النشاط المساعد للمتفطرة نظيرة السل في تعزيز مناعة المستضدات الذاتية أثناء التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا بديلا للحث بنشاط على التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي في الفئران C57BL / 6 ، باستخدام البروتين السكري قليل التغصن قليل التغصن المناعي (MOG) _35-55 المعلق في مساعد فرويند غير المكتمل الذي يحتوي على المتفطرة الطيرية المقتولة بالحرارة paratuberculosis.

Abstract

يتطلب التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) الناجم عن البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG) التحصين بواسطة ببتيد MOG المستحلب في مساعد فرويند الكامل (CFA) الذي يحتوي على المتفطرة السلية المعطلة. تعمل المكونات المستضدية للمتفطرة على تنشيط الخلايا المتغصنة لتحفيز الخلايا التائية لإنتاج السيتوكينات التي تعزز استجابة Th1 عبر مستقبلات تشبه الرسوم. لذلك ، ترتبط كمية وأنواع المتفطرات الموجودة خلال التحدي المستضد ارتباطا مباشرا بتطور EAE. تقدم ورقة الطرق هذه بروتوكولا بديلا للحث على EAE في الفئران C57BL / 6 باستخدام مساعد Freund غير مكتمل معدل يحتوي على سلالة المتفطرة الطيرية المقتولة بالحرارة سلالة السل K-10.

المتفطرة السلية، وهي عضو في مجمع المتفطرة الطيرية (Mycobacterium avium)، هي العامل المسبب لمرض جون في المجترات، وقد تم تحديدها كعامل خطر للعديد من الاضطرابات البشرية بوساطة الخلايا التائية، بما في ذلك التصلب المتعدد. وعموما، أظهرت الفئران المحصنة بالمتفطرة نظيرة السل بداية مبكرة وشدة مرض أكبر من الفئران المحصنة بداء السل الذي يحتوي على سلالة المتفطرة السلية H37Ra عند نفس الجرعات البالغة 4 ملغم/مل. تمكنت المحددات المستضدية لسلالة المتفطرة الطيرية (MAP) من سلالة K-10 من إحداث استجابة خلوية قوية Th1 خلال مرحلة المستجيب ، والتي تتميز بأعداد أكبر بكثير من الخلايا اللمفاوية التائية (CD4 + CD27 +) ، والخلايا المتغصنة (CD11c + I-A / ^{I-E +}) ، والوحيدات (CD11b + CD115 ⁺) في الطحال مقارنة بالفئران المحصنة ب CFA. علاوة على ذلك ، يبدو أن استجابة الخلايا التائية التكاثرية لببتيد MOG هي الأعلى في الفئران المحصنة ضد السل. قد يكون استخدام الدماغ الليتفوت (على سبيل المثال ، MOG_35-55) المستحلب في مادة مساعدة تحتوي على M. paratuberculosis في التركيبة طريقة بديلة ومثبتة لتنشيط الخلايا المتغصنة لتحضير الخلايا التائية CD4 ⁺ T الخاصة بالمايلين أثناء مرحلة تحريض EAE.

Introduction

التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج شائع لدراسة اضطرابات إزالة الميالين البشرية¹. هناك عدة نماذج من EAE: التحصين النشط باستخدام ببتيدات المايلين المختلفة مع المواد المساعدة القوية ، والتحصين السلبي عن طريق النقل في المختبر للخلايا الليمفاوية CD4 ⁺ الخاصة بالمايلين ، والنماذج المعدلة وراثيا ل EAE² التلقائي. يحتوي كل نموذج من هذه النماذج على ميزات محددة تسمح بدراسة جوانب مختلفة من EAE ، مثل مرحلة البداية أو المستجيب أو المرحلة المزمنة. يعد نموذج البروتين السكري قليل التغصن النخاعي (MOG) ل EAE نموذجا جيدا لدراسة الآليات المناعية للالتهاب العصبي المزمن وإزالة الميالين ، حيث يتميز ....

Protocol

تمت الموافقة على جميع تجارب الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان التابعة لكلية الطب بجامعة جونتيندو (رقم الموافقة 290238) وأجريت وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة للتجارب على الحيوانات.

1. تعليقات عامة على التجربة

1. إيواء الفئران في أقفاص فردية في منشأة حيوانية في ظل ظروف خاضعة للرقابة وخالية من مسببات الأمراض عند 23 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية مع رطوبة 50٪ ± 10٪ ، ودورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء.
2. حقن الفئران بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون مستضد و CFA ، واستخدمها كضوابط سلبية وإيجابية ، على التوالي.

....

النتائج

تم تحصين مجموعات من الفئران C57BL / 6 (المجموع n = 15 / مجموعة) مع MOG_35-55 في مستحلب يحتوي على M. paratuberculosis أو بالطريقة الشائعة مع CFA. أظهرت جميع مجموعات الفئران مرضا أحادي الطور حادا يتميز بذروة واحدة من الإعاقة لوحظت في 14-17 يوما ، يليها انتعاش جزئي للأعراض خلال الأيام العش?.......

Discussion

لقد أظهرنا بروتوكولا بديلا قويا للحث بنشاط على EAE الشديد في الفئران C57BL / 6J باستخدام الببتيد MOG_35-55 المستحلب في مادة مساعدة تحتوي على M. paratuberculosis¹⁰. أدى تحريض EAE بهذه الطريقة إلى مرض أكثر حدة من ذلك الناجم عن البروتوكول المشترك مع CFA. يمكن أن يكون هذا الاختلاف بسبب المكونا.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-mouse CD115 antibody	Biolegend, USA	135505	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody	Biolegend, USA	101215	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody	Biolegend, USA	117313	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody	Biolegend, USA	101302	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody	Biolegend, USA	116004	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody	Biolegend, USA	100753	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend, USA	107635	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody	Biolegend, USA	128023	for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice	Charles River Laboratory, Japan		3 weeks old, male and female
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine	Eyela, Tokyo, Japan	FDU-1200	for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant	Difco Laboratories, MD, USA	263810	for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	for use in adjuvant
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution	Fujifilm Wako, Osaka Japan	168-22471	From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100	Kinematica		for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine	Gibco Life Techologies, USA	11875093	For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, USA	423105	cytofluorimetry, for cell viability