Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем альтернативный протокол для активной индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей C57BL / 6 с использованием иммуногенного эпитопа миелина олигодендроцитарного гликопротеина (MOG) 35-55, суспендированного в неполном адъюванте Фройнда, содержащем убитый теплом подвид Mycobacterium avium paratuberculosis.

Аннотация

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), индуцированный гликопротеином миелина олигодендроцитов (МОГ), требует иммунизации пептидом МОГ, эмульгированным в полном адъюванте Фройнда (CFA), содержащем инактивированную Mycobacterium tuberculosis. Антигенные компоненты микобактерий активируют дендритные клетки, чтобы стимулировать Т-клетки к продуцированию цитокинов, которые способствуют ответу Th1 через толл-подобные рецепторы. Таким образом, количество и виды микобактерий, присутствующих во время антигенного вызова, напрямую связаны с развитием ЭАЭ. В этой статье представлен альтернативный протокол для индукции EAE у мышей C57BL / 6 с использованием модифицированного неполного адъюванта Фройнда, содержащего убитый теплом штамм паратуберкулеза подвида Mycobacterium avium K-10.

M. paratuberculosis, член комплекса Mycobacterium avium, является возбудителем болезни Йоне у жвачных животных и был идентифицирован как фактор риска нескольких заболеваний, опосредованных Т-клетками человека, включая рассеянный склероз. В целом, мыши, иммунизированные Mycobacterium paratuberculosis, показали более раннее начало и большую тяжесть заболевания, чем мыши, иммунизированные CFA, содержащим штамм M. tuberculosis H37Ra в тех же дозах 4 мг / мл. Антигенные детерминанты штамма К-10 подвида Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) смогли индуцировать сильный клеточный ответ Th1 во время эффекторной фазы, характеризующейся значительно большим количеством Т-лимфоцитов (CD4+ CD27+), дендритных клеток (CD11c+ I-A/I-E+) и моноцитов (CD11b+ CD115+) в селезенке по сравнению с мышами, иммунизированными CFA. Кроме того, пролиферативный ответ Т-клеток на пептид MOG, по-видимому, был самым высоким у мышей, иммунизированных M. paratuberculosis. Использование энцефалитогена (например, MOG35-55), эмульгированного в адъюванте, содержащем M. paratuberculosis в составе, может быть альтернативным и валидированным методом активации дендритных клеток для праймирования миелиновых эпитоп-специфических CD4+ Т-клеток во время индукционной фазы EAE.

Введение

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является общей моделью для изучения демиелинизирующих расстройств человека1. Существует несколько моделей ЭАЭ: активная иммунизация с использованием различных пептидов миелина в сочетании с сильнодействующими адъювантами, пассивная иммунизация путем переноса in vitro миелин-специфических CD4+ лимфоцитов и трансгенные модели спонтанного ЭАЭ2. Каждая из этих моделей имеет специфические особенности, которые позволяют изучать различные аспекты ЭАЭ, такие как начало, эффекторная фаза или хроническая фаза. Модель гликопротеина миелиновых олигодендроцитов (....

протокол

Все эксперименты на мышах были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинской школы Университета Хунтендо (номер одобрения 290238) и проводились в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения по экспериментам на животных.

1. Общие замечания к эксперименту

  1. Размещайте мышей в отдельных клетках на животноводческом предприятии в контролируемых условиях, свободных от патогенов, при температуре 23 °C ± 2 °C при влажности 50% ± 10% и 12-часовом цикле свет/темнота с свободным доступом к пище и воде.
  2. Вводите мышам фосфатно-буферный физио....

Результаты

Группы мышей C57BL/6 (всего n = 15/группа) иммунизировали MOG35-55 в эмульсии, содержащей M. paratuberculosis, или обычным методом с CFA. Во всех группах мышей проявлялось острое монофазное заболевание, характеризующееся единичным пиком инвалидности, наблюдаемым через 14-17 дней, .......

Обсуждение

Мы продемонстрировали надежный альтернативный протокол для активной индукции тяжелой ЭАЭ у мышей C57BL/6J с использованием пептида MOG35-55 , эмульгированного в адъюванте, содержащем M. paratuberculosis10. Индукция ЭАЭ этим методом привела к более тяжелому заболеванию, чем то, к.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Благодарности

Эта работа получила поддержку за счет гранта Японского общества содействия науке (грант No JP 23K14675).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-mouse CD115 antibodyBiolegend, USA135505for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibodyBiolegend, USA101215for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibodyBiolegend, USA117313for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibodyBiolegend, USA101302for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibodyBiolegend, USA116004for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibodyBiolegend, USA100753for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibodyBiolegend, USA107635for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibodyBiolegend, USA128023for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC EnrichmentThermo Fisher Scientific, USABD 211886for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J miceCharles River Laboratory, Japan3 weeks old, male and female
FBS 10279-106Gibco Life Techologies, USA42F9155Kfor cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machineEyela, Tokyo, JapanFDU-1200for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvantDifco Laboratories, MD, USA263810for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 BrothDifco Laboratories, MD, USA90003-876help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10ATCC, USABAA-968bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, DesiccatedBD Biosciences, USA743-26880-EAfor use in adjuvant
Mycobactin JAllied Laboratory, MO, USAgrowth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55AnaSpec, USAAS-60130-10encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264)Sigma-Aldrich, USAS7951-1MGnegative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solutionFujifilm Wako, Osaka Japan168-22471From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100Kinematicafor mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamineGibco Life Techologies, USA11875093For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCiPerkinElmer, Waltham, MA, USANET027W001MCfor proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability KitBiolegend, USA423105 cytofluorimetry, for cell viability

Ссылки

  1. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
  2. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE195Mycobacterium avium subspC57BL 6J

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены