초기 혈관 발달 중 변경된 혈류역학적 하중에 대한 모델로서의 조류 배아의 좌심방 결찰

요약

여기에서는 조류 배아에서 좌심방 결찰(LAL) 모델을 실행하기 위한 자세한 시각적 프로토콜을 제시합니다. LAL 모델은 벽 전단 응력 하중을 변화시키는 심장 내 흐름을 변경하여 저형성 좌심 증후군을 모방합니다. 이 어려운 미세 수술 모델의 문제를 극복하기 위한 접근 방식이 제시됩니다.

초록

4개의 방이 있는 성숙한 심실 구성, 배양 용이성, 이미징 접근 및 효율성으로 인해 조류 배아는 심혈관 발달을 연구하는 데 선호되는 척추동물 모델입니다. 정상적인 발달과 선천성 심장 결함의 예후를 이해하기 위한 연구에서 이 모델을 널리 채택하고 있습니다. 현미경 수술 기법을 도입하여 특정 배아 시점에서 정상적인 기계적 부하 패턴을 변경하고 다운스트림 분자 및 유전 캐스케이드를 추적합니다. 가장 일반적인 기계적 중재는 좌측 vitelline 정맥 결찰, conotruncal banding 및 좌심방 결찰(LAL)로, 혈류로 인한 벽내 혈관 압력과 벽 전단 응력을 조절합니다. 특히 난소에서 수행되는 경우 LAL은 매우 미세한 순차 미세 수술 수술로 인해 샘플 수율이 매우 작기 때문에 가장 어려운 중재입니다. 높은 위험성에도 불구하고 난자에서 LAL은 저형성 좌심 증후군(HLHS) 발병 기전을 모방하기 때문에 과학적으로 매우 가치가 있습니다. HLHS는 인간 신생아에서 관찰되는 임상적으로 관련된 복잡한 선천성 심장 질환입니다. in ovo LAL에 대한 자세한 프로토콜은 이 문서에 설명되어 있습니다. 간략하게, 수정된 조류 배아는 햄버거-해밀턴(HH) 단계 20 내지 21단계에 도달할 때까지 전형적으로 37.5°C 및 60% 일정한 습도에서 배양하였다. 달걀 껍질을 깨뜨리고 외막과 내막을 제거했습니다. 배아를 부드럽게 회전시켜 총심방의 좌심구를 노출시켰다. 10-0 나일론 봉합사로 사전 조립된 마이크로 매듭을 부드럽게 배치하고 왼쪽 심방 새싹 주위에 묶었습니다. 마침내, 배아를 원래 위치로 되돌려 놓았고, LAL이 완성되었다. 정상 심실과 LAL 기구 심실은 조직 압축에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 효율적인 LAL 모델 생성 파이프라인은 심혈관 구성 요소의 배아 발달 중 동기화된 기계적 및 유전적 조작에 초점을 맞춘 연구에 기여할 것입니다. 마찬가지로, 이 모델은 조직 배양 연구 및 혈관 생물학을 위한 교란된 세포 소스를 제공할 것입니다.

서문

선천성 심장 결손(CHD)은 비정상적인 배아 발달로 인해 발생하는 구조적 장애입니다¹. 유전적 조건 외에도 발병 기전은 변경된 기계적 부하에 의해 영향을 받습니다 ^2,3. 선천성 심장 질환인 저형성 좌심 증후군(HLHS)^{은 출생 시} 심실/대동맥이 제대로 발달하지 않아 4 사망률이 높다 ^5,6. 최근 임상 관리의 발전에도 불구하고 HLHS의 혈관 성장 및 발달 역학은 여전히 불분명하다⁷. 정상적인 배아 발달에서 좌심실(LV) 심내막과 심근은 초기 배아 심관 형성이 진행됨에 따라 심장 전구 세포에서 비롯됩니다. 심근 섬유주, 두꺼워지는 층 및 심근 세포 증식의 점진적인 존재가 보고된다². HLHS의 경우, 섬유주 리모델링의 변화와 좌심실 평탄화가 관찰되며, 이는 비정상적인 심근세포 이동으로 인한 심근 형성 부전의 원인이 된다 2,8,9,10

심장 발달을 연구하고 혈류역학적 조건11을 이해하기 위해 널리 사용되는 모델 유기체 중에서, 조류 배아는 4개의 방이 있는 성숙한 심장과 배양의 용이성으로 인해 선호된다^11,12,13,14. 반면에, 제브라피시 배아와 형질전환/녹아웃 마우스의 고급 이미징 접근은 뚜렷한 이점을 제공합니다^11,12. 심혈관 구성 요소 발달에서 교내 압력과 벽 전단 응력을 변경하는 조류 배아에 대한 다양한 기계적 개입이 테스트되었습니다. 이러한 모델에는 좌측 vitelline 결찰술, conotruncal banding¹⁵ 및 좌심방 결찰술(left atrial ligation, LAL)11,12,16이 포함된다. 변경된 기계적 부하로 인한 결과 표현형은 초기 예후에 초점을 맞춘 연구에서 외과적 개입 후 약 24-48시간 후에 관찰될 수 있습니다^11,13. LAL 중재술은 방실 개구부 주위에 봉합사 루프를 배치하여 좌심방(LA)의 기능적 용적을 좁히는 데 널리 사용되는 기술입니다. 마찬가지로, 우심방 결찰술(RAL)을 표적으로 하는 미세수술적 중재도 수행되었습니다^17,18. 유사하게, 일부 연구자들은 LA^19,20의 부피를 줄이기 위해 마이크로 클립을 사용하여 좌심방 부속기(LAA)를 표적으로 삼습니다. 일부 연구에서는 수술용 나일론 실이 방실 결절(^19,21)에 적용됩니다. 사용된 중재 중 하나는 HLHS를 모방할 수 있지만 매우 미세한 미세 수술 수술이 필요하기 때문에 샘플 수율이 매우 작아 수행하기 가장 어려운 모델이기도 합니다. 우리 실험실에서 LAL은 햄버거-해밀턴(HH) 단계 20과 21 사이에 난형으로 수행되며, 그 후 공통 아트리움이^{완전히 격}막이 6,14,22,23이 됩니다. 수술용 봉합사가 LA 주변에 배치되어 심장 내 혈류를 변경합니다. HLHS의 LAL 모델에서는 심실 벽 강성 증가, 근섬유 각도 변화 및 LV 공동 크기 감소가 관찰됩니다^14,24.

이 비디오 문서에서는 in ovo LAL에 대한 자세한 프로토콜 및 접근 방식을 제공합니다. 간단히 말해서, 수정된 조류 배아를 미세 수술을 위해 배양하고, 달걀 껍질을 깨서 열고, 외막과 내막을 제거했습니다. 그런 다음 배아를 천천히 회전시켜 LA에 접근할 수 있도록 했습니다. 10-0 나일론 수술용 봉합사를 심방 봉오리에 묶고, 배아를 원래의 방향으로 되돌려 LAL 절차²⁵를 완료하였다. LAL과 정상 심실은 광간섭 단층 촬영과 기본 조직학 을 통해 조직 압축과 심실 부피를 비교합니다.

여기에 설명된 대로 성공적으로 실행된 LAL 모델 파이프라인은 심혈관 구성 요소의 배아 발달에 초점을 맞춘 기초 연구에 기여할 것입니다. 이 모델은 유전자 조작 및 고급 이미징 양식과 함께 사용할 수도 있습니다. 마찬가지로, 급성 LAL 모델은 조직 배양 실험을 위한 병든 혈관 세포의 안정적인 공급원입니다.

프로토콜

유정 백색 레그혼 알은 신뢰할 수 있는 공급업체로부터 얻어 대학에서 승인한 지침에 따라 배양합니다. 병아리 배아, 18단계(3일차)에서 24단계(4일차)(이 논문에 제시된 단계)는 유럽 연합(EU) 지침 2010/63/EU 및 미국의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 지침에 따라 살아있는 척추동물로 간주되지 않습니다. 병아리 배아는 미국 법률에 따라 부화 19일 이후 "살아있는 동물"로 간주되지만 EU에서는 그렇지 않습니다. 각 알에는 부화 시작 날짜가 표시되어 있으며 늦어도 부화 10^일 째 되는 날까지 부화할 예정입니다. 알이 부화한 후 병아리는 인큐베이터에서 꺼냅니다. 이 프로토콜은 두 개의 벤치탑 운영 스테이션(스테이션 1 및 스테이션 2)에서 수행되며 특수 모델 생성 단계에 중점을 둡니다.

1. 미세수술 전 준비

1. 특정 병원균 무함유(SPF) 등급의 백신 개발 센터 또는 건조 폴리스티렌 용기에 담긴 깨지기 쉬운 배송 택배를 통해 신뢰할 수 있는 상업 공급업체 농장을 통해 수정란을 구입하십시오. 배양하기 전에 오염을 제거하기 위해 70% 에탄올에 적신 보푸라기가 없는 물티슈로 달걀 껍질을 부드럽게 청소하십시오.
2. 배아 포함/제외 기준
   1. 운송 중에 금이 가거나 손상된 계란을 부화시키지 마십시오.
   2. LAL 절차 중 또는 재배양 후 출혈이 관찰되면 배아를 사용하지 마십시오.
   3. 혈류역학적 혈류가 정상 방향과 다를 수 있으므로 왼쪽이 위로 향하는 위치에서 발달하는 배아는 사용하지 마십시오.
   4. 수술 전후 절차에서 선천적 결함으로 발달하는 Dıscard 배아.
   5. 원래 위치에서 발달하는 목표 단계에 도달하여 HLHS를 LAL 모델로 모방하는 배아를 포함합니다.
3. 뭉툭한 끝 부분의 수정된 흰다리뿔 닭 알(Gallus gallus domesticus L.)을 일반적으로 HH20-21¹⁵ (37.5°C, 60% 습도, 3.5일)에서 원하는 단계로 배양합니다(그림 1).
   알림: 수확량을 늘리려면 계란을 일정한 온도와 습도로 유지하는 것이 중요합니다. 인큐베이터 모델에 따라 증류수를 채운 팬을 추가하면 안정적인 습도가 유지됩니다. 대부분의 인큐베이터에 맞는 추가/보조 온도 및 습도 제어 시스템의 청사진은 저자가 개발하고 권장합니다. 이러한 자체 내장 센서/제어 장치의 전자장치, 하드웨어 및 코드 세부사항은 데이터 저장소(²⁶)에 제공된다. 부화하는 동안 난자를 지속적으로 부드럽게 흔들어주면 배아의 최적 위치가 허용되어 "작동 가능한" 배아의 비율이 높아질 수 있습니다. 쉐이킹은 또한 이 용량의 인큐베이터와 함께 작동하여 생산성을 더욱 높일 수 있습니다.
4. 절차를 시작하기 전에 느슨한 오버핸드 매듭을 1.5cm 길이의 10-0 봉합사에 묶어 필요한 매듭 수를 준비합니다. 매듭이 꽉 조이지 않고 수술 중에 심방에 쉽게 맞을 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하십시오(그림 2).
   알림: 매듭을 미리 묶고 사용하기 전에 멸균 병아리 링거 용액에 보관하십시오. 매듭 묶기 작업은 핀셋을 동시에 작동하기 위해 두 손을 사용해야 합니다. 이것은 프로토콜의 중요한 단계이기 때문에 이 단계를 연습하기 위해 퍼티로 아트리움 모델을 만들 수 있습니다(그림 3). 이렇게 하면 스테이션 2에서 3.2.3단계를 수행하는 데 필요한 3차원 미세 수술 기술이 향상됩니다(그림 4).

2. 스테이션 1에서의 작동(그림 4A)

1. 달걀의 뭉툭한 끝에서 창을 열고 외막과 내막을 모두 제거합니다(그림 5A-D).
2. 핀셋의 반대쪽 끝으로 부드럽게 깨서 달걀 껍질을 열고 다른 손가락으로 달걀을 단단히 지지하여 원치 않는 균열 전파를 줄입니다.
3. LAL은 긴 절차이기 때문에 심박수가 온도에 따라 달라지므로 배아의 온도와 습도를 보존하십시오. 따라서 초기 셸 창이 작업을 실행할 수 있을 만큼 가능한 한 작게 생성되도록 합니다.
   알림: 작동 중에는 습도 또는 온도 제어 시스템이 사용되지 않지만 이러한 시스템이 사용 가능한 경우 수율에 도움이 됩니다. 가능한 경우 실험실의 공조 시스템을 종료하고 가능한 가장 높은 실내 온도(RT)에서 절차를 수행합니다. 수술 중 온도로 조절할 수 있는 배아 심박수 최적화도 권장됩니다. 일부 실험실에서는 LAL 작동 중 온도 제어를 통해 심박수를 120bpm보다 약간 낮은 속도로 유지합니다. 따라서 수술 부위 주변에 습도 조절을 사용하면 수율이 더욱 높아집니다. 달걀 껍질 창은 가능한 한 작게 만들어지며, 수술이 가능할 정도로 충분히 큽니다. 이것은 두꺼운 외막에도 적용할 수 있는데, 일반적으로 배아의 둘레까지만 달걀 껍질보다 작습니다. 이는 배아의 온도와 습도를 유지하기 위한 것입니다. 달걀의 뭉툭한 끝에서 창문을 여는 동안 작은 껍질 조각은 이러한 조각이 vitelline 혈관 무결성을 손상시키거나 원치 않는 인공물로 이어지지 않도록 청소됩니다. 또한 다른 실험실에서는 창문을 만들기 위해 곡선형 마이크로 톱니 모양의 가위를 사용합니다. 또한 두 가지 너비의 스카치 테이프를 사용하여 달걀 껍질을 안정화하여 균열을 제어할 수 있습니다.
4. 마이크로 가위를 사용하여 필요한 vitelline 멤브레인만 제거합니다(보충 비디오 1).
5. 정상적인 배아 발달은 오른쪽이 위로 향하게 합니다. 배아가 유리체막에서 분리되면 끝이 닫힌 핀셋을 배아의 등쪽 부분 아래에 놓고 배아를 부드럽게 뒤집어 왼쪽(즉, 왼쪽이 위로 향하게 구성)을 노출시킵니다(그림 6A,B; 보충 동영상 2).
6. 왼쪽 심방 새싹이 노출되어 있지만 일반적으로 심낭의 이중층으로 구성된 복잡한 막 시스템으로 덮여 있는지 확인합니다.
7. 심방 새싹 주위의 미세한 막을 포함한 막을 즉시 제거합니다. 이것은 또 다른 중요한 단계입니다. 굵은 막에서 막 제거를 수행하고 왼쪽 심방 새싹 주변의 미세한 막으로 진행합니다. 미세한 막을 제거하기 위해 가장 좋은 핀셋을 예약하십시오(보충 비디오 3).
8. 막 제거 과정 동안, 배아를 왼쪽이 위로 향하게 하여 3.2단계의 매듭 배치 작업이 더 이상의 위치 변경 없이 수행될 수 있도록 합니다. 이를 위해 2.6단계의 멤브레인을 사용하여 배아를 들어 올리고 왼쪽이 위를 향하도록 하여 달걀 껍질에 매달립니다.
   알림: 일부 배아는 달걀 껍질 주변부에 가깝게 위치할 수 있으며 작동하기 어려울 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 배아는 오른쪽이 위로 향하고 정상적인 행동을 보일 가능성이 높으며 연구에 포함될 수 있습니다. 이러한 경우 필요한 경우 #4 미세 핀셋으로 심낭막을 부드럽게 청소하고 반대 방향(껍질 입구 쪽)으로 달걀 껍질을 제거하여 가려진 심방에 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 이 배아는 또한 배아외 막의 일부를 사용하여 들어 올릴 수 있으며 자연적인 끈적임을 사용하여 막의 한쪽 끝(핀셋 끝)을 달걀 껍질에 부착하여 원하는 위치에 고정할 수 있습니다. 또한 배아의 머리와 척수 영역 사이의 공간을 핀셋을 사용하여 확장하여 가려진 심방을 드러낼 수 있습니다.

3. 스테이션 2에서의 운영(그림 4B)

1. 실체현미경 아래에서 1.4단계에서 미리 준비된 매듭을 접근 가능한 위치의 배아 가까이에 배치합니다(그림 6B). 이제 심방 새싹을 묶을 준비가 되었습니다(보충 비디오 4).
2. 미리 준비된 열린 매듭을 꺼내 왼쪽 심방 새싹 위로 향하게 합니다. LAL이 작동하려면 계란을 독특하게 기울어진 3차원 방향으로 놓으십시오.
   1. 배아를 손상시키지 않고 조임 과정을 실행할 수 있도록 매듭의 방향을 올바르게 지정하십시오.
   2. 심장 박동의 영향을 줄이기 위해 2.7단계에서 미세한 막을 최적으로 청소하십시오.
   3. 봉합사를 조입니다(그림 6C). 이 단계에서는 퍼티로 연습하는 것이 매우 유용합니다. 가짜 배아의 경우 매듭을 고정할 수 있을 만큼만 매듭을 조입니다.
3. 그런 다음 마이크로 가위를 사용하여 봉합사의 여분의 끝을 새싹에 최대한 가깝게 자릅니다(보충 동영상 5).
4. 묶인 봉합사의 새로 절단된 끝이 회전 중 또는 심장 박동으로 인해 주변 혈관에 구멍을 뚫을 수 있는 위치에 있지 않도록 각별히 주의하십시오.
5. 핀셋을 사용하여 3.3단계에서 잘라낸 여분의 봉합사 조각을 제거합니다.
6. 마지막으로, 닫힌 핀셋을 사용하여 2.5단계(보충 비디오 6)에서와 같이 배아를 원래 위치로 되돌립니다.
7. LAL 과정을 완료한 후 계란을 파라필름의 이중층으로 덮고 다시 부화합니다. 알을 꽉 채우고 멸균 상태로 닫는 것은 생존, 특히 부화 24시간 이후에 가장 중요합니다. 시각적 접근도 원하는 경우 유리 슬라이드와 함께 파라핀 왁스를 사용하십시오.
   참고: 초기 배아 기간이 연구됨에 따라 난자는 일반적으로 약 HH24 또는 HH48에 도달할 때까지 25-27시간 동안 배양됩니다. 그러나 한계는 없으며 다른 연구자들이 시도한 것처럼 후기 단계를 연구할 수 있습니다. 빠른 작동 속도를 위해서는 최소 2명으로 구성된 팀이 권장됩니다. 한 사람은 난자 개심, 초기 막 청소, 회전 및 좌심방 새싹 주변의 막 청소에 대한 교육을 받고 책임을 져야 합니다. 다른 사람은 초기 매듭 준비, 매듭 배치 및 조임만 담당합니다. 최종 배아 회전은 사람 1이 수행할 수 있습니다. 단일 배아에 대한 외과 수술은 약 4-5분 정도 소요됩니다.
8. 수술 전/후에 벤치탑 표면과 기구를 에탄올로 청소하십시오. 신선한 병아리 링거 용액(NaCl, KCl, CaCl₂ 및 NaHCO₃)^16,27을 배아 조직에 닿는 금속 기구에 적용해야 합니다.

결과

LAL 중재로 인한 구조적 및 형태학적 변화를 관찰하기 위해 고급 시간 분해 이미징 기술을 사용할 수^{있다 10}. 또한, LAL 샘플은 분자 및 생물학적 방법(^19,28)에도 적용할 수 있습니다. 표 1에는 LAL 모델 결과를 사용한 샘플 연구가 제공되어 있습니다. 이러한 맥락에서 LAL 중재는 HH20-21에 도달한 병아리 배아에서 수행되었습니다...

토론

HLHS에서는 구조적 결함으로 인해 혈류가 변경되어 왼쪽의 비정상적인 형태가 발생합니다 ^4,6. 본 모델은 HLHS의 진행을 더 잘 이해할 수 있는 실용적인 실험 시스템을 제공하며, 심지어 발병기전을 모방할 수도 있다⁸. 그러나 임상적으로 완전히 동등한 HLHS 동물 모델을 확립하는 것은 어려운 작업입니다. 여기에 제시된 조류 LAL 모델 외에...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo