Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Otoantijenlerin İmmünojenitesinin Arttırılmasında Mycobacterium Paratuberculosis'in Adjuvan Aktivitesi

Özet

Burada, C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti aktif olarak indüklemek için alternatif bir protokol sunuyoruz, ısıyla öldürülen Mycobacterium avium alt türü paratüberkülozu içeren tamamlanmamış Freund adjuvanında asılı duran immünojenik epitop miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG)_35-55'i kullanıyoruz.

Özet

Miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) tarafından indüklenen deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), inaktive Mycobacterium tuberculosis içeren tam Freund adjuvanında (CFA) emülsifiye edilmiş bir MOG peptid ile bağışıklamayı gerektirir. Mikobakterinin antijenik bileşenleri, T hücrelerini ücretli benzeri reseptörler yoluyla Th1 yanıtını teşvik eden sitokinler üretmeye teşvik etmek için uyarmak için dendritik hücreleri aktive eder. Bu nedenle, antijenik mücadele sırasında mevcut olan mikobakterilerin miktarı ve türleri, EAE'nin gelişimi ile doğrudan ilişkilidir. Bu yöntem makalesi, C57BL/6 farelerde EAE'yi, ısıyla öldürülen Mycobacterium avium alt türleri paratuberculosis suşu K-10'u içeren modifiye edilmiş tamamlanmamış bir Freund adjuvanını kullanarak indüklemek için alternatif bir protokol sunmaktadır.

Mycobacterium avium kompleksinin bir üyesi olan M. paratuberculosis, ruminantlarda Johne hastalığının etken maddesidir ve multipl skleroz da dahil olmak üzere çeşitli insan T hücresi aracılı bozukluklar için bir risk faktörü olarak tanımlanmıştır. Genel olarak, Mycobacterium paratuberculosis ile aşılanan fareler, aynı dozlarda 4 mg / mL'lik M. tuberculosis H37Ra suşunu içeren CFA ile aşılanmış farelerden daha erken başlangıçlı ve daha büyük hastalık şiddeti göstermiştir. Mycobacterium avium alt türleri paratuberculosis (MAP) suşu K-10'un antijenik belirleyicileri, efektör faz sırasında, anlamlı derecede daha yüksek sayıda T-lenfosit (CD4 + CD27 +), dendritik hücreler (CD11c + I-A / ^{I-E +}) ve monositler (CD11b + CD115 ⁺ ile karakterize edilen) güçlü bir Th1 hücresel yanıtını indükleyebilmiştir) dalakta CFA ile aşılanmış farelere kıyasla. Ayrıca, MOG peptidine proliferatif T hücresi yanıtı, M. paratuberculosis ile bağışıklanmış farelerde en yüksek olduğu görülmüştür. Formülasyonda M. paratuberculosis içeren bir adjuvanda emülsifiye edilmiş bir ensefalitojenin (örneğin, MOG_35-55) kullanılması, EAE'nin indüksiyon fazı sırasında miyelin epitopuna özgü CD4 ⁺ T hücrelerini hazırlamak için dendritik hücreleri aktive etmek için alternatif ve doğrulanmış bir yöntem olabilir.

Giriş

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan demiyelinizan bozukluklarının incelenmesi için yaygın bir modeldir¹. EAE'nin birkaç modeli vardır: güçlü adjuvanlarla kombinasyon halinde farklı miyelin peptitleri kullanılarak aktif immünizasyon, miyeline özgü CD4 ⁺ lenfositlerin in vitro transferi ile pasif immünizasyon ve spontan EAE^2'nin transgenik modelleri. Bu modellerin her biri, EAE'nin başlangıç, efektör fazı veya kronik faz gibi farklı yönlerinin incelenmesine izin veren belirli özelliklere sahiptir. EAE'nin miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) modeli, mononükleer inflamatuar infiltrasyon, periferik beyaz cevherde demiyelinizasyon ve^{hastalık zirvesinden} sonra iyileşmenin azalması ile karakterize olduğu için kronik nöroinflamasyon ve demiyelinasyonun immün aracılı mekanizmalarını incelemek için iyi bir modeldir.

MOG-EAE, duyarlı farelerin tam Freund adjuvanında (CFA) MOG_35-55 peptidi ile bağışıklanması ve ardından boğmaca toksininin intraperitoneal enjeksiyonu ile indüklenir. Bu, kan-beyin bariyerinin geçirgenliğini arttırır ve çevrede aktive olan miyeline özgü T hücrelerinin, yeniden aktive edilecekleri merkezi sinir sistemine (CNS) ulaşmasını sağlar³. CFA, antijen sunan hücreler tarafından antijen alımını ve humoral ve hücre aracılı yanıtlarla ilişkili sitokinlerin ekspresyonunu artırarak EAE'nin indüksiyonunda anahtar rol oynar⁴. Bu mekanizma esas olarak, bileşenleri bağışıklık sistemi için güçlü bir uyaran sağlayan yağda emülsifiye edilmiş öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis'in varlığından kaynaklanmaktadır⁵. Aslında, EAE'nin indüksiyonu, antijenik meydan okuma⁶ sırasında mevcut olan mikobakteri miktarı ile doğrudan ilişkilidir.

Freund'un tamamlanmamış adjuvan^7'sine Mycobacterium butyricum gibi diğer öldürülmüş mikobakterilerin eklenmesi ve adjuvan kombinasyonlarının^{etkisi 8}, EAE'nin klinik seyrini modüle edebilir ve sonuç olarak sonuçların tekrarlanabilirliğini etkileyebilir. Ruminantlarda Johne hastalığının etiyolojik ajanı olan Mycobacterium avium alt türleri paratuberculosis (MAP), antijenik bileşenleri multipl skleroz ve nöromiyelit optika spektrum bozukluğu 9 olan hastalarda güçlü bir humoral ve hücre aracılı yanıt ortaya çıkarabildiğinden, insan CNS^9'un enflamatuar bozuklukları ile ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, bu protokolde, CFA'daki M. tuberculosis'i M. paratuberculosis ile değiştirerek MOG-EAE'yi indüklemek için alternatif ve tekrarlanabilir bir yöntem göstermekteyiz.

Protokol

Tüm fare deneyleri, Juntendo Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Onay Numarası 290238) tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Hayvan Deneyleri Kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Deney hakkında genel yorumlar

1. Fareleri, hayvan tesisindeki bireysel kafeslerde, 23 ° C ± 2 ° C'de% 50 ve% 10 nem ile% 50 ± 2 ° C'de kontrollü, patojen içermeyen koşullar altında ve yiyecek ve suya ad libitum erişimi ile 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde barındırın.
2. Farelere antijen ve CFA içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) enjekte edin ve bunları sırasıyla negatif ve pozitif kontroller olarak kullanın.

2. Mikobakteriyel antijenlerin hazırlanması

1. M. paratuberculosis K-10 suşunu, 37 ° C'de T25 doku kültürü şişelerinde 2 hafta boyunca% 10 OADC (oleik asit, albümin, dekstroz, katalaz)% 0.005 Tween 80 ve 2 mg / L mikobaktin J ile zenginleştirilmiş Middlebrook sıvı ortamı 7H9'da büyütün. Koloni büyümesini görsel inceleme ile düzenli olarak değerlendirin.
   DİKKAT: M. paratuberculosis'i bir Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) tesisinde kullanın.
2. Zenginleştirme kültürünü, 500 mL Erlenmeyer şişesini, 1.7 × 10⁵ koloni oluşturan birim (CFU) / mL'lik bir süspansiyonla, 200 mL'lik son hacimde (adım 2.1 ile aynı ortamda) 1 hafta boyunca çalkalayan bir inkübatörde büyütün.
   NOT: Kirletici organizmalar sonuçları etkileyebileceğinden, koloni morfolojisini belirlemek ve M. paratuberculosis için geleneksel polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tespit kitleri ile saflığı doğrulamak için bakteriler Middlebrook 7H10 katı ortamına aşılanmalıdır.
3. Bakteriyel süspansiyonları 70 ° C'de 5-10 dakika boyunca etkisiz hale getirin ve 10 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüj yapın. Tartılan pelet PBS'de iki kez yıkanır, sonikasyonla bozulur ve -20 ° C'de saklanır.
4. Pelet steril bir kaba aktarın ve kuru buz veya sıvı azotla dondurun. Hemen bir dondurarak kurutma odasına aktarın.
5. Dondurarak kurutma (vakum altında -50 °C'de 4 saat) M. paratuberculosis , makine kılavuzuna göre.
6. Liyofilizasyonun sonunda, paslanmaz çelik kabı dondurarak kurutucudan çıkarın ve bir biyo-temizleme tezgahına aktarın. Paslanmaz çelik kabın iç duvarına yapışan kurutulmuş MAP topaklarını yerinden çıkarmak ve mümkün olduğunca ince bir şekilde toz haline getirmek için paslanmaz çelik bir spatula kullanın.
7. Toz haline getirilmiş hücreleri elektronik bir terazi kullanarak tartın ve manuel olarak 10 mg/mL konsantrasyonda aseptik 10 mL'lik bir şişeye yerleştirin.
   NOT: Hücre yoğunluğu, numunenin litresi başına kuru ağırlık gramı olarak ölçülmüştür. 3 hafta sonra, 1 mg (ıslak ağırlık) bakteri hücresi peleti yaklaşık 2.5 × 10⁸ CFU içerir.

3. MOG _35-55 emülsiyonunun hazırlanması

1. Bir şişe kurutulmuş M. paratuberculosis'in (10 mg) içeriğini bir harç ve havaneli ince bir toza öğütün ve 10 mg / mL stok çözeltisi elde etmek için eksik Freund'un adjuvanına 10 mL ekleyin. -4 °C'de saklayın.
2. Bağışıklamadan önce, stok çözeltisini 4 mg / mL'lik bir son konsantrasyona seyreltin.
3. Peptid MOG_{35-55'i ddH2}O içinde 2 mg / mL'lik bir son konsantrasyona kadar seyreltin ve -20 ° C'de saklayın.
4. Bir homojenizatör kullanarak, MOG_35-55 çözeltisini (2 mg/mL), adım 3.2'den itibaren 5 mL'lik bir tüpte kalın bir emülsiyon oluşana kadar eşit hacimde adjuvan (4 mg/mL) ile karıştırın. Her 10 sn karıştırmadan sonra, çözeltiyi 20 s boyunca buz üzerine yerleştirin ve tüm çözeltiyi geri kazanmak için tüpü döndürün.
5. Emülsiyonu 1 mL'lik bir şırıngaya aktarın, tüm havayı çıkarın ve 27 G'lik bir iğne ekleyin. Emülsiyon artık enjeksiyon için hazırdır.
   NOT. MOG_35-55'in viskoz emülsiyonunun bir miktar kaybı hazırlık sırasında meydana geldiğinden, ihtiyaç duyulan miktarın 1.5 katını hazırlamak en iyisidir.

4. Hayvan bağışıklaması

1. Hayvanlar üzerindeki stresi en aza indirmek için izofluran soluyarak hayvanları uyuşturun.
2. Emülsiyonu (200 μg / MOG_35-55 fare içeren 200 μL) deri altından alt sırta enjekte edin.
3. Bağışıklamadan sonraki 0. ve 2. günlerde intraperitoneal olarak boğmaca toksini (200 ng / fare içeren 100 μL) uygulayın.
   DİKKAT: Boğmaca toksini bağışıklık sistemi üzerinde çoklu baskılayıcı etkiye sahiptir; Yutulmaktan ve gözlerle ve ciltle temastan kaçının.

5. Klinik değerlendirme

1. Fareleri kilo ve klinik belirtiler için günlük olarak izleyin. Aşağıdaki puanlama sistemini kullanın: 0 = klinik belirti yok; 1 = sarkık kuyruk; 2 = sağ refleksin bozulması ve arka bacakların zayıflığı; 3 = arka bacakların tam felci; 4 = ön ayakların kısmi felci ile arka bacakların tam felci; 5 = can çekişiyor.
   NOT: Klinik bulguların ilk gözlemi üzerine, hayvanlara suya ve yiyeceğe daha fazla erişim sağlanır. Kemirgen chow yumuşatılır ve nemlendirilir, daha sonra yiyecek haznesinden kafes zeminine yerleştirilir. Susuz kalan hayvanlar söz konusu olduğunda, deri altı sıvı takviyesi uygulanır veya oral gavaj yoluyla bir kemirgen chow bulamacı verilir. Bir fare 3 günden fazla bir süre boyunca bu tür bir yardıma ihtiyaç duyarsa, ötenazi yapılacaktır.
2. Hayvan ağrısını ve sıkıntısını önlemek veya en aza indirmek için aşağıdaki insan uç noktalarını kullanın: vücut ağırlığı kaybı% 20'den fazla, klinik skor ≥ 4.0, skor 3'te doğru refleksin yokluğu ve hayvan 24 saat boyunca yem veya suya erişemediğinde.
   NOT: Fareler, EAE indüksiyonundan sonraki 30. günde intraperitoneal pentobarbital (≥150 mg / kg) enjeksiyonları ile ötenazi yapıldı.

Sonuçlar

C57BL/6 fare grupları (toplam n = 15/grup), M. paratuberculosis içeren bir emülsiyonda MOG_35-55 ile veya CFA ile ortak yöntemle aşılandı. Tüm fare grupları, 14-17 günde gözlenen tek bir sakatlık zirvesi ile karakterize akut monofazik bir hastalık gösterdi ve bunu takip eden 10 gün içinde semptomların kısmi iyileşmesi izledi (Şekil 1A). M. paratuberculosis içeren adjuvan ile aşılanan fareler, cinsiyetten bağ...

Tartışmalar

M. paratuberculosis¹⁰ içeren bir adjuvanda emülsifiye edilmiş MOG_35-55 peptidi kullanarak C57BL / 6J farelerde şiddetli EAE'yi aktif olarak indüklemek için sağlam bir alternatif protokol gösterdik. EAE'nin bu yöntemle indüklenmesi, CFA ile ortak protokolün neden olduğundan daha ciddi bir hastalığa neden oldu. Bu fark, mikobakterilerin hücre duvarındaki farklı lipid bileşenlerinden kaynaklanıyor olabilir¹¹. Aslında, diğer mikobakteril...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-mouse CD115 antibody	Biolegend, USA	135505	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody	Biolegend, USA	101215	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody	Biolegend, USA	117313	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody	Biolegend, USA	101302	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody	Biolegend, USA	116004	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody	Biolegend, USA	100753	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend, USA	107635	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody	Biolegend, USA	128023	for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice	Charles River Laboratory, Japan		3 weeks old, male and female
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine	Eyela, Tokyo, Japan	FDU-1200	for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant	Difco Laboratories, MD, USA	263810	for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	for use in adjuvant
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution	Fujifilm Wako, Osaka Japan	168-22471	From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100	Kinematica		for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine	Gibco Life Techologies, USA	11875093	For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, USA	423105	cytofluorimetry, for cell viability