هنا ، نقدم سير عمل سريع وفعال من حيث التكلفة لتوصيف جينومات فيروس داء (RABV) باستخدام تقنية المسام النانوية. يهدف سير العمل إلى دعم المراقبة الواعية بالجينوم على المستوى المحلي ، وتوفير معلومات حول سلالات RABV المتداولة ووضعها داخل السلالات الإقليمية لتوجيه تدابير مكافحة داء.
يمكن استخدام البيانات الجينومية لتتبع انتقال الأمراض المعدية وانتشارها الجغرافي. ومع ذلك، لا تزال القدرة على تحديد التسلسل الجيني اللازمة للترصد الجينومي محدودة في العديد من البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل، حيث يشكل داء و/أو داء الذي تنقله البرية مثل الخفافيش مصاصة الدماء شواغل صحية واقتصادية كبيرة. نقدم هنا سير عمل سريع وبأسعار معقولة من العينة إلى التسلسل إلى التفسير باستخدام تقنية المسام النانوية. يتم وصف بروتوكولات جمع العينات وتشخيص داء بإيجاز ، متبوعة بتفاصيل سير عمل تسلسل الجينوم الكامل الأمثل ، بما في ذلك تصميم التمهيدي والتحسين لتفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد (PCR) ، وإعداد مكتبة تسلسل معدلة ومنخفضة التكلفة ، والتسلسل مع الاتصال الأساسي المباشر وغير المتصل بالإنترنت ، وتعيين النسب الجيني ، وتحليل النشوء والتطور. يتم عرض تنفيذ سير العمل ، ويتم تسليط الضوء على الخطوات الحاسمة للنشر المحلي ، مثل التحقق من صحة خط الأنابيب ، وتحسين التمهيدي ، وإدراج الضوابط السلبية ، واستخدام البيانات المتاحة للجمهور والأدوات الجينومية (GLUE ، MADDOG) للتصنيف والتنسيب داخل السلالات الإقليمية والعالمية. الوقت المستغرق لسير العمل هو 2-3 أيام ، وتتراوح التكلفة من 25 دولارا لكل عينة لتشغيل عينة 96 إلى 80 دولارا لكل عينة لتشغيل 12 عينة. نستنتج أن إنشاء المراقبة الجينومية لفيروس داء في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل أمر ممكن ويمكن أن يدعم التقدم نحو الهدف العالمي المتمثل في القضاء على وفيات داء البشري بوساطة بحلول عام 2030 ، فضلا عن تعزيز رصد انتشار داء في الحياة البرية. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف المنصة مع مسببات الأمراض الأخرى ، مما يساعد على بناء قدرة جينومية متعددة الاستخدامات تساهم في التأهب للأوبئة والجوائح.
فيروس داء (RABV) هو فيروس ليسا في عائلة Rhabdoviridae يسبب مرضا عصبيا قاتلا في الثدييات1. على الرغم من أن داء يمكن الوقاية منه بنسبة 100٪ عن طريق التطعيم ، إلا أنه لا يزال مصدر قلق كبير للصحة العامة والاقتصادية في البلدان الموبوءة. من بين 60000 حالة وفاة بشرية بسبب داء يقدر حدوثها كل عام ، يوجد أكثر من 95٪ في إفريقيا وآسيا حيث هي المستودع الأساسي2. في المقابل ، أدى تطعيم إلى القضاء على داء بوساطة في جميع أنحاء أوروبا الغربية وأمريكا الشمالية وجزء كبير من أمريكا اللاتينية. في هذه المناطق ، تقتصر خزانات داء الآن على الحياة البرية ، مثل الخفافيش والراكون والظربان البرية3. في جميع أنحاء أمريكا اللاتينية ، يعد الخفاش مصاص الدماء الشائع مصدرا إشكاليا لداء بسبب الانتقال المنتظم غير المباشر من الخفافيش إلى كل من البشر والماشية أثناء تغذية الدم ليلا4. ويقدر الأثر الاقتصادي العالمي السنوي لداء بنحو 8.6 مليار دولار، وتمثل خسائر الثروة الحيوانية 6٪5.
يمكن أن توفر بيانات التسلسل من مسببات الأمراض الفيروسية جنبا إلى جنب مع البيانات الوصفية حول توقيت ومصدر العدوى رؤى وبائية قوية6. بالنسبة ل RABV ، تم استخدام التسلسل للتحقيق في أصل الفاشيات 7,8 ، وتحديد الارتباطات المضيفة مع الحياة البرية أو الأليفة 8،9،10،11،12 ، وتتبع مصادر الحالات البشرية13،14. وقد أشارت استقصاءات الفاشية باستخدام التحليل الوراثي إلى أن داء ظهر في مقاطعة بالي التي كانت خالية من داء سابقا في إندونيسيا، من خلال إدخال واحد من المناطق الموبوءة القريبة في كاليمانتان أو سولاويزي15. وفي الوقت نفسه ، في الفلبين ، ثبت أن تفشي المرض في جزيرة تابلاس بمقاطعة رومبلون قد تم إدخاله من جزيرة لوزون16 الرئيسية. كما تم استخدام البيانات الجينومية الفيروسية لفهم ديناميكيات انتقال مسببات الأمراض المطلوبة لاستهداف تدابير المكافحة جغرافيا بشكل أفضل. على سبيل المثال ، يوضح التوصيف الجينومي ل RABV التجميع الجغرافي للمجموعات 17،18،19 ، والدوران المشترك للسلالات 20،21،22 ، والحركة الفيروسية بوساطة الإنسان 17،23،24 ، وديناميكيات metapopulation 25،26.
تعد مراقبة الأمراض إحدى الوظائف المهمة للمراقبة الجينومية التي تم تعزيزها مع الزيادة العالمية في القدرة على التسلسل استجابة لوباء SARS-CoV-2. دعمت المراقبة الجينومية التتبع في الوقت الفعلي لمتغيرات SARS-COV-2 المثيرة للقلق27,28 والتدابير المضادة المرتبطةبها 6. أدى التقدم في تكنولوجيا التسلسل التي يمكن الوصول إليها ، مثل تقنية المسام النانوية ، إلى بروتوكولات محسنة وبأسعار معقولة للتسلسل السريع لكل من مسببات الأمراضالبشرية 29،30،31،32 والحيوانية33،34،35. ومع ذلك ، في العديد من البلدان الموبوءة بداء ، لا تزال هناك حواجز أمام تفعيل المراقبة الجينومية لمسببات الأمراض ، كما يتضح من التفاوتات العالمية في قدرة تسلسل SARS-CoV-236. إن القيود المفروضة على البنية التحتية للمختبرات وسلاسل التوريد والمعرفة التقنية تجعل إنشاء المراقبة الجينومية وروتينها أمرا صعبا. في هذه الورقة ، نوضح كيف يمكن نشر سير عمل تسلسل الجينوم الكامل الأمثل والسريع وبأسعار معقولة لمراقبة RABV في إعدادات محدودة الموارد.
وتمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة تنسيق البحوث الطبية التابعة للمعهد الوطني للبحوث الطبية (NIMR/HQ/R.8a/vol. IX/2788)، ووزارة الإدارة الإقليمية والحكم المحلي (AB.81/288/01)، ومجلس المراجعة المؤسسية لمعهد إيفاكارا الصحي (IHI/IRB/No:22-2014) في تنزانيا؛ معهد جامعة نيروبي للأمراض المدارية والمعدية (P947/11/2019) ومعهد كينيا للبحوث الطبية (KEMRI-SERU ؛ البروتوكول رقم 3268) في كينيا ؛ ومعهد بحوث طب المناطق الحارة (RITM) ، وزارة الصحة (2019-023) في الفلبين. وأجري تسلسل العينات القادمة من نيجيريا على مواد التشخيص المحفوظة التي جمعت كجزء من الترصد الوطني.
ملاحظة: القسم 1-4 هي متطلبات أساسية. يصف القسم 5-16 سير عمل العينة إلى التسلسل إلى التفسير لتسلسل المسام النانوية RABV (الشكل 1). بالنسبة للخطوات اللاحقة في البروتوكول التي تحتاج إلى الطرد المركزي النبضي ، أجهزة الطرد المركزي عند 10-15000 × جم لمدة 5-15 ثانية.
1. إعداد البيئة الحسابية للتسلسل وتحليل البيانات
2. تصميم أو تحديث مخطط التمهيدي المتعدد
ملاحظة: مخططات RABV الحالية متوفرة في مستودع artic-rabv40. عند استهداف منطقة جغرافية جديدة ، يجب تصميم مخطط جديد ، أو تعديل مخطط قائم لدمج تنوع إضافي.
3. إعداد خطوط أنابيب RAMPART والمعلوماتية الحيوية ARTIC
4. السلامة البيولوجية وإعداد المختبرات
5. جمع العينات الميدانية والتشخيص
ملاحظة: يجب جمع العينات من قبل موظفين مدربين ومحصنين يرتدون معدات الحماية الشخصية ويتبعون الإجراءات القياسية المشار إليها47،48،49.
6. تحضير العينة واستخراج الحمض النووي الريبي (3 ساعات)
ملاحظة: استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي القائمة على عمود الدوران المناسبة لنوع العينة.
7. تحضير cDNA (20 دقيقة)
8. إعداد مخزون بركة التمهيدي (1 ساعة)
ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية فقط في حالة إنشاء مخزون جديد من البادئات الفردية ، وبعد ذلك يمكن استخدام حلول المخزون المعدة مسبقا.
9. PCR متعدد الإرسال (5 ساعات)
10. تنظيف PCR والقياس الكمي (3.5 ساعة)
11. التطبيع (30 دقيقة)
12. نهاية الإعداد والباركود (1.5 ساعة)
ملاحظة: تفترض الخطوات التالية استخدام كواشف محددة من مجموعات الترميز الشريطي وتسلسل الربط الخاصة بالمسام النانوية (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). البروتوكول قابل للنقل عبر إصدارات كيميائية مختلفة ، ولكن يجب على المستخدمين الحرص على استخدام مجموعات متوافقة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
13. التسلسل (48 ساعة كحد أقصى)
14. الاتصال الأساسي المباشر وغير المتصل
ملاحظة: تفترض هذه التعليمات أن بنية الدليل الموجودة مسبقا والمقدمة في مستودع artic-rabv وأنه تم اتباع القسمين 1 و 3 من المتطلبات الأساسية من البروتوكول.
15. غسل خلايا التدفق
16. التحليل والتفسير
تم استخدام سير عمل العينة إلى التسلسل إلى التفسير ل RABV الموصوف في هذا البروتوكول بنجاح في ظروف مختبرية مختلفة في البلدان الموبوءة ، مثل تنزانيا وكينيا ونيجيريا والفلبين (الشكل 4). تم استخدام البروتوكول على أنواع وظروف مختلفة من العينات (الجدول 6): أنسجة المخ الطازجة والمجمدة ، ومستخلصات cDNA و RNA من أنسجة المخ المنقولة تحت سلسلة التبريد لفترات طويلة ، وبطاقات FTA مع مسحات أنسجة المخ.
يظهر الاتصال الأساسي المباشر باستخدام RAMPART (الشكل 5) إنشاء القراءات في الوقت الفعلي تقريبا والنسبة المئوية للتغطية لكل عينة. هذا مفيد بشكل خاص في تحديد وقت إيقاف التشغيل وحفظ خلية التدفق لإعادة استخدامها. لوحظ اختلاف في وقت التشغيل ، حيث انتهى بعضها في 2 ساعة ، بينما قد يستغرق البعض الآخر أكثر من 12 ساعة للوصول إلى عمق تغطية كاف (x100). يمكننا أيضا عرض المناطق ذات التضخيم الضعيف ؛ على سبيل المثال ، يوضح الشكل 6 لقطة من تشغيل تسلسل واحد حيث تظهر ملفات تعريف التغطية بعض الأمبليكونات ذات التضخيم المنخفض جدا ، مما يشير إلى وجود مواد أولية يحتمل أن تكون إشكالية. من خلال التحقيق في هذه المناطق ذات التضخيم الضعيف بشكل أكثر شمولا ، تمكنا من تحديد عدم تطابق التمهيدي ، مما سيمكننا من إعادة تصميم وتحسين البرايمات الفردية. أظهرت بعض مخططات التمهيدي عدم تطابق أكثر من غيرها. ويلاحظ ذلك في المخطط التمهيدي لشرق أفريقيا، مقارنة بالفلبين، تمشيا مع التنوع المستهدف، حيث يهدف مخطط شرق أفريقيا إلى التقاط تنوع أوسع بكثير.
تم استخدام RABV-GLUE42 ، وهو مورد للأغراض العامة لإدارة بيانات جينوم RABV ، و MADDOG60 ، وهو نظام تصنيف وتسميات النسب ، لتجميع وتفسير تسلسلات RABV الناتجة. ويبين الجدول 7 الكتل الرئيسية والثانوية المتداولة في كل بلد باستخدام RABV-GLUE. يظهر أيضا تصنيف أعلى دقة للأنساب المحلية بعد تعيين MADDOG.
الشكل 1: سير عمل العينة إلى التسلسل إلى التفسير ل RABV. يتم عرض الخطوات الملخصة ل (أ) إعداد العينات ، (ب) PCR وإعداد المكتبة ، و (ج) التسلسل والمعلوماتية الحيوية حتى التحليل والتفسير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط التمهيدي التخطيطي. مواضع التلدين على طول "الجينوم المرجعي للفهرس" (أرجواني غامق) لأزواج من البادئات الأمامية والخلفية (نصف الأسهم) ، والتي يتم تعيينها في مجموعتين منفصلتين: A (أحمر) و B (أخضر). تولد أزواج التمهيدي 400 bp amplicons متداخلة (زرقاء) والتي يتم ترقيمها بالتتابع على طول الجينوم المرجعي للفهرس بالتنسيق "scheme_name_X_DIRECTION" ، حيث "X" هو رقم يشير إلى amplicon الناتج عن التمهيدي و "DIRECTION" إما "LEFT" أو "RIGHT" ، يصف الأمام أو الخلف على التوالي. تحدد القيم الفردية أو الزوجية ل "X" التجمع (A أو B ، على التوالي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: خلية تدفق النانوبور48. توضح الملصقات الزرقاء الأجزاء المختلفة لخلية التدفق ، بما في ذلك غطاء منفذ التحضير الذي يغطي منفذ التحضير حيث يتم إضافة محلول التحضير ، وغطاء منفذ عينة SpotON الذي يغطي منفذ العينة حيث تتم إضافة العينة بطريقة قطرة ، ومنافذ النفايات 1 و 2 ، ومعرف خلية التدفق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: خريطة توضح الموقع الذي تم فيه إجراء تسلسل RABV باستخدام سير العمل الأمثل في عامي 2021 و 2022. يتوافق حجم الفقاعة ولونها مع عدد التسلسلات لكل موقع ، حيث يكون الأصغر والأغمق أقل ، بينما الأكبر والأفتح أكثر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: لقطة شاشة لتصور RAMPART في متصفح الويب. يتم استبدال أسماء الباركود بأسماء العينات وفقا لإعداد المعلوماتية الحيوية. تعرض اللوحات الثلاث الأولى مخططات موجزة للتشغيل بأكمله: عمق تغطية القراءات المعينة لكل رمز شريطي لكل موضع نيوكليوتيد على الجينوم المرجعي للفهرس (أعلى اليسار ، ملون بالرمز الشريطي) ، والقراءات المعينة المجمعة من جميع الرموز الشريطية بمرور الوقت (أعلى الوسط) ، والقراءات المعينة لكل رمز شريطي (أعلى اليمين ، ملونة بالرمز الشريطي). تظهر اللوحات السفلية صفوفا من قطع الأراضي لكل رمز شريطي. من اليسار إلى اليمين: عمق تغطية القراءات المعينة لكل موضع نيوكليوتيد على الجينوم المرجعي للفهرس (يسار) ، وتوزيع طول القراءات المعينة (وسط) ، ونسبة مواضع النوكليوتيدات على الجينوم المرجعي للفهرس التي حصلت على تغطية 10x و 100x و 1000x للقراءات المعينة بمرور الوقت (يمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: مثال على التغطية عبر الجينوم لعينة فيروس داء من الفلبين متسلسلة باستخدام البروتوكول. تظهر تغطية القراءة في كل موضع نيوكليوتيدات في الجينوم ، جنبا إلى جنب مع موضع الأمبليكونات المتداخلة (1-41) المستخدمة لإنشاء المكتبة. تتوافق المسامير في عمق التغطية مع مناطق تداخل amplicon. تتوافق Amplicons ذات عمق التغطية المنخفض مع مناطق تداخل amplicon. يتم تمييز Amplicons ذات عمق التغطية المنخفض باللون الأحمر للإشارة إلى المناطق الإشكالية التي قد تتطلب التحسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: المزيج الرئيسي وظروف التدوير الحراري لإعداد cDNA. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: ظروف المزيج الرئيسي والدورة الحرارية لتفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: المزيج الرئيسي وظروف التدوير الحراري لتفاعل الإعدادية النهائية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 4: المزيج الرئيسي وظروف التدوير الحراري للترميز الشريطي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 5: المزيج الرئيسي لربط المحول والتخفيف النهائي للمكتبة للتسلسل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 6: عدد تسلسلات الجينوم الكامل لفيروس داء المتولدة ونوع العينات المستخدمة في مختلف البلدان باستخدام سير عمل العينة إلى التسلسل إلى التفسير. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 7: تعيينات clade الرئيسية والثانوية من RABV-GLUE وتعيينات النسب من MADDOG للتسلسلات التي تم إنشاؤها باستخدام سير العمل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الملف التكميلي 1: تصميم مخطط التمهيدي وتحسينه ، وتحليل عمق قراءة amplicon. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: الإعداد الحسابي الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 3: ورقة عمل بروتوكول RABV WGS الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
تم تطوير سير عمل تسلسل الجينوم الكامل RABV ، القائم على المسام النانوية ، بواسطة Brunker et al.61 ، باستخدام موارد من شبكة ARTIC46. هنا ، نقدم سير عمل محدثا ، مع خطوات كاملة من عينة إلى تسلسل إلى تفسير. يفصل سير العمل إعداد عينات أنسجة المخ لتسلسل الجينوم الكامل ، ويقدم خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لمعالجة القراءات وإنشاء تسلسلات إجماع ، ويسلط الضوء على أداتين خاصتين بداء لأتمتة تعيين النسب وتحديد سياق التطور. يوفر سير العمل المحدث أيضا تعليمات شاملة لإعداد مساحات العمل الحسابية والمختبرية المناسبة ، مع اعتبارات للتنفيذ في سياقات مختلفة (بما في ذلك الإعدادات منخفضة الموارد). لقد أثبتنا التنفيذ الناجح لسير العمل في كل من الإعدادات الأكاديمية والبحثية في أربعة بلدان منخفضة ومتوسطة الدخل مستوطنة في RABV مع عدم وجود قدرة مراقبة جينومية أو محدودة. أثبت سير العمل مرونته للتطبيق عبر إعدادات متنوعة ، ومفهومه من قبل المستخدمين ذوي الخبرات المختلفة.
سير العمل هذا لتسلسل RABV هو البروتوكول الأكثر شمولا المتاح للجمهور (يغطي خطوات العينة إلى التسلسل إلى التفسير) وتم تكييفه خصيصا لتقليل تكاليف بدء التشغيل والتشغيل. يتم تقليل الوقت والتكلفة اللازمين لإعداد المكتبة وتسلسلها باستخدام تقنية المسام النانوية بشكل كبير مقارنة بالمنصات الأخرى ، مثل Illumina61 ، وتعمل التطورات التكنولوجية المستمرة على تحسين جودة التسلسل ودقته لتكون قابلة للمقارنة مع Illumina62.
تم تصميم هذا البروتوكول ليكون مرنا في سياقات متنوعة منخفضة الموارد. من خلال الرجوع إلى إرشادات استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتعديلات المقدمة جنبا إلى جنب مع البروتوكول الأساسي ، يتم دعم المستخدمين لتكييف سير العمل مع احتياجاتهم. تشكل إضافة أدوات المعلوماتية الحيوية سهلة الاستخدام إلى سير العمل تطورا كبيرا للبروتوكول الأصلي ، مما يوفر طرقا سريعة وموحدة يمكن تطبيقها من قبل المستخدمين الذين لديهم الحد الأدنى من الخبرة السابقة في المعلوماتية الحيوية لتفسير بيانات التسلسل في السياقات المحلية. غالبا ما تكون القدرة على القيام بذلك في الموقع محدودة بسبب الحاجة إلى مهارات محددة في البرمجة والتطور ، والتي تتطلب استثمارا مكثفا وطويل الأجل في التدريب على المهارات. في حين أن مجموعة المهارات هذه مهمة لتفسير بيانات التسلسل بدقة ، فإن أدوات الترجمة الفورية الأساسية والتي يمكن الوصول إليها مرغوبة بنفس القدر من أجل تمكين "أبطال التسلسل" المحليين ، الذين قد تكون خبرتهم الأساسية قائمة على المختبر الرطب ، مما يمكنهم من تفسير بياناتهم وتولي ملكيتها.
نظرا لأن البروتوكول قد تم تنفيذه لعدد من السنوات في العديد من البلدان ، يمكننا الآن تقديم إرشادات حول كيفية تحسين مخططات التمهيدي المتعدد لتحسين التغطية والتعامل مع التنوع المتراكم. كما بذلت جهود لمساعدة المستعملين على تحسين فعالية التكلفة أو السماح بسهولة الشراء في منطقة معينة، وهو ما يشكل عادة تحديا لاستدامة النهجالجزيئية(63). على سبيل المثال ، في إفريقيا (تنزانيا وكينيا ونيجيريا) ، اخترنا المزيج الرئيسي للربط الحاد / TA في خطوة ربط المحول ، والذي كان متاحا بسهولة أكبر من الموردين المحليين وبديلا أرخص لكواشف الربط الأخرى.
من التجربة ، هناك عدة طرق لتقليل التكلفة لكل عينة ولكل تشغيل. يمكن أن يؤدي تقليل عدد العينات لكل عملية (على سبيل المثال ، من 24 إلى 12 عينة) إلى إطالة عمر خلايا التدفق على مدار عمليات تشغيل متعددة ، في حين أن زيادة عدد العينات لكل تشغيل يزيد من الوقت والكواشف. في أيدينا ، تمكنا من غسل وإعادة استخدام خلايا التدفق لواحد من كل ثلاث عمليات تسلسل ، مما مكن من تسلسل 55 عينة إضافية. يبدو أن غسل خلية التدفق مباشرة بعد الاستخدام ، أو إذا لم يكن ذلك ممكنا ، إزالة سائل النفايات من قناة النفايات بعد كل تشغيل ، يحافظ على عدد المسام المتاحة للتشغيل الثاني. مع الأخذ في الاعتبار العدد الأولي للمسام المتاحة في خلية التدفق ، يمكن أيضا تحسين تشغيل واحد لتخطيط عدد العينات التي سيتم تشغيلها في خلية تدفق معينة.
على الرغم من أن سير العمل يهدف إلى أن يكون شاملا قدر الإمكان ، مع إضافة إرشادات مفصلة وموارد إرشادية ، إلا أن الإجراء لا يزال معقدا ويمكن أن يكون شاقا بالنسبة للمستخدم الجديد. يتم تشجيع المستخدم على طلب التدريب والدعم الشخصي ، من الناحية المثالية محليا ، أو بدلا من ذلك من خلال المتعاونين الخارجيين. ففي الفلبين على سبيل المثال، أدى مشروع لبناء القدرات داخل المختبرات الإقليمية للترصد الجينومي لفيروس كورونا-سارس-2 باستخدام ONT إلى تطوير الكفاءات الأساسية بين أخصائيي تشخيص الرعاية الصحية التي يمكن نقلها بسهولة إلى تسلسل فيروس التهاب الكبد الوبائي. قد يكون من الصعب إتقان الخطوات المهمة ، مثل تنظيف حبة SPRI ، دون تدريب عملي ، ويمكن أن يؤدي التنظيف غير الفعال إلى إتلاف خلية التدفق وتعريض الجري للخطر. يعد تلوث العينة دائما مصدر قلق كبير عند معالجة الأمبليكونات في المختبر وقد يكون من الصعب التخلص منها. على وجه الخصوص ، من الصعب للغاية اكتشاف التلوث المتبادل بين العينات أثناء المعلوماتية الحيوية بعد التشغيل. تعتبر التقنيات والممارسات المختبرية الجيدة ، مثل الحفاظ على أسطح العمل النظيفة ، وفصل مناطق ما قبل وبعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ودمج الضوابط السلبية ، ضرورية لضمان مراقبة الجودة. تعد الوتيرة السريعة لتطورات تسلسل المسام النانوية ميزة وعيوبا للمراقبة الجينومية الروتينية ل RABV. تعمل التحسينات المستمرة على دقة المسام النانوية وإمكانية الوصول إليها وذخيرة البروتوكول على توسيع وتحسين نطاق تطبيقها. ومع ذلك ، فإن نفس التطورات تجعل من الصعب الحفاظ على إجراءات التشغيل القياسية وخطوط أنابيب المعلوماتية الحيوية. في هذا البروتوكول ، نقدم وثيقة تساعد في الانتقال من مجموعات إعداد مكتبة المسام النانوية القديمة إلى الحالية (جدول المواد).
ومن العوائق الشائعة أمام التسلسل في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل إمكانية الوصول، بما في ذلك ليس فقط التكلفة ولكن أيضا القدرة على شراء المواد الاستهلاكية في الوقت المناسب (ولا سيما كواشف التسلسل، وهي جديدة نسبيا لفرق المشتريات والموردين) والموارد الحسابية، فضلا عن مجرد الوصول إلى الطاقة المستقرة والإنترنت. يساعد استخدام تقنية تسلسل المسام النانوية المحمولة كأساس لسير العمل هذا في العديد من مشكلات إمكانية الوصول هذه ، وقد أثبتنا استخدام بروتوكولنا عبر مجموعة من الإعدادات ، وإجراء البروتوكول الكامل والتحليل داخل البلد. من المسلم به أن شراء المعدات وتسلسل المواد الاستهلاكية في الوقت المناسب لا يزال يمثل تحديا ، وفي كثير من الحالات ، اضطررنا إلى حمل أو شحن الكواشف من المملكة المتحدة. ومع ذلك ، في بعض المناطق ، تمكنا من الاعتماد كليا على طرق الإمداد المحلية للكواشف ، مستفيدين من الاستثمار في تسلسل SARS-CoV-2 (على سبيل المثال ، الفلبين) الذي بسط عمليات الشراء وبدأ في تطبيع تطبيق علم الجينوم الممرض.
يتم تقليل الحاجة إلى اتصال إنترنت مستقر عن طريق عمليات التثبيت لمرة واحدة فقط ؛ على سبيل المثال ، لا تتطلب مستودعات GitHub وتنزيل البرامج وتسلسل المسام النانوية نفسها سوى الوصول إلى الإنترنت لبدء التشغيل (وليس طوال الوقت) أو يمكن إجراؤها في وضع عدم الاتصال تماما بموافقة الشركة. في حالة توفر بيانات الجوال، يمكن استخدام الهاتف كنقطة اتصال للكمبيوتر المحمول لبدء تشغيل التسلسل، قبل قطع الاتصال طوال مدة التشغيل. عند معالجة العينات بشكل روتيني ، يمكن أن تنمو متطلبات تخزين البيانات بسرعة ، ومن الناحية المثالية سيتم تخزين البيانات على الخادم. خلاف ذلك ، فإن محركات الأقراص الصلبة ذات الحالة الصلبة (SSD) رخيصة نسبيا للمصدر.
وبينما ندرك أنه لا تزال هناك حواجز أمام المراقبة الجينومية في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل، فإن زيادة الاستثمار في بناء إمكانية الوصول إلى علم الجينوم والخبرة (على سبيل المثال، مبادرة علم الجينوم الممرض في أفريقيا [Africa PGI])64 تشير إلى أن هذا الوضع سيتحسن. يعد الترصد الجينومي أمرا بالغ الأهمية للتأهب للجوائح6 ، ويمكن بناء القدرات من خلال روتين المراقبة الجينومية لمسببات الأمراض المتوطنة مثل RABV. يجب أن تكون التفاوتات العالمية في قدرات التسلسل التي تم تسليط الضوء عليها خلال جائحة SARS-CoV-2 محركا للتغيير التحفيزي لمعالجة هذه التفاوتات الهيكلية.
إن سير العمل هذا من العينة إلى التسلسل إلى التفسير ل RABV ، بما في ذلك أدوات المعلوماتية الحيوية التي يمكن الوصول إليها ، لديه القدرة على استخدامه لتوجيه تدابير المكافحة التي تستهدف هدف القضاء على الوفيات البشرية الناجمة عن داء بوساطة بحلول عام 2030 ، وفي نهاية المطاف للقضاء على متغيرات RABV. وإلى جانب البيانات الوصفية ذات الصلة، تسهل البيانات الجينومية الناتجة عن هذا البروتوكول التوصيف السريع لفيروس التهاب الكبد الوبائي أثناء تحريات الفاشية وفي تحديد السلالات المتداولة في بلد أو منطقة60،61،65. نوضح خط الأنابيب الخاص بنا في الغالب باستخدام أمثلة من داء بوساطة. ومع ذلك ، فإن سير العمل ينطبق مباشرة على داء في الحياة البرية. تقلل قابلية النقل هذه والتكلفة المنخفضة من التحديات في جعل التسلسل الروتيني متاحا بسهولة ، ليس فقط لداء ولكن أيضا لمسببات الأمراضالأخرى 46،66،67 ، لتحسين إدارة المرض ومكافحته.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا العمل من قبل Wellcome [207569 / Z / 17 / Z ، 224670 / Z / 21 / Z] ، وتمويل نيوتن من مجلس البحوث الطبية [MR / R025649 / 1] ووزارة العلوم والتكنولوجيا الفلبينية (DOST) ، والجهد العالمي للبحث والابتكار في المملكة المتحدة بشأن COVID-19 [MR / V035444 / 1] ، وصندوق الدعم الاستراتيجي المؤسسي بجامعة غلاسكو [204820] ، وجائزة الباحث الجديد لمجلس البحوث الطبية (KB) [MR / X002047 / 1] ، وصندوق تنمية الشراكة الدولية ، ومنحة المجلس الثقافي البريطاني في الفلبين (CB) ، والمعهد الوطني للبحوث الصحية [17/63/82] منحة GemVi (GJ) ، ومنح جامعة غلاسكو من MVLS DTP (KC) [125638-06] ، EPSRC DTP (RD) [EP / T517896 / 1] ، و Wellcome IIB DTP (HF) [218518 / Z / 19 / Z]. نحن ممتنون للزملاء والمتعاونين الذين دعموا هذا العمل: دانيال سترايكر ، أليس بروس ، إليزابيث ميراندا ، DVM ، داريا مانالو ، DVM ، ثومبي موانجي ، كينيدي لوشاسي ، تشارلز كايوكي ، جود كارلو بوليفار ، جيرومير بوندوك ، إستفين بالبين ، رونيل تونغوهان ، أجاثا أوكاندي ، ديفيس كوتشاكا ، مومبوا موتونغا ، لويتيكو سيكانا ، وآنا زوبرينا.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Brand name | |||
Software | |||
Sequencing software (MinKnow) | Oxford Nanopore Technologies | https://community.nanoporetech.com/downloads | |
Bioinformatics tool kit (Guppy) | Oxford Nanopore Technologies | https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018 | |
Equipment | |||
Thermal cycler (miniPCR™ mini16 thermal cycler) | Cambio | MP-QP-1016-01 | |
Homogenizer (Precellys Evolution Touch Homogenizer) | Bertin Instruments | EQ02520-300 | |
Cold Racks (0.2-0.5mL) (PCR Mini-cooler with transparent lid) | BRAND | 781260 | |
Pipettor | |||
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL) | Gilson | SKU: FA10030 | |
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL) | Gilson | SKU: FA10024 | |
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL) | Gilson | SKU: FA10020 | |
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL) | Gilson | SKU: FA10025 | |
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL) | Gilson | SKU: FA10021 | |
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL) | Gilson | SKU: FA10026 | |
Fluorometer (Qubit 4 Fluorometer) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q33238 | |
Laptop (Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU]) | |||
Microcentrifuge (Refrigerated centrifuge) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 75004081 | |
Vortex mixer (Basic vortex mixer) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 88882011 | |
Magnetic rack (DynaMag -2 Magnet) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 12321D | |
Sequencing device (MinION) | Oxford Nanopore Technologies | MinION Mk1B | |
RNA Extraction | |||
RNA extraction kit (Qiagen RNEasy Mini Kit 250) | Qiagen | 74106 | |
RNA stabilizing reagents | |||
(RNA later) | Invitrogen | AM7020 | |
(DNA/RNA Shield) | Zymo Research | R1100-50 | |
PCR | |||
Nuclease-free Water (Nuclease-free Water [not DEPC-treated]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | AM9937 | |
Master mix for first strand cDNA synthesis (LunaScript RT SuperMix Kit) | New England Biolabs | E3010S | |
DNA amplification master mix (Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB]) | New England Biolabs | M0494L | |
Primer (Scheme) (Custom DNA oligos) | Invitrogen | ||
SPRI Bead Clean-up | |||
SPRI beads (Aline Biosciences PCR Clean DX ) | Cambio | AL-AC1003-50 | |
Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen] | Merck | 818760 | |
Short Fragment buffer (SFB expansion pack) | Oxford Nanopore Technologies | EXP-SFB001 | |
DNA Quantification | |||
DNA quantification kit (Qubit® dsDNA HS Assay Kit) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q32854 | |
DNA quantification assay tubes (Qubit™ Assay Tubes) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q32856 | |
End Prep and barcoding (Qubit™ Assay Tubes) | |||
End Prep master mix (NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module) | New England Biolabs | E7546L | |
Barcoding kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 | |
(Native Barcoding Expansion 1-12) | EXP-NBD104 | ||
(Native Barcoding Expansion 13-24) | EXP-NBD114 | ||
(Native Barcoding Expansion 96) | EXP-NBD196 | ||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 | |
(not compatible) | (not compatible) | ||
(Native Barcoding Kit 24 V14) | SQK-NBD114.24 | ||
(Native Barcoding Kit 96 V14) | SQK-NBD114.96 | ||
Ligation mastermix (Blunt/TA Ligase Master Mix) | New England Biolabs | M0367S | |
Adapter Ligation | |||
Adapter ligation master mix | |||
(NEBNext Quick Ligation Module) | New England Biolabs | E6056S | |
(NEBNext Ultra II Ligation Module) | New England Biolabs | E7595S | |
(Blunt/TA Ligase Master Mix) | New England Biolabs | M0367S | |
Adapter mix | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 EXP-AMII001 | |
(Adapter Mix II [AMII]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 EXP-NBA114 | |
(Native adapter [NA]) | |||
Sequencing | |||
Flowcell priming kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 EXP-FLP002 | |
(Flush Buffer [FB]) | |||
(Flush Tether [FT]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 EXP-FLP004 | |
(Flow Cell Flush [FCF]) | |||
(Flow Cell Tether [FCT]) | |||
Ligation Sequencing Kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 SQK-LSK109 | |
Adapter Mix (Adapter Mix [AMX]) | |||
Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB]) | |||
Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB]) | |||
Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SQB]) | |||
Elution Buffer (Elution buffer [EB]) | |||
Loading Beads (Loading Beads [LB]) | |||
Sequencing Tether (Sequencing Tether [SQT]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 SQK-LSK114 | |
Adapter Mix (Ligation Adapter [LA]) | |||
Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB]) | |||
Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB]) | |||
Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SB]) | |||
Elution Buffer (Elution buffer [EB]) | |||
Loading Beads (Loading Beads [LIB]) | |||
Sequencing Tether (Flow Cell Tether [FCT]) | |||
Library solution (Library solution [LIS]) | |||
Flush buffer (Flow Cell Flush [FCF]) | |||
Flow Cell | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 FLO-MIN106D | |
(Flow Cell [R9.4.1]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 FLO-MIN114 | |
(Flow Cell [R10.4.1]) | |||
Flow Cell wash | |||
Flowcell wash kit (Flow cell wash kit) | Oxford Nanopore Technologies | EXP-WSH004 | |
Consummables | |||
Surface decontaminant | |||
(DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 7010PK | |
(RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 7002PK | |
PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap (PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner]) | Greiner | 608281 | |
PCR Tube 0.2ml (PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner]) | Greiner | 671201 | |
1000µL Filter Tips (500) (Stacked 1000µL Filter Tips [500]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11977724 | |
100µL Filter Tips (1000) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11947724 | |
10µL Filter Tips (1000) (Stacked 100µL Filter Tips [1000]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11907724 | |
Reinforced tubes tubes (2ml) with screw caps and o-rings (Fisherbrand™ Bulk tubes) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 15545809 | |
Microcentrifuge tube (1.5ml) (1.5 ml Eppendorf Tubes [500]) | Eppendorf | 1229888 | |
DNA LoBind Tubes (1.5ml) (DNA LoBind Tubes) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 10051232 | |
Cryobabies labels | |||
Gloves (S/M/L) | |||
Paper towel |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved