A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا بديلا للحث بنشاط على التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي في الفئران C57BL / 6 ، باستخدام البروتين السكري قليل التغصن قليل التغصن المناعي (MOG) 35-55 المعلق في مساعد فرويند غير المكتمل الذي يحتوي على المتفطرة الطيرية المقتولة بالحرارة paratuberculosis.

Abstract

يتطلب التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) الناجم عن البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG) التحصين بواسطة ببتيد MOG المستحلب في مساعد فرويند الكامل (CFA) الذي يحتوي على المتفطرة السلية المعطلة. تعمل المكونات المستضدية للمتفطرة على تنشيط الخلايا المتغصنة لتحفيز الخلايا التائية لإنتاج السيتوكينات التي تعزز استجابة Th1 عبر مستقبلات تشبه الرسوم. لذلك ، ترتبط كمية وأنواع المتفطرات الموجودة خلال التحدي المستضد ارتباطا مباشرا بتطور EAE. تقدم ورقة الطرق هذه بروتوكولا بديلا للحث على EAE في الفئران C57BL / 6 باستخدام مساعد Freund غير مكتمل معدل يحتوي على سلالة المتفطرة الطيرية المقتولة بالحرارة سلالة السل K-10.

المتفطرة السلية، وهي عضو في مجمع المتفطرة الطيرية (Mycobacterium avium)، هي العامل المسبب لمرض جون في المجترات، وقد تم تحديدها كعامل خطر للعديد من الاضطرابات البشرية بوساطة الخلايا التائية، بما في ذلك التصلب المتعدد. وعموما، أظهرت الفئران المحصنة بالمتفطرة نظيرة السل بداية مبكرة وشدة مرض أكبر من الفئران المحصنة بداء السل الذي يحتوي على سلالة المتفطرة السلية H37Ra عند نفس الجرعات البالغة 4 ملغم/مل. تمكنت المحددات المستضدية لسلالة المتفطرة الطيرية (MAP) من سلالة K-10 من إحداث استجابة خلوية قوية Th1 خلال مرحلة المستجيب ، والتي تتميز بأعداد أكبر بكثير من الخلايا اللمفاوية التائية (CD4 + CD27 +) ، والخلايا المتغصنة (CD11c + I-A / I-E +) ، والوحيدات (CD11b + CD115 +) في الطحال مقارنة بالفئران المحصنة ب CFA. علاوة على ذلك ، يبدو أن استجابة الخلايا التائية التكاثرية لببتيد MOG هي الأعلى في الفئران المحصنة ضد السل. قد يكون استخدام الدماغ الليتفوت (على سبيل المثال ، MOG35-55) المستحلب في مادة مساعدة تحتوي على M. paratuberculosis في التركيبة طريقة بديلة ومثبتة لتنشيط الخلايا المتغصنة لتحضير الخلايا التائية CD4 + T الخاصة بالمايلين أثناء مرحلة تحريض EAE.

Introduction

التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج شائع لدراسة اضطرابات إزالة الميالين البشرية1. هناك عدة نماذج من EAE: التحصين النشط باستخدام ببتيدات المايلين المختلفة مع المواد المساعدة القوية ، والتحصين السلبي عن طريق النقل في المختبر للخلايا الليمفاوية CD4 + الخاصة بالمايلين ، والنماذج المعدلة وراثيا ل EAE2 التلقائي. يحتوي كل نموذج من هذه النماذج على ميزات محددة تسمح بدراسة جوانب مختلفة من EAE ، مثل مرحلة البداية أو المستجيب أو المرحلة المزمنة. يعد نموذج البروتين السكري قليل التغصن النخاعي (MOG) ل EAE نموذجا جيدا لدراسة الآليات المناعية للالتهاب العصبي المزمن وإزالة الميالين ، حيث يتميز ....

Protocol

تمت الموافقة على جميع تجارب الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان التابعة لكلية الطب بجامعة جونتيندو (رقم الموافقة 290238) وأجريت وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة للتجارب على الحيوانات.

1. تعليقات عامة على التجربة

  1. إيواء الفئران في أقفاص فردية في منشأة حيوانية في ظل ظروف خاضعة للرقابة وخالية من مسببات الأمراض عند 23 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية مع رطوبة 50٪ ± 10٪ ، ودورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء.
  2. حقن الفئران بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون مستضد و CFA ، واستخدمها كضوابط سلبية وإيجابية ، على التوالي.

....

النتائج

تم تحصين مجموعات من الفئران C57BL / 6 (المجموع n = 15 / مجموعة) مع MOG35-55 في مستحلب يحتوي على M. paratuberculosis أو بالطريقة الشائعة مع CFA. أظهرت جميع مجموعات الفئران مرضا أحادي الطور حادا يتميز بذروة واحدة من الإعاقة لوحظت في 14-17 يوما ، يليها انتعاش جزئي للأعراض خلال الأيام العش?.......

Discussion

لقد أظهرنا بروتوكولا بديلا قويا للحث بنشاط على EAE الشديد في الفئران C57BL / 6J باستخدام الببتيد MOG35-55 المستحلب في مادة مساعدة تحتوي على M. paratuberculosis10. أدى تحريض EAE بهذه الطريقة إلى مرض أكثر حدة من ذلك الناجم عن البروتوكول المشترك مع CFA. يمكن أن يكون هذا الاختلاف بسبب المكونا.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

وتلقى هذا العمل دعما من منحة من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (المنحة رقم. JP 23K14675).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-mouse CD115 antibodyBiolegend, USA135505for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibodyBiolegend, USA101215for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibodyBiolegend, USA117313for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibodyBiolegend, USA101302for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibodyBiolegend, USA116004for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibodyBiolegend, USA100753for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibodyBiolegend, USA107635for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibodyBiolegend, USA128023for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC EnrichmentThermo Fisher Scientific, USABD 211886for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J miceCharles River Laboratory, Japan3 weeks old, male and female
FBS 10279-106Gibco Life Techologies, USA42F9155Kfor cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machineEyela, Tokyo, JapanFDU-1200for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvantDifco Laboratories, MD, USA263810for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 BrothDifco Laboratories, MD, USA90003-876help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10ATCC, USABAA-968bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, DesiccatedBD Biosciences, USA743-26880-EAfor use in adjuvant
Mycobactin JAllied Laboratory, MO, USAgrowth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55AnaSpec, USAAS-60130-10encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264)Sigma-Aldrich, USAS7951-1MGnegative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solutionFujifilm Wako, Osaka Japan168-22471From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100Kinematicafor mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamineGibco Life Techologies, USA11875093For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCiPerkinElmer, Waltham, MA, USANET027W001MCfor proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability KitBiolegend, USA423105 cytofluorimetry, for cell viability

References

  1. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
  2. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 195 C57BL 6J

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved