Ligadura auricular izquierda en embrión aviar como modelo de carga hemodinámica alterada durante el desarrollo vascular temprano

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo visual detallado para ejecutar el modelo de ligadura auricular izquierda (LAL) en el embrión aviar. El modelo LAL altera el flujo intracardíaco, lo que cambia la carga de tensión de cizallamiento de la pared, imitando el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico. Se presenta un enfoque para superar los desafíos de este difícil modelo de microcirugía.

Resumen

Debido a su configuración ventricular madura de cuatro cámaras, facilidad de cultivo, acceso a imágenes y eficiencia, el embrión aviar es un modelo animal vertebrado preferido para estudiar el desarrollo cardiovascular. Los estudios que tienen como objetivo comprender el desarrollo normal y el pronóstico de las cardiopatías congénitas adoptan ampliamente este modelo. Se introducen técnicas quirúrgicas microscópicas para alterar los patrones normales de carga mecánica en un punto de tiempo embrionario específico y rastrear la cascada molecular y genética posterior. Las intervenciones mecánicas más comunes son la ligadura de la vena vitelina izquierda, la banda conotruncal y la ligadura auricular izquierda (LAL), modulando la presión vascular intramural y el esfuerzo de cizallamiento de la pared debido al flujo sanguíneo. La LAL, especialmente si se realiza en ovo, es la intervención más difícil, con rendimientos de muestra muy pequeños debido a las operaciones microquirúrgicas secuenciales extremadamente finas. A pesar de su alto riesgo, el LAL in ovo es muy valioso científicamente, ya que imita la patogénesis del síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS). La HLHS es una cardiopatía congénita compleja clínicamente relevante que se observa en recién nacidos humanos. En este documento se documenta un protocolo detallado para la LAL in ovo . Brevemente, los embriones aviares fertilizados se incubaron a 37,5 °C y 60% de humedad constante, por lo general, hasta que alcanzaron las etapas 20 a 21 de Hamburger-Hamilton (HH). Las cáscaras de huevo se abrieron y se quitaron las membranas externas e internas. El embrión se rotó suavemente para exponer el bulbo auricular izquierdo de la aurícula común. Los micronudos preensamblados de suturas de nailon 10-0 se colocaron suavemente y se ataron alrededor de la yema auricular izquierda. Finalmente, el embrión fue devuelto a su posición original y se completó la LAL. Los ventrículos normales e instrumentados por LAL demostraron diferencias estadísticamente significativas en la compactación tisular. Una línea eficiente de generación de modelos LAL contribuiría a los estudios centrados en la manipulación mecánica y genética sincronizada durante el desarrollo embrionario de los componentes cardiovasculares. Del mismo modo, este modelo proporcionará una fuente celular perturbada para la investigación de cultivos de tejidos y biología vascular.

Introducción

Los defectos cardíacos congénitos (CC) son trastornos estructurales que ocurren debido a un desarrollo embrionario anormal¹. Además de las condiciones genéticas, la patogenia está influenciada por la alteración de la carga mecánica ^2,3. El síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS), una cardiopatía congénita, da lugar a un ventrículo/aorta subdesarrollado al nacer⁴ con una alta tasa de mortalidad ^5,6. A pesar de los recientes avances en su manejo clínico, la dinámica de crecimiento y desarrollo vas....

Protocolo

Los huevos fértiles de Livorno blanco se obtienen de proveedores confiables y se incuban de acuerdo con las pautas aprobadas por la universidad. Los embriones de pollo, estadios 18 (día 3) a 24 (día 4) (los estadios presentados en este artículo) no se consideran animales vertebrados vivos por la directiva 2010/63/UE de la Unión Europea (UE) y las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en los Estados Unidos. Los embriones de pollo se consideran "animales vivos" después del día 19 de incubación según las leyes de EE. UU., pero no para la UE. Cada huevo está etiquetado con la fecha de inicio de la eclosión y está programado para eclosio....

Discusión

En el HLHS, el flujo sanguíneo se altera debido a defectos estructurales, lo que lleva a una morfología anormal en el lado izquierdo ^4,6. El presente modelo proporciona un sistema experimental práctico para comprender mejor la progresión del HLHS e incluso puede imitar su patogenia⁸. Sin embargo, establecer un modelo animal de HLHS totalmente equivalente desde el punto de vista clínico es una tarea difícil. Además del modelo de LAL .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo