ربط الأذين الأيسر في جنين الطيور كنموذج لتغير الحمل الديناميكي للدورة الدموية أثناء نمو الأوعية الدموية المبكر

Summary

نقدم هنا بروتوكولا مرئيا مفصلا لتنفيذ نموذج ربط الأذين الأيسر (LAL) في جنين الطيور. يغير نموذج LAL التدفق داخل القلب ، مما يغير تحميل إجهاد قص الجدار ، ويحاكي متلازمة القلب الأيسر ناقص التنسج. يتم تقديم نهج للتغلب على تحديات نموذج الجراحة المجهرية الصعب هذا.

Abstract

نظرا لتكوين البطين الناضج المكون من أربع غرف ، وسهولة المزرعة ، والوصول إلى التصوير ، والكفاءة ، فإن جنين الطيور هو نموذج حيواني مفضل للفقاريات لدراسة تطور القلب والأوعية الدموية. الدراسات التي تهدف إلى فهم التطور الطبيعي وتشخيص عيوب القلب الخلقية تعتمد هذا النموذج على نطاق واسع. يتم إدخال التقنيات الجراحية المجهرية لتغيير أنماط التحميل الميكانيكية الطبيعية في نقطة زمنية جنينية محددة وتتبع الشلال الجزيئي والجيني في اتجاه مجرى النهر. التدخلات الميكانيكية الأكثر شيوعا هي ربط الوريد الأيسر ، وربط conotruncal ، وربط الأذين الأيسر (LAL) ، وتعديل ضغط الأوعية الدموية داخل الفم وإجهاد قص الجدار بسبب تدفق الدم. LAL ، خاصة إذا تم إجراؤه في البويضات ، هو التدخل الأكثر تحديا ، مع إنتاجية عينة صغيرة جدا بسبب العمليات الجراحية المجهرية المتسلسلة الدقيقة للغاية. على الرغم من مخاطره العالية ، إلا أن LAL في البويضات ذو قيمة علمية كبيرة لأنه يحاكي التسبب في متلازمة القلب الأيسر الناقص التنسج (HLHS). HLHS هو مرض قلبي خلقي معقد ذو صلة سريريا لوحظ عند الأطفال حديثي الولادة. تم توثيق بروتوكول مفصل ل في ovo LAL في هذه الورقة. لفترة وجيزة ، تم تحضين أجنة الطيور المخصبة عند 37.5 درجة مئوية ورطوبة ثابتة بنسبة 60٪ عادة حتى وصلت إلى مراحل هامبرغر هاملتون (HH) من 20 إلى 21. تم تكسير قشر البيض ، وإزالة الأغشية الخارجية والداخلية. تم تدوير الجنين برفق لكشف المصباح الأذيني الأيسر للأذين المشترك. تم وضع العقد الدقيقة المجمعة مسبقا من 10-0 خيوط نايلون برفق وربطها حول برعم الأذين الأيسر. أخيرا ، أعيد الجنين إلى موضعه الأصلي ، وتم الانتهاء من LAL. أظهر البطينان الطبيعيان والبطينان المزودان ب LAL اختلافات ذات دلالة إحصائية في ضغط الأنسجة. سيساهم خط أنابيب توليد نموذج LAL الفعال في الدراسات التي تركز على التلاعب الميكانيكي والجيني المتزامن أثناء التطور الجنيني لمكونات القلب والأوعية الدموية. وبالمثل ، سيوفر هذا النموذج مصدرا للخلايا المضطربة لأبحاث زراعة الأنسجة وبيولوجيا الأوعية الدموية.

Introduction

عيوب القلب الخلقية (CHDs) هي اضطرابات هيكلية تحدث بسبب التطور الجنيني غير الطبيعي¹. بالإضافة إلى الظروف الوراثية ، يتأثر التسبب في المرض بالتحميل الميكانيكي المتغير ^2,3. تؤدي متلازمة القلب الأيسر الناقص التنسج (HLHS) ، وهو مرض خلقي في القلب ، إلى تخلف البطين / الشريان الأورطي عند الولادة⁴ مع ارتفاع معدل الوفيات ^5,6. على الرغم من التطورات الأخيرة في إدارتها السريرية ، لا تزال ديناميكيات نمو الأوعية الدموية وتطورها في HLHS غير واضحة⁷. في التطور الجنيني الطبيعي ، ينشأ شغاف البطين الأيسر (LV) وعضلة القلب من أسلاف القلب مع تقدم تكوين أنبوب القلب الجنيني المبكر. تم الإبلاغ عن الوجود التدريجي لترابيق عضلة القلب ، وطبقات سميكة ، وتكاثر عضلة القلب². بالنسبة ل HLHS ، لوحظ تغيير إعادة تشكيل التربيق وتسطيح البطين الأيسر ، مما يساهم بشكل أكبر في نقص تنسج عضلة القلب بسبب هجرة خلايا عضلة القلب غير الطبيعية²،⁸،^9،10

من بين الكائنات النموذجية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة نمو القلب وفهم ظروف الدورة الدموية 11 ، يفضل جنين الطيور بسبب قلبه الناضج المكون من أربع غرف وسهولة استزراعه¹¹،¹²،^13،14. من ناحية أخرى ، يوفر الوصول المتقدم للتصوير لأجنة الزرد والفئران المعدلة وراثيا / بالضربة القاضية مزايا مميزة^11,12. تم اختبار التدخلات الميكانيكية المختلفة لجنين الطيور التي تغير الضغط الداخلي وإجهاد قص الجدار في تطوير مكونات القلب والأوعية الدموية. تشمل هذه النماذج ربط vitelline الأيسر ، وربط conotruncal¹⁵ ، وربط الأذين الأيسر (LAL) ¹¹،^12،16. يمكن ملاحظة النمط الظاهري الناتج بسبب الحمل الميكانيكي المتغير حوالي 24-48 ساعة بعد التدخل الجراحي في الدراسات التي تركز على التشخيص المبكر^11,13. يعد تدخل LAL تقنية شائعة لتضييق الحجم الوظيفي للأذين الأيسر (LA) عن طريق وضع حلقة خياطة حول الفتحة الأذينية البطينية. وبالمثل ، تم إجراء التدخلات الجراحية المجهرية التي تستهدف ربط الأذين الأيمن (RAL)^17,18. وبالمثل ، يستهدف بعض الباحثين الزائدة الأذينية اليسرى (LAA) باستخدام مقاطع صغيرة لتقليل حجم LA^19,20. في بعض الدراسات ، يتم تطبيق خيط نايلون جراحي على العقدة الأذينية البطينية^19,21. أحد التدخلات المستخدمة هو LAL ، والذي يمكن أن يحاكي HLHS ولكنه أيضا أصعب نموذج في الأداء ، مع غلة عينة صغيرة جدا بسبب العمليات الجراحية المجهرية الدقيقة للغاية المطلوبة. في مختبرنا ، يتم إجراء LAL في البويضة بين مرحلتي هامبرغر هاميلتون (HH) 20 و 21 ، قبل أن يتم فصل الأذين المشترك بالكامل⁶،¹⁴،^22،23. يتم وضع خياطة جراحية حول لوس أنجلوس ، مما يغير تيارات تدفق الدم داخل القلب. في نماذج LAL من HLHS ، لوحظ زيادة تصلب جدار البطين ، وتغيير زوايا الألياف العضلية ، وانخفاض حجم تجويف LV^14,24.

في مقالة الفيديو هذه ، يتم توفير بروتوكول ونهج مفصل ل في ovo LAL. لفترة وجيزة ، تم تحضين أجنة الطيور المخصبة لإجراء جراحة مجهرية ، وتم تكسير قشر البيض ، وتم تطهير الأغشية الخارجية والداخلية. ثم تم تدوير الجنين ببطء بحيث يمكن الوصول إلى LA. تم ربط خياطة جراحية من النايلون 10-0 ببرعم الأذين ، وأعيد الجنين إلى اتجاهه الأصلي ، ليكمل إجراء LAL²⁵. تتم مقارنة LAL والبطينين الطبيعيين لضغط الأنسجة وحجم البطين عن طريق التصوير المقطعي للتماسك البصري والأنسجة الأساسية.

سيساهم خط أنابيب نموذج LAL الذي تم تنفيذه بنجاح ، كما هو موضح هنا ، في الدراسات الأساسية التي تركز على التطور الجنيني لمكونات القلب والأوعية الدموية. يمكن أيضا استخدام هذا النموذج مع التلاعب الجيني وطرق التصوير المتقدمة. وبالمثل ، فإن نموذج LAL الحاد هو مصدر مستقر لخلايا الأوعية الدموية المريضة لتجارب زراعة الأنسجة.

Protocol

يتم الحصول على بيض Leghorn الأبيض الخصب من موردين موثوقين ويتم تحضينه وفقا للإرشادات المعتمدة من الجامعة. لا تعتبر أجنة الفرخ ، المراحل من 18 (اليوم 3) إلى 24 (اليوم 4) (المراحل المعروضة في هذه الورقة) فقارية حية بموجب توجيه الاتحاد الأوروبي (EU) 2010/63 / EU وإرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في الولايات المتحدة. تعتبر أجنة الكتاكيت "حية" بعد اليوم 19 من الحضانة وفقا لقوانين الولايات المتحدة ، ولكن ليس للاتحاد الأوروبي. يتم تمييز كل بيضة بتاريخ بدء الفقس ومن المقرر أن تفقس في موعد لا^{يتجاوز 10} أيام من الحضانة. بعد أن يفقس البيض ، تتم إزالة الكتاكيت من الحاضنة. يتم تنفيذ البروتوكول في محطتي تشغيل على الطاولة (المحطة 1 والمحطة 2) ، مع التركيز على مراحل توليد النماذج المتخصصة.

1. التحضير قبل الجراحة المجهرية

1. احصل على البيض المخصب إما من مركز تطوير اللقاحات بدرجة محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) أو من خلال مزرعة موردين تجاريين موثوق بها عن طريق ساعي توصيل هش في حاويات البوليسترين الجافة. قبل الحضانة ، قم بتنظيف قشر البيض برفق باستخدام مناديل خالية من النسالة منقوعة في 70٪ إيثانول لإزالة التلوث.
2. معايير إدراج / استبعاد الأجنة
   1. لا تحضن البيض الذي تم تشققه أو تلفه أثناء النقل.
   2. إذا لوحظ نزيف أثناء إجراء LAL أو بعد إعادة الحضانة ، فلا تستخدم الجنين.
   3. لا تستخدم الأجنة النامية في وضع الجانب الأيسر لأعلى ، لأن تدفق الدم الديناميكي قد يختلف عن الاتجاه الطبيعي.
   4. تتطور أجنة Dıscard مع عيوب خلقية في كل من الإجراءات قبل وبعد الجراحة.
   5. قم بتضمين الأجنة التي تصل إلى المرحلة المستهدفة النامية في موقعها الأصلي ، ومحاكاة HLHS كنموذج LA.
3. احتضان بيض الدجاج الأبيض المخصب (Gallus gallus domesticus L.) ، نهاية حادة ، إلى المرحلة المرغوبة عادة عند HH20-21¹⁵ (37.5 درجة مئوية ، رطوبة 60٪ ، 3.5 أيام) (الشكل 1).
   ملاحظة: من المهم الحفاظ على البيض في درجة حرارة ورطوبة ثابتة لزيادة الغلة. اعتمادا على نموذج الحاضنة ، فإن إضافة مقلاة مملوءة بالماء المقطر ستحافظ على رطوبة ثابتة. تم تطوير مخططات لنظام إضافي / إضافي للتحكم في درجة الحرارة والرطوبة يناسب معظم الحاضنات من قبل المؤلفين وأوصى بها. يتم توفير الإلكترونيات والأجهزة وتفاصيل التعليمات البرمجية لوحدة الاستشعار / التحكم الداخلية هذه في مستودع بيانات²⁶. قد يسمح الاهتزاز اللطيف المستمر (الدوران) للبويضات أثناء الحضانة بوضع الجنين الأمثل وبالتالي يؤدي إلى نسبة أعلى من الأجنة "القابلة للتشغيل". يمكن أن يعمل الاهتزاز أيضا مع الحاضنات بهذه السعة وزيادة الإنتاجية بشكل أكبر.
4. قبل البدء في الإجراء ، قم بإعداد العدد المطلوب من العقد عن طريق ربط عقدة علوية فضفاضة في خياطة طولها 1.5 سم 10-0. تأكد من أن العقدة ليست ضيقة وكبيرة بما يكفي لتناسب الأذينين بسهولة أثناء العملية (الشكل 2).
   ملاحظة: اربط العقد مسبقا واحتفظ بها في محلول جرس الفرخ المعقم قبل الاستخدام. تتطلب عملية ربط العقدة استخدام يدين لتشغيل الملقط بشكل متزامن. نظرا لأن هذه مرحلة حرجة في البروتوكول ، يمكن عمل نموذج للأذين من المعجون لممارسة هذه الخطوة (الشكل 3). سيؤدي ذلك إلى تحسين مهارات الجراحة المجهرية ثلاثية الأبعاد اللازمة لأداء الخطوة 3.2.3 في المحطة 2 (الشكل 4).

2. العمليات في المحطة 1 (الشكل 4 أ)

1. افتح نافذة من الطرف الحاد للبيضة وقم بإزالة الأغشية الخارجية والداخلية¹⁵ (الشكل 5A-D).
2. افتح قشر البيض عن طريق تكسير بلطف بالطرف الخلفي للملاقط ، مع دعم الأصابع الحرة للبيضة بقوة لتقليل انتشار التشقق غير المرغوب فيه.
3. نظرا لأن LAL إجراء طويل ، حافظ على درجة حرارة ورطوبة الجنين ، حيث يعتمد معدل ضربات القلب على درجة الحرارة. وبالتالي ، تأكد من إنشاء نافذة shell الأولية صغيرة قدر الإمكان ، بما يكفي لتنفيذ العمليات.
   ملاحظة: لا يتم استخدام أنظمة التحكم في الرطوبة أو درجة الحرارة أثناء العملية ، ولكن هذه الأنظمة ، إذا كانت متوفرة ، ستفيد العائد. إذا أمكن ، يتم إيقاف تشغيل نظام تكييف الهواء في المختبر ، ويتم تنفيذ الإجراء بأعلى درجة حرارة ممكنة للغرفة (RT). يوصى أيضا بتحسين معدل ضربات القلب الجنينية ، والذي يمكن التحكم فيه عن طريق درجة الحرارة ، أثناء العملية. تحافظ بعض المختبرات على معدل ضربات القلب بمعدلات أقل قليلا من 120 نبضة في الدقيقة عن طريق التحكم في درجة الحرارة أثناء عملية LAL. على هذا النحو ، فإن التحكم في الرطوبة المستخدم حول المنطقة الجراحية سيزيد من الغلة أكثر. يتم إنشاء نوافذ قشر البيض صغيرة قدر الإمكان ، كبيرة بما يكفي للسماح بالوصول الجراحي. ينطبق هذا أيضا على الغشاء الخارجي السميك ، والذي عادة ما يكون أصغر من قشر البيض فقط إلى حد محيط الجنين. هذه تضمن الحفاظ على درجة حرارة ورطوبة الجنين. أثناء فتح نافذة من الطرف الحاد للبيضة ، يتم تنظيف شظايا القشرة الصغيرة بحيث لا تلحق هذه القطع الضرر بسلامة الأوعية الدموية أو تؤدي إلى قطع أثرية غير مرغوب فيها. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم المختبرات الأخرى مقصا مسننا صغيرا منحنيا لصنع النوافذ. أيضا ، يمكن استخدام عرضين من شريط سكوتش لتثبيت قشر البيض للتحكم في التشقق.
4. قم بإزالة غشاء vitelline الضروري فقط باستخدام مقص دقيق (الفيديو التكميلي 1).
5. التطور الجنيني الطبيعي هو الجانب الأيمن. بمجرد أن يصبح الجنين خاليا من غشاء vitelline ، ضع الملقط بأطراف مغلقة أسفل الجزء الظهري من الجنين واقلب الجنين برفق لكشف الجانب الأيسر (أي تكوين الجانب الأيسر لأعلى) (الشكل 6A ، B ؛ الشكل 6A ، B ؛ الشكل 6 أ ، ب ؛ الشكل 6 أ ، ب ؛ الشكل 6 أ ، ب ؛ الشكل 6 أ ، ب ، الشكل 6 أ ، ب ، الشكل 6 أ ، ب ، الشكل 6 أ ، ب ، الشكل 6 أ ، ب ؛ الشكل 6 أ ، ب ؛ الشكل 6 أ ، ب ؛ الشكل 6 أ ، ب ؛ الشكل 6 أ ، ب ؛ الشكل 6 أ ، ب ؛ الشكل 6 أ ، ب ؛ الشكل 6 أ ، ب ؛ الشكل 6 فيديو تكميلي 2).
6. تأكد من أن برعم الأذين الأيسر مكشوف الآن ولكنه لا يزال مغطى بنظام غشاء معقد، يتكون عادة من طبقة مزدوجة من التامور.
7. قم بإزالة الأغشية ، بما في ذلك الأغشية الدقيقة ، مباشرة حول برعم الأذيني. هذه مرحلة حرجة أخرى. إجراء إزالة الغشاء من الأغشية الخشنة والتقدم إلى الأغشية الدقيقة حول برعم الأذين الأيسر. احتفظ بأجود أنواع الملقط لإزالة الغشاء الناعم (الفيديو التكميلي 3).
8. أثناء عملية إزالة الغشاء ، قم بتوجيه الجنين في وضع الجانب الأيسر لأعلى ، بحيث يمكن إجراء عملية وضع العقدة في الخطوة 3.2 دون مزيد من إعادة التموضع. لتحقيق ذلك ، ارفع الجنين باستخدام الأغشية في الخطوة 2.6 وعلقه من قشر البيض ، مع التأكد من أن الجانب الأيسر متجها لأعلى.
   ملاحظة: يمكن أن تكون بعض الأجنة قريبة من محيط قشر البيض ويمكن أن يكون من الصعب تشغيلها. ومع ذلك ، من المرجح أن يتم توجيه هذه الأجنة إلى الجانب الأيمن وإظهار السلوك الطبيعي ، ويمكن تضمينها في الدراسة. في هذه الحالات ، إذا لزم الأمر ، يمكن جعل الأذين المحجوب أكثر سهولة عن طريق تنظيف غشاء التامور برفق باستخدام ملاقط دقيقة # 4 وإزالة قشر البيض في الاتجاه العكسي (نحو فتحة القشرة). يمكن أيضا رفع هذه الأجنة باستخدام أجزاء من الأغشية خارج الجنين وتثبيتها في الموضع المطلوب عن طريق ربط أحد طرفي الغشاء (نهاية الملقط) بقشر البيض ، باستخدام لزوجته الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن توسيع المسافة بين الرأس ومنطقة الحبل الشوكي للجنين بمساعدة ملاقط للكشف عن الأذين المحجوب.

3. العمليات في المحطة 2 (الشكل 4B)

1. تحت المجهر المجسم ، ضع العقدة المعدة مسبقا من الخطوة 1.4 بالقرب من الجنين في مكان يسهل الوصول إليه (الشكل 6 ب). البرعم الأذيني جاهز الآن للربط (الفيديو التكميلي 4).
2. استرجع العقدة المفتوحة المعدة مسبقا وقم بتوجيهها فوق برعم الأذين الأيسر. لكي يعمل LAL ، ضع البيضة في اتجاه ثلاثي الأبعاد يميل بشكل فريد.
   1. قم بتوجيه العقدة بشكل صحيح لتنفيذ عملية الشد دون إتلاف الأجنة.
   2. نظف الأغشية الدقيقة على النحو الأمثل في الخطوة 2.7 لتقليل تأثير القلب النابض.
   3. شد الخيط (الشكل 6 ج). في هذه الخطوة ، يعد التدرب على المعجون مفيدا جدا. بالنسبة للأجنة الوهمية ، شد العقدة بما يكفي لعقد العقدة.
3. بعد ذلك ، استخدم المقص الصغير لقطع الأطراف الزائدة للخياطة في أقرب وقت ممكن من البرعم (الفيديو التكميلي 5).
4. كن حذرا جدا من أن الأطراف المقطوعة حديثا من الخيط المربوط ليست في وضع يمكنها من ثقب الأوعية القريبة أثناء الدوران أو بسبب ضربات القلب.
5. باستخدام الملقط ، قم بإزالة قطع الخياطة الزائدة المقطوعة في الخطوة 3.3.
6. أخيرا ، باستخدام ملاقط مغلقة ، أعد الجنين إلى موضعه الأصلي ، كما في الخطوة 2.5 (الفيديو التكميلي 6).
7. بعد الانتهاء من عملية LAL ، قم بتغطية البويضة بطبقة مزدوجة من البارافيلم واحتضانها مرة أخرى. يعد الإغلاق المحكم والمعقم للبيض أمرا بالغ الأهمية للبقاء على قيد الحياة ، خاصة بعد 24 ساعة من الحضانة. إذا كان الوصول البصري مطلوبا أيضا ، فاستخدم شمع البارافين مع الشرائح الزجاجية.
   ملاحظة: عند دراسة الفترة الجنينية المبكرة ، يتم تحضين البيض عادة لمدة 24-48 ساعة حتى تصل إلى HH25 أو HH27 تقريبا. ومع ذلك ، لا يوجد حد ، ويمكن دراسة المراحل اللاحقة ، كما حاول باحثون آخرون. لسرعات التشغيل العالية ، يوصى بفريق من شخصين على الأقل. يجب تدريب شخص واحد على فتح البويضة وتنظيف الغشاء الأولي والدوران وتنظيف الغشاء حول برعم الأذين الأيسر ويكون مسؤولا عنه. الشخص الآخر مسؤول فقط عن إعداد العقدة الأولية ووضع العقدة والشد. يمكن إجراء دوران الجنين النهائي بواسطة الشخص 1. تستغرق العملية الجراحية لجنين واحد حوالي 4-5 دقائق.
8. قبل / بعد العمليات الجراحية ، قم بتنظيف الأسطح والأدوات الموجودة على مقاعد البدلاء بالإيثانول. تأكد من تطبيق محلول جرس الفرخ الطازج (كلوريد الصوديوم ، KCl ، CaCl₂ ، و NaHCO₃) ^16,27 على الأدوات المعدنية التي تلامس الأنسجة الجنينية.

النتائج

يمكن استخدام تقنيات التصوير المتقدمة التي تم حلها زمنيا لمراقبة التغيرات الهيكلية والمورفولوجية بسبب تدخل LAL¹⁰. علاوة على ذلك ، فإن عينات LAL قابلة أيضا للطرق الجزيئية والبيولوجية^19,28. في الجدول 1 ، يتم تقديم عينات من الدراسات التي استخدم...

Discussion

في HLHS ، يتم تغيير تدفق الدم بسبب العيوب الهيكلية ، مما يؤدي إلى مورفولوجيا غير طبيعية على الجانب الأيسر^4،6. يوفر النموذج الحالي نظاما تجريبيا عمليا لفهم تطور HLHS بشكل أفضل وقد يحاكي حتى التسبب في^{المرض 8}. ومع ذلك ، فإن إنشاء نموذج حيواني HLHS مكافئ سر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo