتم تنفيذ البروتوكول في محطتي تشغيل على الطاولة (المحطة 1 والمحطة 2) ، مع الت....

النتائج

يمكن استخدام تقنيات التصوير المتقدمة التي تم حلها زمنيا لمراقبة التغيرات الهيكلية والمورفولوجية بسبب تدخل LAL¹⁰. علاوة على ذلك ، فإن عينات LAL قابلة أيضا للطرق الجزيئية والبيولوجية^19,28. في الجدول 1 ، يتم تقديم عينات من الدراسات التي استخدم.......

Discussion

في HLHS ، يتم تغيير تدفق الدم بسبب العيوب الهيكلية ، مما يؤدي إلى مورفولوجيا غير طبيعية على الجانب الأيسر^4،6. يوفر النموذج الحالي نظاما تجريبيا عمليا لفهم تطور HLHS بشكل أفضل وقد يحاكي حتى التسبب في^{المرض 8}. ومع ذلك ، فإن إنشاء نموذج حيواني HLHS مكافئ سر.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo