Erken Vasküler Gelişim Sırasında Değişen Hemodinamik Yükleme için Bir Model Olarak Kuş Embriyosunda Sol Atriyal Ligasyon

Özet

Burada, kuş embriyosunda sol atriyal ligasyon (LAL) modelinin yürütülmesi için ayrıntılı bir görsel protokol sunuyoruz. LAL modeli, hipoplastik sol kalp sendromunu taklit ederek duvar kesme gerilimi yükünü değiştiren intrakardiyak akışı değiştirir. Bu zor mikrocerrahi modelinin zorluklarının üstesinden gelmek için bir yaklaşım sunulmaktadır.

Özet

Dört odacıklı olgun ventriküler konfigürasyonu, kültür kolaylığı, görüntüleme erişimi ve verimliliği nedeniyle, kuş embriyosu kardiyovasküler gelişimi incelemek için tercih edilen bir omurgalı hayvan modelidir. Normal gelişimi ve konjenital kalp defekti prognozunu anlamaya yönelik çalışmalar bu modeli yaygın olarak benimsemektedir. Belirli bir embriyonik zaman noktasında normal mekanik yükleme modellerini değiştirmek ve aşağı akış moleküler ve genetik kaskadı izlemek için mikroskobik cerrahi teknikler tanıtıldı. En sık yapılan mekanik girişimler sol vitellin ven ligasyonu, konorunkal bantlama ve sol atriyal ligasyondur (LAL), intramural vasküler basıncı ve kan akımına bağlı duvar kayma stresini modüle eder. LAL, özellikle ovo'da yapıldığında, son derece ince ardışık mikrocerrahi operasyonlar nedeniyle çok küçük numune verimleri ile en zorlu müdahaledir. Yüksek riskine rağmen in ovo LAL, hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS) patogenezini taklit ettiği için bilimsel olarak çok değerlidir. HLHS, insan yenidoğanlarında gözlenen klinik olarak anlamlı, karmaşık bir konjenital kalp hastalığıdır. Bu yazıda in ovo LAL için ayrıntılı bir protokol belgelenmiştir. Kısaca, döllenmiş kuş embriyoları, tipik olarak Hamburger-Hamilton (HH) aşamaları 20 ila 21'e ulaşana kadar 37.5 ° C'de ve% 60 sabit nemde inkübe edildi. Yumurta kabukları kırılarak açıldı ve dış ve iç zarlar çıkarıldı. Embriyo, ortak atriyumun sol atriyal ampulünü ortaya çıkarmak için hafifçe döndürüldü. 10-0 naylon sütürlerden önceden monte edilmiş mikro düğümler nazikçe konumlandırıldı ve sol atriyal tomurcuğun etrafına bağlandı. Son olarak, embriyo orijinal konumuna geri döndürüldü ve LAL tamamlandı. Normal ve LAL aletli ventriküller doku sıkışmasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gösterdi. Verimli bir LAL model üretim hattı, kardiyovasküler bileşenlerin embriyonik gelişimi sırasında senkronize mekanik ve genetik manipülasyona odaklanan çalışmalara katkıda bulunacaktır. Benzer şekilde, bu model doku kültürü araştırmaları ve vasküler biyoloji için bozulmuş bir hücre kaynağı sağlayacaktır.

Giriş

Konjenital kalp defektleri (KKH'ler), anormal embriyonik gelişime bağlı olarak ortaya çıkan yapısal bozukluklardır¹. Genetik koşullara ek olarak, patogenez değişen mekanik yüklemeden^{etkilenir 2,3}. Konjenital bir kalp hastalığı olan hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS), doğumda az gelişmiş bir ventrikül/aort ile sonuçlanır⁴ ve yüksek mortalite^{oranı 5,6}. Klinik yönetimindeki son gelişmelere rağmen, HLHS'nin vasküler büyüme ve gelişme dinamikleri hala belirsizdir⁷. Normal embriyonik gelişimde, erken embriyonik kalp tüpü oluşumu ilerledikçe sol ventrikül (LV) endokard ve miyokard kardiyak progenitörlerden köken alır. Miyokardiyal trabekülasyon, kalınlaşma tabakaları ve kardiyomiyosit proliferasyonunun kademeli varlığı bildirilmiştir². HLHS için, anormal kardiyomiyosit göçüne bağlı miyokardiyal hipoplaziye daha fazla katkıda bulunan değişmiş trabeküler yeniden şekillenme ve sol ventrikül düzleşmesi gözlenir 2,8,9,10

Kalp gelişimini incelemek ve hemodinamik durumları anlamak için yaygın olarak kullanılan model organizmalar arasında 11, kuş embriyosu dört odacıklı olgun kalbi ve kültür kolaylığı nedeniyle tercih edilmektedir^11,12,13,14. Öte yandan, zebra balığı embriyolarının ve transgenik/nakavt farelerin gelişmiş görüntüleme erişimi belirgin avantajlar sağlar^11,12. Gelişmekte olan kardiyovasküler bileşenlerde intramural basıncı ve duvar kesme stresini değiştiren kuş embriyosu için çeşitli mekanik müdahaleler test edilmiştir. Bu modeller arasında sol vitellin ligasyonu, konorunkal bantlama¹⁵ ve sol atriyal ligasyon (LAL)^11,12,16 bulunur. Değişen mekanik yüklemeye bağlı olarak ortaya çıkan fenotip, erken prognoza odaklanan çalışmalarda cerrahi müdahaleden yaklaşık 24-48 saat sonra gözlenebilir^11,13. LAL müdahalesi, atriyoventriküler açıklığın etrafına bir dikiş halkası yerleştirerek sol atriyumun (LA) fonksiyonel hacmini daraltmak için popüler bir tekniktir. Aynı şekilde, sağ atriyal ligasyonu (RAL) hedefleyen mikrocerrahi müdahaleler de ^{gerçekleştirilmiştir17,18}. Benzer şekilde, bazı araştırmacılar LA ^19,20'nin hacmini azaltmak için mikro klipsler kullanarak sol atriyal apendiksleri (LAA) hedefler. Bazı çalışmalarda, atriyoventriküler düğüme cerrahi bir naylon iplik uygulanır^19,21. Kullanılan müdahalelerden biri, HLHS'yi taklit edebilen ancak aynı zamanda yapılması en zor model olan, son derece ince mikrocerrahi operasyonlar nedeniyle çok küçük numune verimleri olan LAL'dir. Laboratuvarımızda LAL, ortak atriyum 6,14,22,23 tam bölünmeden önce^, Hamburger-Hamilton (HH) evre 20 ve ²¹ arasında ovo olarak gerçekleştirilir. LA'nın etrafına, intrakardiyak kan akış akışlarını değiştiren bir cerrahi dikiş yerleştirilir. HLHS'nin LAL modellerinde artmış ventrikül duvar sertliği, değişmiş miyofiber açıları ve azalmış LV kavite boyutu gözlenmiştir^14,24.

Bu video makalesinde, in ovo LAL için ayrıntılı bir protokol ve yaklaşım sunulmaktadır. Kısaca, döllenen kuş embriyoları mikrocerrahi için inkübe edildi, yumurta kabuğu çatlatılarak açıldı ve dış ve iç zarlar temizlendi. Embriyo daha sonra LA'ya erişilebilmesi için yavaşça döndürüldü. Atriyal tomurcuğa 10-0 naylon cerrahi sütür bağlandı ve embriyo orijinal oryantasyonuna geri döndürülerek LAL prosedürü²⁵ tamamlandı. LAL ve normal ventriküller, optik koherens tomografi ve temel histoloji ile doku sıkışması ve ventrikül hacmi açısından karşılaştırıldı.

Burada açıklandığı gibi, başarılı bir şekilde yürütülen bir LAL model boru hattı, kardiyovasküler bileşenlerin embriyonik gelişimine odaklanan temel çalışmalara katkıda bulunacaktır. Bu model aynı zamanda genetik manipülasyonlar ve ileri görüntüleme yöntemleri ile birlikte de kullanılabilir. Benzer şekilde, akut LAL modeli, doku kültürü deneyleri için hastalıklı vasküler hücrelerin stabil bir kaynağıdır.

Protokol

Verimli beyaz Leghorn yumurtaları güvenilir tedarikçilerden elde edilir ve üniversite onaylı yönergelere göre kuluçkaya yatırılır. Civciv embriyoları, evre 18 (gün 3) ila 24 (gün 4) (bu yazıda sunulan aşamalar), Avrupa Birliği (AB) direktifi 2010/63/EU ve ABD'deki kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) yönergeleri tarafından canlı omurgalı hayvanlar olarak kabul edilmemektedir. Civciv embriyoları, ABD yasalarına göre kuluçkanın 19. gününden sonra "canlı hayvan" olarak kabul edilir, ancak AB için değildir. Her yumurta, kuluçka başlangıç tarihi ile etiketlenir ve kuluçkanın en geç 10^{. gününden} önce yumurtadan çıkması planlanır. Yumurtalar çatladıktan sonra civcivler kuluçka makinesinden çıkarılır. Protokol, özel model oluşturma aşamalarına odaklanarak iki tezgah üstü operasyon istasyonunda (İstasyon 1 ve İstasyon 2) gerçekleştirilir.

1. Mikrocerrahi öncesi hazırlık

1. Döllenmiş yumurtaları ya belirli bir patojen içermeyen (SPF) dereceye sahip bir aşı geliştirme merkezinden ya da kuru polistiren kaplarda kırılgan bir teslimat kuryesi ile güvenilir bir ticari tedarikçi çiftliğinden alın. Kuluçkadan önce, kontaminasyonu gidermek için yumurta kabuğunu %70 etanole batırılmış tüy bırakmayan mendillerle nazikçe temizleyin.
2. Embriyo dahil etme/dışlama kriterleri
   1. Taşıma sırasında çatlamış veya hasar görmüş yumurtaları kuluçkaya yatırmayın.
   2. LAL prosedürü sırasında veya yeniden inkübasyondan sonra kanama görülürse, embriyoyu kullanmayın.
   3. Hemodinamik kan akışı normal oryantasyondan farklı olabileceğinden, sol taraf yukarı pozisyonda gelişen embriyoları kullanmayın.
   4. Hem cerrahi öncesi hem de cerrahi sonrası işlemlerde doğuştan kusurlarla gelişen diş implantları.
   5. HLHS'yi bir LAL modeli olarak taklit ederek, orijinal konumlarında gelişen hedeflenen aşamaya ulaşan embriyoları dahil edin.
3. Döllenmiş beyaz Leghorn tavuk yumurtalarını (Gallus gallus domesticus L.), kör uç, tipik olarak HH20-21^15'te (37.5 °C, %60 nem, 3.5 gün) istenen aşamaya kadar kuluçkaya yatırın (Şekil 1).
   NOT: Verimi artırmak için yumurtaları sabit bir sıcaklık ve nemde tutmak önemlidir. Kuluçka makinesi modeline bağlı olarak, damıtılmış suyla doldurulmuş bir kabın eklenmesi sabit nemi koruyacaktır. Çoğu inkübatöre uyacak ek / yardımcı bir sıcaklık ve nem kontrol sisteminin planları yazarlar tarafından geliştirilmiştir ve tavsiye edilir. Bu şirket içi yerleşik sensör/kontrol ünitesinin elektronik, donanım ve kod ayrıntıları bir veri deposunda^{sağlanır 26}. Kuluçka sırasında yumurtaların sürekli olarak hafifçe sallanması (döndürülmesi), embriyonun en uygun şekilde konumlandırılmasına izin verebilir ve böylece daha yüksek oranda "çalıştırılabilir" embriyoya yol açabilir. Çalkalama, bu kapasiteye sahip inkübatörlerle de çalışabilir ve verimliliği daha da artırabilir.
4. İşleme başlamadan önce, 1,5 cm uzunluğunda 10-0'lık bir dikişe gevşek bir el üstü düğüm atarak gerekli sayıda düğüm hazırlayın. Ameliyat sırasında düğümün sıkı olmadığından ve kulakçıklara kolayca sığacak kadar büyük olduğundan emin olun (Şekil 2).
   NOT: Düğümleri önceden bağlayın ve kullanmadan önce steril bir civciv zil solüsyonunda saklayın. Düğüm atma işlemi, cımbızı eşzamanlı olarak çalıştırmak için iki elin kullanılmasını gerektirir. Bu, protokolde kritik bir aşama olduğundan, bu adımı uygulamak için macundan bir atriyum modeli yapılabilir (Şekil 3). Bu, İstasyon 2'de adım 3.2.3'ü gerçekleştirmek için gereken üç boyutlu mikrocerrahi becerilerini geliştirecektir (Şekil 4).

2. İstasyon 1'deki Operasyonlar (Şekil 4A)

1. Yumurtanın kör ucundan bir pencere açın ve hem dış hem de iç zarları¹⁵ çıkarın (Şekil 5A-D).
2. İstenmeyen çatlak yayılımını azaltmak için serbest parmaklar yumurtayı sıkıca destekleyecek şekilde cımbızın ters ucuyla hafifçe çatlatarak yumurta kabuğunu açın.
3. LAL uzun bir prosedür olduğundan, kalp atış hızı sıcaklığa bağlı olduğundan embriyonun sıcaklığını ve nemini koruyun. Bu nedenle, ilk kabuk penceresinin mümkün olduğunca küçük, işlemleri yürütmeye yetecek kadar oluşturulduğundan emin olun.
   NOT: Çalışma sırasında nem veya sıcaklık kontrol sistemleri kullanılmaz, ancak bu sistemler varsa verime fayda sağlar. Mümkünse, laboratuvardaki klima sistemi kapatılır ve prosedür mümkün olan en yüksek oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilir. Operasyon sırasında sıcaklıkla kontrol edilebilen embriyonik kalp atış hızının optimizasyonu da önerilir. Bazı laboratuvarlar, LAL işlemi sırasında sıcaklık kontrolü yoluyla kalp atış hızını 120 bpm'den biraz daha düşük oranlarda tutar. Bu nedenle, cerrahi bölge çevresinde uygulanan nem kontrolü, verimi daha da artıracaktır. Yumurta kabuğu pencereleri mümkün olduğunca küçük, sadece cerrahi erişime izin verecek kadar büyük oluşturulur. Bu aynı zamanda, tipik olarak yumurta kabuğundan sadece embriyonun çevresi kadar daha küçük olan kalın dış zar için de geçerlidir. Bunlar embriyonun sıcaklığını ve nemini korumayı sağlar. Yumurtanın küt ucundan bir pencere açılırken, küçük kabuk parçaları temizlenir, böylece bu parçalar vitellin damar bütünlüğüne zarar vermez veya istenmeyen artefaktlara yol açmaz. Ek olarak, diğer laboratuvarlar pencere yapmak için kavisli mikro tırtıklı makaslar kullanır. Ayrıca, çatlamayı kontrol etmek için yumurta kabuğunu stabilize etmek için iki genişlikte Scotch bant kullanılabilir.
4. Mikro makas kullanarak sadece gerekli vitellin membranını çıkarın (Ek Video 1).
5. Normal embriyonik gelişim sağ taraf yukarıdadır. Embriyo vitellin zarından kurtulduktan sonra, cımbızı kapalı uçlu olarak embriyonun dorsal segmentinin altına yerleştirin ve sol tarafı ortaya çıkarmak için embriyoyu hafifçe çevirin (yani, sol taraf yukarı konfigürasyonu) (Şekil 6A, B; Ek Video 2).
6. Sol atriyal tomurcuğun şimdi açıkta kaldığından, ancak yine de tipik olarak perikardın çift katmanından oluşan karmaşık bir zar sistemi ile kaplandığından emin olun.
7. İnce olanlar da dahil olmak üzere zarları atriyal tomurcuğun hemen çevresinden çıkarın. Bu başka bir kritik aşamadır; Kaba zarlardan zar çıkarma işlemini gerçekleştirin ve sol atriyal tomurcuk çevresindeki ince zarlara ilerleyin. İnce zarın çıkarılması için en iyi cımbızları ayırın (Ek Video 3).
8. Membran çıkarma işlemi sırasında, embriyoyu sol taraf yukarı doğru yönlendirin, böylece adım 3.2'deki düğüm yerleştirme işlemi daha fazla yeniden konumlandırma olmadan gerçekleştirilebilir. Bunu başarmak için, adım 2.6'daki zarları kullanarak embriyoyu kaldırın ve sol tarafı yukarı bakacak şekilde yumurta kabuğundan asın.
   NOT: Bazı embriyolar yumurta kabuğu çevresine yakın yerleştirilebilir ve çalıştırılması zor olabilir. Yine de, bu embriyolar büyük olasılıkla sağ tarafa yönlendirilecek ve normal davranış sergileyecek ve çalışmaya dahil edilebilir. Bu durumlarda, gerekirse, perikardiyal membranı #4 ince cımbızla nazikçe temizleyerek ve yumurta kabuğunu ters yönde (kabuk açıklığına doğru) çıkararak gizlenmiş atriyum daha erişilebilir hale getirilebilir. Bu embriyolar ayrıca ekstraembriyonik zarların parçaları kullanılarak kaldırılabilir ve zarın bir ucu (cımbız ucu) yumurta kabuğuna tutturularak doğal yapışkanlığı kullanılarak istenen pozisyonda sabitlenebilir. Ek olarak, embriyonun baş ve omurilik bölgesi arasındaki boşluk, gizlenmiş kulakçıkları ortaya çıkarmak için cımbız yardımıyla genişletilebilir.

3. İstasyon 2'deki Operasyonlar (Şekil 4B)

1. Stereomikroskop altında, önceden hazırlanmış düğümü adım 1.4'ten embriyoya yakın erişilebilir bir yere yerleştirin (Şekil 6B). Atriyal tomurcuk artık bağlanmaya hazırdır (Ek Video 4).
2. Önceden hazırlanmış açık düğümü alın ve sol atriyal tomurcuğun üzerine yönlendirin. LAL'in çalışması için, yumurtayı benzersiz bir şekilde eğimli üç boyutlu bir yöne yerleştirin.
   1. Embriyolara zarar vermeden sıkma işlemini gerçekleştirmek için düğümü doğru şekilde yönlendirin.
   2. Atan bir kalbin etkisini azaltmak için 2.7. adımda ince zarları en uygun şekilde temizleyin.
   3. Sütürü sıkın (Şekil 6C). Bu adım için macunla pratik yapmak çok faydalıdır. Sahte embriyolar için, düğümü tutacak kadar sıkın.
3. Ardından, dikişin fazla uçlarını tomurcuğa mümkün olduğunca yakın kesmek için mikro makası kullanın (Ek Video 5).
4. Bağlanan dikişin yeni kesilen uçlarının, rotasyon sırasında veya kalp atışı nedeniyle yakındaki damarları delecek konumda olmamasına çok dikkat edin.
5. Cımbız kullanarak, adım 3.3'te kesilen fazla dikiş parçalarını çıkarın.
6. Son olarak, kapalı cımbız kullanarak, embriyoyu adım 2.5'teki gibi orijinal konumuna getirin (Ek Video 6).
7. LAL işlemini tamamladıktan sonra, yumurtayı çift kat parafilm ile kaplayın ve tekrar inkübe edin. Yumurtaların sıkı ve steril bir şekilde kapatılması, özellikle 24 saatlik kuluçka döneminden sonra hayatta kalmak için çok önemlidir. Görsel erişim de isteniyorsa, cam slaytlarla parafin mumu kullanın.
   NOT: Erken embriyonik dönem incelendiğinde, yumurtalar tipik olarak yaklaşık HH25 veya HH27'ye ulaşana kadar 24-48 saat kuluçkaya yatırılır. Bununla birlikte, herhangi bir sınır yoktur ve diğer araştırmacılar tarafından denendiği gibi daha sonraki aşamalar incelenebilir. Yüksek çalışma hızları için en az iki kişilik bir ekip önerilir. Bir kişi yumurta açma, ilk membran temizliği, rotasyon ve sol atriyal tomurcuk etrafındaki membran temizliği için eğitilmeli ve bundan sorumludur. Diğer kişi sadece ilk düğüm hazırlığından, düğüm yerleştirmeden ve sıkmadan sorumludur. Son embriyo rotasyonu Kişi 1 tarafından yapılabilir. Tek bir embriyo için cerrahi operasyon yaklaşık 4-5 dakika sürer.
8. Cerrahi operasyonlardan önce/sonra tezgah üstü yüzeyleri ve aletleri etanol ile temizleyin. Embriyonik dokulara dokunan metal aletlere taze civciv zil solüsyonu (NaCl, KCl, CaCl₂ ve NaHCO₃)^16,27 uyguladığınızdan emin olun.

Sonuçlar

LAL müdahalesine bağlı yapısal ve morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için ileri zaman çözümlü görüntüleme teknikleri kullanılabilir¹⁰. Ayrıca, LAL numuneleri moleküler ve biyolojik yöntemlere^{de uygundur 19,28}. Tablo 1'de, LAL modeli sonuçlarının kullanıldığı örnek çalışmalar verilmiştir. Bu kapsamda HH20-21'e ulaşan civciv embriyolarına LAL müdahalesi yapıldı. Hem kontrol (sağlıklı...

Tartışmalar

HLHS'de, yapısal kusurlar nedeniyle kan akışı değişir ve sol tarafta anormal morfolojiye yol açar ^4,6. Mevcut model, HLHS'nin ilerlemesini daha iyi anlamak için pratik bir deneysel sistem sağlar ve hatta patogenezini^{taklit edebilir 8}. Bununla birlikte, klinik olarak tamamen eşdeğer bir HLHS hayvan modeli oluşturmak zorlu bir iştir. Burada sunulan kuş LAL modeline ek olarak, farelerde, fetal koyunlarda ve kurbağalarda yapıla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo