Erken Vasküler Gelişim Sırasında Değişen Hemodinamik Yükleme için Bir Model Olarak Kuş Embriyosunda Sol Atriyal Ligasyon

Özet

Burada, kuş embriyosunda sol atriyal ligasyon (LAL) modelinin yürütülmesi için ayrıntılı bir görsel protokol sunuyoruz. LAL modeli, hipoplastik sol kalp sendromunu taklit ederek duvar kesme gerilimi yükünü değiştiren intrakardiyak akışı değiştirir. Bu zor mikrocerrahi modelinin zorluklarının üstesinden gelmek için bir yaklaşım sunulmaktadır.

Özet

Dört odacıklı olgun ventriküler konfigürasyonu, kültür kolaylığı, görüntüleme erişimi ve verimliliği nedeniyle, kuş embriyosu kardiyovasküler gelişimi incelemek için tercih edilen bir omurgalı hayvan modelidir. Normal gelişimi ve konjenital kalp defekti prognozunu anlamaya yönelik çalışmalar bu modeli yaygın olarak benimsemektedir. Belirli bir embriyonik zaman noktasında normal mekanik yükleme modellerini değiştirmek ve aşağı akış moleküler ve genetik kaskadı izlemek için mikroskobik cerrahi teknikler tanıtıldı. En sık yapılan mekanik girişimler sol vitellin ven ligasyonu, konorunkal bantlama ve sol atriyal ligasyondur (LAL), intramural vasküler basıncı ve kan akımına bağlı duvar kayma stresini modüle eder. LAL, özellikle ovo'da yapıldığında, son derece ince ardışık mikrocerrahi operasyonlar nedeniyle çok küçük numune verimleri ile en zorlu müdahaledir. Yüksek riskine rağmen in ovo LAL, hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS) patogenezini taklit ettiği için bilimsel olarak çok değerlidir. HLHS, insan yenidoğanlarında gözlenen klinik olarak anlamlı, karmaşık bir konjenital kalp hastalığıdır. Bu yazıda in ovo LAL için ayrıntılı bir protokol belgelenmiştir. Kısaca, döllenmiş kuş embriyoları, tipik olarak Hamburger-Hamilton (HH) aşamaları 20 ila 21'e ulaşana kadar 37.5 ° C'de ve% 60 sabit nemde inkübe edildi. Yumurta kabukları kırılarak açıldı ve dış ve iç zarlar çıkarıldı. Embriyo, ortak atriyumun sol atriyal ampulünü ortaya çıkarmak için hafifçe döndürüldü. 10-0 naylon sütürlerden önceden monte edilmiş mikro düğümler nazikçe konumlandırıldı ve sol atriyal tomurcuğun etrafına bağlandı. Son olarak, embriyo orijinal konumuna geri döndürüldü ve LAL tamamlandı. Normal ve LAL aletli ventriküller doku sıkışmasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gösterdi. Verimli bir LAL model üretim hattı, kardiyovasküler bileşenlerin embriyonik gelişimi sırasında senkronize mekanik ve genetik manipülasyona odaklanan çalışmalara katkıda bulunacaktır. Benzer şekilde, bu model doku kültürü araştırmaları ve vasküler biyoloji için bozulmuş bir hücre kaynağı sağlayacaktır.

Giriş

Konjenital kalp defektleri (KKH'ler), anormal embriyonik gelişime bağlı olarak ortaya çıkan yapısal bozukluklardır¹. Genetik koşullara ek olarak, patogenez değişen mekanik yüklemeden^{etkilenir 2,3}. Konjenital bir kalp hastalığı olan hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS), doğumda az gelişmiş bir ventrikül/aort ile sonuçlanır⁴ ve yüksek mortalite^{oranı 5,6}. Klinik yönetimindeki son gelişmelere rağmen, HLHS'nin vasküler büyüme ve gelişme dinamikleri hala belirsizdir⁷. Normal embriyonik g....

Protokol

Verimli beyaz Leghorn yumurtaları güvenilir tedarikçilerden elde edilir ve üniversite onaylı yönergelere göre kuluçkaya yatırılır. Civciv embriyoları, evre 18 (gün 3) ila 24 (gün 4) (bu yazıda sunulan aşamalar), Avrupa Birliği (AB) direktifi 2010/63/EU ve ABD'deki kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) yönergeleri tarafından canlı omurgalı hayvanlar olarak kabul edilmemektedir. Civciv embriyoları, ABD yasalarına göre kuluçkanın 19. gününden sonra "canlı hayvan" olarak kabul edilir, ancak AB için değildir. Her yumurta, kuluçka başlangıç tarihi ile etiketlenir ve kuluçkanın en geç 10^{. gününden} önce yumurtadan çıkması planlanır. Yumurtalar çatlad....

Tartışmalar

HLHS'de, yapısal kusurlar nedeniyle kan akışı değişir ve sol tarafta anormal morfolojiye yol açar ^4,6. Mevcut model, HLHS'nin ilerlemesini daha iyi anlamak için pratik bir deneysel sistem sağlar ve hatta patogenezini^{taklit edebilir 8}. Bununla birlikte, klinik olarak tamamen eşdeğer bir HLHS hayvan modeli oluşturmak zorlu bir iştir. Burada sunulan kuş LAL modeline ek olarak, farelerde, fetal koyunlarda ve kurbağalarda yapıla.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo