النشاط المساعد للمتفطرة نظيرة السل في تعزيز مناعة المستضدات الذاتية أثناء التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا بديلا للحث بنشاط على التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي في الفئران C57BL / 6 ، باستخدام البروتين السكري قليل التغصن قليل التغصن المناعي (MOG) _35-55 المعلق في مساعد فرويند غير المكتمل الذي يحتوي على المتفطرة الطيرية المقتولة بالحرارة paratuberculosis.

Abstract

يتطلب التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) الناجم عن البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG) التحصين بواسطة ببتيد MOG المستحلب في مساعد فرويند الكامل (CFA) الذي يحتوي على المتفطرة السلية المعطلة. تعمل المكونات المستضدية للمتفطرة على تنشيط الخلايا المتغصنة لتحفيز الخلايا التائية لإنتاج السيتوكينات التي تعزز استجابة Th1 عبر مستقبلات تشبه الرسوم. لذلك ، ترتبط كمية وأنواع المتفطرات الموجودة خلال التحدي المستضد ارتباطا مباشرا بتطور EAE. تقدم ورقة الطرق هذه بروتوكولا بديلا للحث على EAE في الفئران C57BL / 6 باستخدام مساعد Freund غير مكتمل معدل يحتوي على سلالة المتفطرة الطيرية المقتولة بالحرارة سلالة السل K-10.

المتفطرة السلية، وهي عضو في مجمع المتفطرة الطيرية (Mycobacterium avium)، هي العامل المسبب لمرض جون في المجترات، وقد تم تحديدها كعامل خطر للعديد من الاضطرابات البشرية بوساطة الخلايا التائية، بما في ذلك التصلب المتعدد. وعموما، أظهرت الفئران المحصنة بالمتفطرة نظيرة السل بداية مبكرة وشدة مرض أكبر من الفئران المحصنة بداء السل الذي يحتوي على سلالة المتفطرة السلية H37Ra عند نفس الجرعات البالغة 4 ملغم/مل. تمكنت المحددات المستضدية لسلالة المتفطرة الطيرية (MAP) من سلالة K-10 من إحداث استجابة خلوية قوية Th1 خلال مرحلة المستجيب ، والتي تتميز بأعداد أكبر بكثير من الخلايا اللمفاوية التائية (CD4 + CD27 +) ، والخلايا المتغصنة (CD11c + I-A / ^{I-E +}) ، والوحيدات (CD11b + CD115 ⁺) في الطحال مقارنة بالفئران المحصنة ب CFA. علاوة على ذلك ، يبدو أن استجابة الخلايا التائية التكاثرية لببتيد MOG هي الأعلى في الفئران المحصنة ضد السل. قد يكون استخدام الدماغ الليتفوت (على سبيل المثال ، MOG_35-55) المستحلب في مادة مساعدة تحتوي على M. paratuberculosis في التركيبة طريقة بديلة ومثبتة لتنشيط الخلايا المتغصنة لتحضير الخلايا التائية CD4 ⁺ T الخاصة بالمايلين أثناء مرحلة تحريض EAE.

Introduction

التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج شائع لدراسة اضطرابات إزالة الميالين البشرية¹. هناك عدة نماذج من EAE: التحصين النشط باستخدام ببتيدات المايلين المختلفة مع المواد المساعدة القوية ، والتحصين السلبي عن طريق النقل في المختبر للخلايا الليمفاوية CD4 ⁺ الخاصة بالمايلين ، والنماذج المعدلة وراثيا ل EAE² التلقائي. يحتوي كل نموذج من هذه النماذج على ميزات محددة تسمح بدراسة جوانب مختلفة من EAE ، مثل مرحلة البداية أو المستجيب أو المرحلة المزمنة. يعد نموذج البروتين السكري قليل التغصن النخاعي (MOG) ل EAE نموذجا جيدا لدراسة الآليات المناعية للالتهاب العصبي المزمن وإزالة الميالين ، حيث يتميز بتسلل التهابي أحادي النواة ، وإزالة الميالين في المادة البيضاء المحيطية ، وتقليل الشفاء بعد ذروة المرض¹.

يتم تحفيز MOG-EAE عن طريق تحصين الفئران الحساسة مع الببتيد MOG_35-55 في مساعد فرويند الكامل (CFA) ، يليه حقن داخل الصفاق من سم السعال الديكي. هذا يزيد من نفاذية الحاجز الدموي الدماغي ويسمح للخلايا التائية الخاصة بالمايلين التي يتم تنشيطها في المحيط بالوصول إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، حيث سيتم إعادة تنشيطها³. يلعب CFA دورا رئيسيا في تحريض EAE من خلال تعزيز امتصاص المستضد بواسطة الخلايا المقدمة للمستضد والتعبير عن السيتوكينات المتعلقة بالاستجابات الخلطية والخلوية⁴. هذه الآلية ترجع أساسا إلى وجود المتفطرة السلية المقتولة المستحلبة في الزيت ، والتي توفر مكوناتها حافزا قويا لجهاز المناعة⁵. في الواقع ، يرتبط تحريض EAE ارتباطا مباشرا بكمية المتفطرة الموجودة خلال التحدي المستضد⁶.

إن إضافة المتفطرات المقتولة الأخرى ، مثل المتفطرة الزبدية ، إلى مساعد^{فرويند 7} غير المكتمل ، وكذلك تأثير المجموعات المساعدة⁸ ، يمكن أن يعدل المسار السريري ل EAE وبالتالي يؤثر على استنساخ النتائج. ارتبطت سلالات المتفطرة الطيرية نظير السل (MAP) ، العامل المسبب لمرض جون في المجترات ، بالاضطرابات الالتهابية في الجهاز العصبي المركزي البشري 9 ، حيث أن مكوناته المستضدية قادرة على إثارة استجابة قوية بوساطة الخلط والخلايا في المرضى الذين يعانون من التصلب المتعدد واضطراب طيف التهاب النخاع والعصب^{البصري 9}. لذلك ، في هذا البروتوكول ، نعرض طريقة بديلة وقابلة للتكرار للحث على MOG-EAE عن طريق استبدال M. السل في CFA ب M. paratuberculosis.

Protocol

تمت الموافقة على جميع تجارب الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان التابعة لكلية الطب بجامعة جونتيندو (رقم الموافقة 290238) وأجريت وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة للتجارب على الحيوانات.

1. تعليقات عامة على التجربة

1. إيواء الفئران في أقفاص فردية في منشأة حيوانية في ظل ظروف خاضعة للرقابة وخالية من مسببات الأمراض عند 23 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية مع رطوبة 50٪ ± 10٪ ، ودورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء.
2. حقن الفئران بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون مستضد و CFA ، واستخدمها كضوابط سلبية وإيجابية ، على التوالي.

2. إعداد المستضدات الفطرية

1. تنمو سلالة M. paratuberculosis K-10 في وسط ميدلبروك السائل 7H9 المخصب ب 10٪ OADC (حمض الأوليك ، الألبومين ، سكر العنب ، الكاتالاز) ، 0.005٪ توين 80 ، و 2 مجم / لتر من الميكوباكتين J لمدة أسبوعين في قوارير زراعة الأنسجة T25 عند 37 درجة مئوية. تقييم نمو المستعمرة بانتظام عن طريق الفحص البصري.
   تنبيه: التعامل مع المتفطرة نظيرة السل في مرفق السلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL-2).
2. قم بتنمية دورق Erlenmeyer 500 مل من التخصيب مع تعليق 1.7 × 10⁵ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) / مل في حجم نهائي قدره 200 مل (نفس الوسط مثل الخطوة 2.1) في حاضنة اهتزاز لمدة أسبوع واحد.
   ملاحظة: نظرا لأن الكائنات الملوثة قد تؤثر على النتائج ، يجب تلقيح البكتيريا على الوسائط الصلبة Middlebrook 7H10 لتحديد مورفولوجيا المستعمرة والتحقق من النقاء بواسطة مجموعات الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي (PCR) ل M. paratuberculosis.
3. قم بتعطيل المعلقات البكتيرية لمدة 5-10 دقائق عند 70 درجة مئوية وأجهزة الطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق. اغسل الحبيبات الموزونة في برنامج تلفزيوني مرتين ، وقم بتعطيلها عن طريق الصوتنة ، وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
4. نقل بيليه إلى وعاء معقم وتجميدها مع الثلج الجاف أو النيتروجين السائل. نقل على الفور إلى غرفة التجفيف بالتجميد.
5. تجميد جاف (4 ساعات عند -50 درجة مئوية تحت الفراغ) M. paratuberculosis وفقا لدليل الجهاز.
6. في نهاية التجفيد ، قم بإزالة الحاوية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ من مجفف التجميد ونقلها إلى مقعد التنظيف الحيوي. استخدم ملعقة من الفولاذ المقاوم للصدأ لإزاحة كتل MAP المجففة الملتصقة بالجدار الداخلي للحاوية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ وسحقها بأكبر قدر ممكن من الدقة.
7. وزن الخلايا المسحوقة باستخدام ميزان إلكتروني ووضعها يدويا في قنينة معقمة سعة 10 مل بتركيز 10 مجم / مل.
   ملاحظة: تم تحديد كثافة الخلية كجرام من الوزن الجاف لكل لتر من العينة. بعد 3 أسابيع ، يحتوي 1 ملغ (الوزن الرطب) من حبيبات الخلايا البكتيرية على حوالي 2.5 × 10⁸ CFU.

3. إعداد مستحلب MOG _35-55

1. قم بطحن محتويات قارورة واحدة من المتصورة السلية المجففة (10 ملغ) إلى مسحوق ناعم مع هاون ومدقة وأضف 10 مل إلى مساعد فرويند غير المكتمل للحصول على محلول مخزون 10 مجم / مل. يحفظ في درجة حرارة -4 درجة مئوية.
2. قبل التحصين، خفف محلول المرق إلى تركيز نهائي قدره 4 ملغم/مل.
3. خفف الببتيد MOG_35-55 في ddH 2 O إلى تركيز نهائي قدره₂ملغ / مل وخزن في -20 درجة مئوية.
4. باستخدام الخالط ، امزج محلول MOG_35-55 (2 مجم / مل) مع حجم متساو من المواد المساعدة (4 مجم / مل) من الخطوة 3.2 في أنبوب سعة 5 مل حتى يتم تشكيل مستحلب سميك. بعد كل 10 ثوان من الخلط ، ضع المحلول على الثلج لمدة 20 ثانية ، وقم بتدوير الأنبوب لاستعادة كل المحلول.
5. انقل المستحلب إلى حقنة سعة 1 مل ، وأزل كل الهواء ، وأضف إبرة 27 جرام. المستحلب جاهز الآن للحقن.
   ملاحظه. نظرا لأن بعض فقدان المستحلب اللزج ل MOG_35-55 يحدث أثناء التحضير ، فمن الأفضل تحضير 1.5 ضعف الكمية المطلوبة.

4. تحصين الحيوانات

1. تخدير الحيوانات باستنشاق الأيزوفلوران لتقليل الضغط على الحيوانات.
2. حقن المستحلب (200 ميكرولتر يحتوي على 200 ميكروغرام / فأر من MOG_35-55) تحت الجلد في أسفل الظهر.
3. تطبيق جرعة من سم السعال الديكي (100 ميكرولتر تحتوي على 200 نانوغرام/فأر) داخل الصفاق في اليومين 0 و2 بعد التحصين.
   تنبيه: سم السعال الديكي له تأثير قمعي متعدد على الجهاز المناعي. تجنب الابتلاع والتلامس مع العينين والجلد.

5. التقييم السريري

1. مراقبة الفئران يوميا للوزن والعلامات السريرية. استخدم نظام التسجيل التالي: 0 = لا توجد علامات سريرية ؛ 1 = ذيل رخو ؛ 2 = ضعف منعكس التصحيح وضعف الأطراف الخلفية ؛ 3 = شلل كامل في الأطراف الخلفية ؛ 4 = شلل كامل في الأطراف الخلفية مع شلل جزئي في الأطراف الأمامية ؛ 5 = محتضر.
   ملاحظة: عند الملاحظة الأولية للعلامات السريرية ، يتم تزويد الحيوانات بإمكانية متزايدة للحصول على الماء والغذاء. يتم تليين القوارض وترطيبها ، ثم وضعها على أرضية القفص من قادوس الطعام. في حالة الحيوانات المجففة ، يتم إعطاء مكملات السوائل تحت الجلد ، أو يتم إعطاء ملاط القوارض عن طريق التزويج الفموي. إذا احتاج الفأر إلى هذا النوع من المساعدة لأكثر من 3 أيام ، إجراء القتل الرحيم.
2. لتجنب أو تقليل الألم والضيق الحيواني ، استخدم نقاط النهاية البشرية التالية: فقدان وزن الجسم أكبر من 20٪ ، والنتيجة السريرية ≥4.0 ، وغياب رد الفعل الصحيح عند الدرجة 3 ، وعندما يكون الحيوان غير قادر على الوصول إلى العلف أو الماء لمدة 24 ساعة.
   ملاحظة: تم القتل الرحيم للفئران في اليوم 30 بعد تحريض EAE عن طريق الحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال (≥150 ملغم / كغم).

النتائج

تم تحصين مجموعات من الفئران C57BL / 6 (المجموع n = 15 / مجموعة) مع MOG_35-55 في مستحلب يحتوي على M. paratuberculosis أو بالطريقة الشائعة مع CFA. أظهرت جميع مجموعات الفئران مرضا أحادي الطور حادا يتميز بذروة واحدة من الإعاقة لوحظت في 14-17 يوما ، يليها انتعاش جزئي للأعراض خلال الأيام العش?...

Discussion

لقد أظهرنا بروتوكولا بديلا قويا للحث بنشاط على EAE الشديد في الفئران C57BL / 6J باستخدام الببتيد MOG_35-55 المستحلب في مادة مساعدة تحتوي على M. paratuberculosis¹⁰. أدى تحريض EAE بهذه الطريقة إلى مرض أكثر حدة من ذلك الناجم عن البروتوكول المشترك مع CFA. يمكن أن يكون هذا الاختلاف بسبب المكونا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-mouse CD115 antibody	Biolegend, USA	135505	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody	Biolegend, USA	101215	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody	Biolegend, USA	117313	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody	Biolegend, USA	101302	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody	Biolegend, USA	116004	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody	Biolegend, USA	100753	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend, USA	107635	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody	Biolegend, USA	128023	for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice	Charles River Laboratory, Japan		3 weeks old, male and female
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine	Eyela, Tokyo, Japan	FDU-1200	for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant	Difco Laboratories, MD, USA	263810	for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	for use in adjuvant
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution	Fujifilm Wako, Osaka Japan	168-22471	From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100	Kinematica		for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine	Gibco Life Techologies, USA	11875093	For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, USA	423105	cytofluorimetry, for cell viability