실험적 자가면역 뇌척수염 동안 자가항원의 면역원성을 향상시키는 Mycobacterium paratuberculosis 의 보조 활성

요약

여기에서 우리는 열로 사멸된 Mycobacterium avium 아종 paratuberculosis를 포함하는 불완전한 Freund's adjuvant에 현탁된 면역원성 에피토프 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)_35-55를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 적극적으로 유도하는 대체 프로토콜을 제시합니다.

초록

미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG)에 의해 유도된 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)은 불활성화된 결핵균을 함유하는 완전 프로인트 보조제 (CFA)에서 유화된 MOG 펩티드에 의한 면역화를 필요로 한다. 마이코박테리움의 항원 성분은 수지상 세포를 활성화하여 T 세포를 자극하여 톨 유사 수용체를 통해 Th1 반응을 촉진하는 사이토카인을 생성합니다. 그러므로, 항원 챌린지 동안 존재하는 마이코박테리아의 양 및 종은 EAE의 발달과 직접적으로 관련된다. 이 방법 논문은 열-사멸된 Mycobacterium avium 아종 paratuberculosis 균주 K-10을 함유하는 변형된 불완전 프로인트 보조제를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 EAE를 유도하는 대안적인 프로토콜을 제시한다.

Mycobacterium avium 복합체의 구성원인 M. paratuberculosis는 반추 동물에서 요네병의 원인 물질이며 다발성 경화증을 포함한 여러 인간 T 세포 매개 장애의 위험 인자로 확인되었습니다. 전반적으로, Mycobacterium paratuberculosis로 면역화 된 마우스는 동일한 용량의 M. tuberculosis H37Ra를 함유 한 CFA로 예방 접종 된 마우스보다 조기 발병 및 더 큰 질병 중증도를 보였다. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) 균주 K-10의 항원 결정인자는 훨씬 더 많은 수의 T-림프구(CD4+ CD27+), 수지상 세포(CD11c+ IA/I-E+) 및 단핵구(CD11b+ CD115⁺) CFA로 면역화 된 마우스와 비교하여 비장에서. 또한, MOG 펩티드에 대한 증식성 T 세포 반응은 M. paratuberculosis-면역화된 마우스에서 가장 높은 것으로 나타났다. 제형 중의 M. paratuberculosis를 함유하는 보조제에서 유화된 뇌파리토겐 (예를 들어, MOG_35-55)의 사용은 EAE의 유도 단계 동안 미엘린 에피토프-특이적 CD4⁺ T-세포를 프라이밍하기 위한 수지상 세포를 활성화시키기 위한 대안적이고 검증된 방법일 수 있다.

서문

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 인간 탈수초성 장애 연구를 위한 일반적인 모델이다¹. EAE의 몇몇 모델들이 존재한다: 강력한 보조제와 조합된 상이한 미엘린 펩티드를 사용하는 능동 면역화, 미엘린-특이적 CD4⁺ 림프구의 시험관내 전달에 의한 수동 면역화, 및 자발적^EAE2의 트랜스제닉 모델. 이들 모델 각각은 발병기, 이펙터 단계 또는 만성 단계와 같은 EAE의 상이한 양태가 연구될 수 있도록 하는 특정 특징을 갖는다. EAE의 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG) 모델은 단핵 염증 침윤, 말초 백질에서의 탈수초화, 및 질환 피크¹ 후 회복 감소를 특징으로 하기 때문에 만성 신경염증 및 탈수초화의 면역 매개 메커니즘을 연구하기에 좋은 모델이다.

MOG-EAE는 완전한 프로인트 보조제(CFA)에서 펩티드 MOG_35-55 로 감수성 마우스를 면역화한 후, 백일해 독소를 복강내 주사함으로써 유도된다. 이것은 혈액뇌장벽의 투과성을 증가시키고 말초에서 활성화된 미엘린 특이적 T-세포가 중추신경계(CNS)에 도달하여 재활성화되도록 한다³. CFA는 항원 제시 세포에 의한 항원 흡수 및 체액 및 세포 매개 반응과 관련된 사이토카인의 발현을 향상시킴으로써 EAE의 유도에 핵심적인 역할을 한다⁴. 이 메커니즘은 주로 오일에 유화 된 사멸 된 Mycobacterium tuberculosis 의 존재에 기인하며, 그 성분은 면역계에 강한 자극을 제공한다⁵. 실제로, EAE의 유도는 항원 챌린지 동안 존재하는 마이코박테리움의 양과 직접적으로 관련된다⁶.

불완전한 프로인트 보조제⁷ 및 보조^{제 조합8}의 효과에 마이코박테리움 부티리쿰(Mycobacterium butyricum)과 같은 다른 사멸된 마이코박테리아를 첨가하는 것은 EAE의 임상 경과를 조절할 수 있고 결과적으로 결과의 재현성에 영향을 미칠 수 있다. 반추동물에서 요네병의 병인인 Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis(MAP)는 인간^CNS의 염증성 질환과 관련이 있는데, 이는 항원 성분이 다발성 경화증 및 시신경 척수염 스펙트럼 장애 환자에서 강력한 체액 및 세포 매개 반응을 유도할 수 있기 때문이다⁹. 따라서 이 프로토콜에서는 CFA의 M. tuberculosis를 M. paratuberculosis로 대체하여 MOG-EAE를 유도하는 대안적이고 재현 가능한 방법을 보여줍니다.

프로토콜

모든 마우스 실험은 쥰텐도대학교 의과대학 제도적 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호 290238)의 승인을 받았으며, 국립 보건원 동물 실험 가이드라인에 따라 수행되었습니다.

1. 실험에 대한 일반적인 의견

1. 50% ± 10% 습도로 23°C ± 2°C에서 통제되고 병원균이 없는 조건에서 동물 시설의 개별 케이지에 마우스를 수용하고 음식과 물에 대한 임의로 접근할 수 있는 12시간의 명암 주기.
2. 항원과 CFA가 없는 인산염 완충 식염수(PBS)를 마우스에 주사하고 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용합니다.

2. 마이코박테리아 항원의 제조

1. 10% OADC(올레산, 알부민, 덱스트로오스, 카탈라아제), 0.005% 트윈 80 및 2mg/L의 마이코박틴 J가 풍부한 미들브룩 액체 배지 7H9에서 M. paratuberculosis K-10 균주를 37°C의 T25 조직 배양 플라스크에서 2주 동안 성장시킵니다. 육안 검사를 통해 정기적으로 식민지 성장을 평가하십시오.
   주의 : 생물 안전 레벨 2 (BSL-2) 시설에서 M. paratuberculosis 를 다루십시오.
2. 농축 배양액 500mL 삼각 플라스크를 1주일 동안 진탕 배양기에서 200mL(단계 2.1과 동일한 배지)의 최종 부피로 1.7 ×^{10 5} 집락 형성 단위(CFU)/mL의 현탁액으로 성장시킵니다.
   참고: 오염된 유기체가 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 박테리아를 Middlebrook 7H10 고체 배지에 접종하여 집락 형태를 결정하고 M. paratuberculosis에 대한 기존 중합효소 연쇄 반응(PCR) 검출 키트로 순도를 확인해야 합니다.
3. 박테리아 현탁액을 70°C에서 5-10분 동안 비활성화하고 3,000× g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 칭량된 펠릿을 PBS로 2회 세척하고, 초음파 처리에 의해 파쇄하고, -20°C에서 보관하였다.
4. 펠렛을 멸균 용기에 옮기고 드라이 아이스 또는 액체 질소로 동결시킵니다. 즉시 동결 건조 챔버로 옮깁니다.
5. 동결 건조(진공 상태에서 -50°C에서 4시간) 기계 설명서에 따른 M. paratuberculosis.
6. 동결건조가 끝나면 동결건조기에서 스테인리스 스틸 용기를 꺼내 바이오 클리닝 벤치로 옮깁니다. 스테인리스 스틸 주걱을 사용하여 스테인리스 스틸 용기의 내벽에 부착된 건조된 MAP 덩어리를 제거하고 가능한 한 곱게 분쇄합니다.
7. 전자 저울을 사용하여 분쇄된 세포의 무게를 측정하고 10mg/mL 농도의 무균 10mL 바이알에 수동으로 넣습니다.
   참고: 세포 밀도는 샘플 리터당 건조 중량의 그램으로 정량화되었습니다. 3주 후, 박테리아 세포 펠릿 1mg(습윤 중량)에는 약 2.5 × 10⁸ CFU가 함유되어 있습니다.

3. MOG _35-55 에멀젼의 제조

1. 건조된 M. paratuberculosis (10mg) 한 바이알의 내용물을 모르타르와 유봉으로 미세 분말로 분쇄하고 불완전한 프로인트 보조제에 10mL를 첨가하여 10mg/mL 원액을 얻습니다. -4 °C에서 보관하십시오.
2. 예방 접종 전에 원액을 최종 농도 4mg/mL로 희석하십시오.
3. 펩티드 MOG_35-55 를 ddH 2O에 2mg/mL의 최종 농도로 희석하고 -₂₀°C에서 보관합니다.
4. 균질기를 사용하여 걸쭉한 에멀젼이 형성될 때까지_35-55 용액(2mg/mL)을 4단계의 동일한 부피의 보조제(3.2mg/mL)와 5mL 튜브에 혼합합니다. 10초마다 혼합한 후 용액을 얼음 위에 20초 동안 놓고 튜브를 돌려 모든 용액을 회수합니다.
5. 에멀젼을 1mL 주사기에 옮기고 모든 공기를 제거한 다음 27G 바늘을 추가합니다. 이제 에멀젼을 주입 할 준비가되었습니다.
   메모. 준비 과정에서 MOG_35-55 의 점성 에멀젼이 약간 손실되기 때문에 필요한 양의 1.5 배를 준비하는 것이 가장 좋습니다.

4. 동물 예방 접종

1. 동물에 대한 스트레스를 최소화하기 위해 이소플루란을 흡입하여 동물을 마취합니다.
2. 에멀젼(MOG_35-55의 마우스 200μg당 200μg을 포함하는 200μL)을 허리에 피하 주사합니다.
3. 예방 접종 후 0일과 2일에 백일해 독소(200ng/마우스 함유 100μL)를 복강 내 투여합니다.
   주의: 백일해 독소는 면역 체계에 다중 억제 효과가 있습니다. 섭취 및 눈과 피부와의 접촉을 피하십시오.

5. 임상 평가

1. 체중과 임상 징후에 대해 매일 마우스를 모니터링하십시오. 다음 점수 시스템을 사용하십시오: 0 = 임상 징후 없음; 1 = 흐릿한 꼬리; 2 = 오른쪽 반사의 손상 및 뒷다리의 약점; 3 = 뒷다리의 완전한 마비; 4 = 앞다리의 부분 마비와 함께 뒷다리의 완전한 마비; 5 = 빈사 상태.
   참고: 임상 징후가 처음 관찰되면 동물에게 물과 음식에 대한 접근성이 높아집니다. 설치류 차우를 부드럽게하고 축축하게한 다음 음식 호퍼에서 케이지 바닥에 놓습니다. 탈수 된 동물의 경우, 피하 수액 보충이 투여되거나 설치류 차우 슬러리가 경구 위관 영양을 통해 투여됩니다. 쥐가 3일 이상 이러한 유형의 도움이 필요한 경우 안락사가 수행됩니다.
2. 동물의 고통과 고통을 피하거나 최소화하려면 체중 감소 20% 이상, 임상 점수 ≥4.0, 점수 3에서 교정 반사 부재, 동물이 24시간 동안 사료나 물에 접근할 수 없는 경우와 같은 인간 종점을 사용하십시오.
   참고: 마우스를 EAE 유도 후 30일째에 펜토바르비탈(≥150 mg/kg)의 복강내 주사에 의해 안락사시켰다.

결과

C57BL/6 마우스 그룹(총 n = 15/그룹)을 M. paratuberculosis를 포함하는 에멀젼에서 또는 CFA를 사용한 일반적인 방법으로 MOG_35-55로 면역화했습니다. 모든 그룹의 마우스는 14-17 일에 관찰 된 단일 피크의 장애를 특징으로하는 급성 단상 질환을 나타 냈으며, 이후 10 일 동안 증상이 부분적으로 회복되었습니다 (그림 1A). 성별에 관계없이 M. parat...

토론

본 발명자들은 M. paratuberculosis¹⁰을 함유하는 보조제에서 에멀젼화된 펩티드 MOG_35-55를 사용하여 C57BL/6J 마우스에서 중증 EAE를 능동적으로 유도하는 강력한 대안 프로토콜을 입증하였다. 이 방법에 의한 EAE의 유도는 CFA와의 일반적인 프로토콜에 의해 유도된 것보다 더 심각한 질환을 초래하였다. 이 차이는 마이코박테리아¹¹의 세포벽에 있는 다른 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-mouse CD115 antibody	Biolegend, USA	135505	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody	Biolegend, USA	101215	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody	Biolegend, USA	117313	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody	Biolegend, USA	101302	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody	Biolegend, USA	116004	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody	Biolegend, USA	100753	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend, USA	107635	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody	Biolegend, USA	128023	for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice	Charles River Laboratory, Japan		3 weeks old, male and female
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine	Eyela, Tokyo, Japan	FDU-1200	for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant	Difco Laboratories, MD, USA	263810	for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	for use in adjuvant
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution	Fujifilm Wako, Osaka Japan	168-22471	From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100	Kinematica		for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine	Gibco Life Techologies, USA	11875093	For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, USA	423105	cytofluorimetry, for cell viability