Activité adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis dans l’amélioration de l’immunogénicité des autoantigènes au cours de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Résumé

Ici, nous présentons un protocole alternatif pour induire activement l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale chez les souris C57BL / 6, en utilisant l’épitope immunogène myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG)_35-55 en suspension dans l’adjuvant de Freund incomplet contenant la sous-espèce paratuberculose de Mycobacterium avium tuée par la chaleur.

Résumé

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) induite par la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) nécessite une immunisation par un peptide MOG émulsionné dans un adjuvant de Freund complet (CFA) contenant Mycobacterium tuberculosis. Les composants antigéniques de la mycobactérie activent les cellules dendritiques pour stimuler les cellules T à produire des cytokines qui favorisent la réponse Th1 via des récepteurs de type Toll. Par conséquent, la quantité et les espèces de mycobactéries présentes lors de la provocation antigénique sont directement liées au développement de l’EAE. Cet article sur les méthodes présente un protocole alternatif pour induire l’EAE chez les souris C57BL/6 à l’aide d’un adjuvant de Freund incomplet modifié contenant la souche K-10 de la sous-espèce Paratuberculosis de Mycobacterium avium tuée par la chaleur.

M. paratuberculosis, membre du complexe Mycobacterium avium, est l’agent causal de la paratuberculose chez les ruminants et a été identifié comme un facteur de risque de plusieurs troubles induits par les lymphocytes T humains, y compris la sclérose en plaques. Dans l’ensemble, les souris immunisées avec Mycobacterium paratuberculosis ont montré une apparition plus précoce et une plus grande gravité de la maladie que les souris immunisées avec CFA contenant la souche H37Ra de M. tuberculosis aux mêmes doses de 4 mg/mL. Les déterminants antigéniques de la souche K-10 de la sous-espèce paratuberculeuse de Mycobacterium avium ont pu induire une forte réponse cellulaire Th1 pendant la phase effectrice, caractérisée par un nombre significativement plus élevé de lymphocytes T (CD4+ CD27+), de cellules dendritiques (CD11c+ I-A/I-E+) et de monocytes (CD11b+ CD115⁺) dans la rate comparativement aux souris immunisées par le CFA. De plus, la réponse proliférative des lymphocytes T au peptide MOG semblait être la plus élevée chez les souris immunisées contre M. paratuberculosis. L’utilisation d’un encéphalitogène (p. ex. MOG_35-55) émulsionné dans un adjuvant contenant M. paratuberculosis dans la formulation peut être une méthode alternative et validée pour activer les cellules dendritiques pour amorcer les lymphocytes T CD4⁺ spécifiques de l’épitope de myéline pendant la phase d’induction de l’EAE.

Introduction

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle commun pour l’étude des troubles démyélinisants humains¹. Il existe plusieurs modèles d’EAE : immunisation active à l’aide de différents peptides de myéline en combinaison avec des adjuvants puissants, immunisation passive par transfert in vitro de lymphocytes CD4⁺ spécifiques de la myéline et modèles transgéniques d’EAE² spontanée. Chacun de ces modèles présente des caractéristiques spécifiques qui permettent d’étudier différents aspects de l’EAE, tels que l’apparition, la phase effectrice ou la phase chronique. Le modèle de glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) de l’EAE est un bon modèle pour étudier les mécanismes à médiation immunitaire de la neuroinflammation chronique et de la démyélinisation, car il est caractérisé par une infiltration inflammatoire mononucléaire, une démyélinisation dans la substance blanche périphérique et une récupération réduite après le pic de la maladie¹.

Le MOG-EAE est induit par l’immunisation de souris sensibles avec le peptide MOG_35-55 dans l’adjuvant de Freund complet (CFA), suivie d’une injection intrapéritonéale de toxine coqueluche. Cela augmente la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique et permet aux lymphocytes T spécifiques à la myéline activés à la périphérie d’atteindre le système nerveux central (SNC), où ils seront réactivés³. La CFA joue un rôle clé dans l’induction de l’EAE en améliorant l’absorption de l’antigène par les cellules présentatrices d’antigènes et l’expression des cytokines liées aux réponses humorales et à médiation cellulaire⁴. Ce mécanisme est principalement dû à la présence de Mycobacterium tuberculosis tué émulsionné dans l’huile, dont les composants fournissent un puissant stimulant pour le système immunitaire⁵. En fait, l’induction de l’EAE est directement liée à la quantité de mycobactérie présente lors du défi antigénique⁶.

L’ajout d’autres mycobactéries tuées, telles que Mycobacterium butyricum, à l’adjuvant de Freund^{incomplet 7}, ainsi que l’effet des combinaisons adjuvantes⁸, peuvent moduler l’évolution clinique de l’EAE et par conséquent influencer la reproductibilité des résultats. Mycobacterium avium sous-espèce paratuberculosis (MAP), l’agent étiologique de la paratuberculose chez les ruminants, a été associé à des troubles inflammatoires du SNC humain 9, car ses composants antigéniques sont capables de provoquer une forte réponse humorale et cellulaire chez les patients atteints de sclérose en plaques et de troubles du spectre de la neuromyélite optique⁹. Par conséquent, dans ce protocole, nous montrons une méthode alternative et reproductible pour induire MOG-EAE en remplaçant M. tuberculosis dans CFA par M. paratuberculosis.

Protocole

Toutes les expériences sur les souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine de l’Université Juntendo (numéro d’approbation 290238) et ont été menées conformément aux directives des National Institutes of Health pour l’expérimentation animale.

1. Observations générales sur l’expérience

1. Hébergez les souris dans des cages individuelles dans l’animalerie dans des conditions contrôlées et exemptes d’agents pathogènes à 23 °C ± 2 °C avec 50 % ± 10 % d’humidité, et un cycle lumière/obscurité de 12 h avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau.
2. Injectez aux souris une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans antigène ni CFA, et utilisez-les comme témoins négatifs et positifs, respectivement.

2. Préparation des antigènes mycobactériens

1. Cultiver la souche K-10 de M. paratuberculosis dans le milieu liquide 7H9 de Middlebrook enrichi de 10 % d’OADC (acide oléique, albumine, dextrose, catalase), de 0,005 % de Tween 80 et de 2 mg/L de mycobactine J pendant 2 semaines dans des flacons de culture tissulaire T25 à 37 °C. Évaluer régulièrement la croissance de la colonie par inspection visuelle.
   MISE EN GARDE : Manipuler M. paratuberculosis dans une installation de niveau de biosécurité 2 (BSL-2).
2. Cultiver la culture d’enrichissement dans une fiole d’erlenmeyer de 500 mL avec une suspension de 1,7 × 10⁵ unités formant colonies (UFC)/mL dans un volume final de 200 mL (même milieu que l’étape 2.1) dans un incubateur à agiter pendant 1 semaine.
   REMARQUE : Comme les organismes contaminants peuvent affecter les résultats, les bactéries doivent être inoculées sur un milieu solide Middlebrook 7H10 pour déterminer la morphologie de la colonie et vérifier la pureté par des trousses de détection conventionnelles de réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour M. paratuberculosis.
3. Inactiver les suspensions bactériennes pendant 5-10 min à 70 °C et centrifuger à 3 000 × g pendant 10 min. Lavez deux fois la pastille pesée dans du PBS, perturbez-la par sonication et stockez-la à -20 °C.
4. Transférer la pastille dans un récipient stérile et la congeler avec de la glace sèche ou de l’azote liquide. Transférer immédiatement dans une chambre de lyophilisation.
5. Lyophiliser (4 h à -50 °C sous vide) M. paratuberculosis selon le manuel de la machine.
6. À la fin de la lyophilisation, retirez le récipient en acier inoxydable du lyophilisateur et transférez-le sur un banc de nettoyage biologique. Utilisez une spatule en acier inoxydable pour déloger les morceaux de MAP séchés adhérant à la paroi intérieure du contenant en acier inoxydable et pulvérisez-les aussi finement que possible.
7. Peser les cellules pulvérisées à l’aide d’une balance électronique et les placer manuellement dans un flacon aseptique de 10 mL à une concentration de 10 mg/mL.
   NOTE: La densité cellulaire a été quantifiée en grammes de poids sec par litre d’échantillon. Après 3 semaines, 1 mg (poids humide) de pastille cellulaire bactérienne contient environ 2,5 × 10⁸ UFC.

3. Préparation de l’émulsion MOG _35-55

1. Broyer le contenu d’un flacon de M. paratuberculosis séché (10 mg) en poudre fine avec un mortier et un pilon et ajouter 10 mL à l’adjuvant de Freund incomplet pour obtenir une solution mère de 10 mg/mL. Conserver à -4 °C.
2. Avant l’immunisation, diluer la solution mère jusqu’à une concentration finale de 4 mg/mL.
3. Diluer le peptide MOG_35-55 dans du_ddH2Ojusqu’à obtention d’une concentration finale de 2 mg/mL et conserver à -20 °C.
4. À l’aide d’un homogénéisateur, mélanger la solution MOG_35-55 (2 mg/mL) avec un volume égal d’adjuvant (4 mg/mL) de l’étape 3.2 dans un tube de 5 mL jusqu’à formation d’une émulsion épaisse. Toutes les 10 s de mélange, placer la solution sur de la glace pendant 20 s et faire tourner le tube pour récupérer toute la solution.
5. Transférer l’émulsion dans une seringue de 1 mL, retirer tout l’air et ajouter une aiguille de 27 G. L’émulsion est maintenant prête pour l’injection.
   NOTE. Étant donné qu’une certaine perte de l’émulsion visqueuse de MOG_35-55 se produit pendant la préparation, il est préférable de préparer 1,5 fois la quantité nécessaire.

4. Immunisation des animaux

1. Anesthésier les animaux par inhalation d’isoflurane afin de minimiser le stress sur les animaux.
2. Injecter l’émulsion (200 μL contenant 200 μg/souris de MOG_{35-55) par voie sous-cutanée} dans le bas du dos.
3. Administrer une dose de toxine anticoqueluche (100 μL contenant 200 ng/souris) par voie intrapéritonéale aux jours 0 et 2 suivant l’immunisation.
   ATTENTION : La toxine de la coqueluche a un effet suppresseur multiple sur le système immunitaire; Éviter l’ingestion et le contact avec les yeux et la peau.

5. Évaluation clinique

1. Surveillez quotidiennement le poids des souris et les signes cliniques. Utilisez le système de notation suivant : 0 = aucun signe clinique; 1 = queue flasque; 2 = altération du réflexe de redressement et faiblesse des membres postérieurs; 3 = paralysie complète des membres postérieurs; 4 = paralysie complète des membres postérieurs avec paralysie partielle des membres antérieurs; 5 = moribond.
   REMARQUE : Lors de l’observation initiale des signes cliniques, les animaux bénéficient d’un accès accru à l’eau et à la nourriture. Le chow de rongeurs est ramolli et humidifié, puis placé sur le sol de la cage à partir de la trémie de nourriture. Dans le cas des animaux déshydratés, une supplémentation en liquide sous-cutané est administrée ou une suspension de chow de rongeur est administrée par gavage oral. Si une souris a besoin de ce type d’assistance pendant plus de 3 jours, l’euthanasie sera effectuée.
2. Pour éviter ou minimiser la douleur et la détresse chez l’animal, utilisez les critères humains suivants : perte de poids corporel supérieure à 20 %, score clinique ≥4,0, absence du réflexe de redressement au score 3 et lorsque l’animal est incapable d’accéder à de la nourriture ou à de l’eau pendant 24 heures.
   NOTE: Les souris ont été euthanasiées le jour 30 après l’induction de l’EAE par injections intrapéritonéales de pentobarbital (≥150 mg / kg).

Résultats

Des groupes de souris C57BL/6 (n total = 15/groupe) ont été immunisés avec MOG_35-55 dans une émulsion contenant M. paratuberculosis ou par la méthode commune avec CFA. Tous les groupes de souris ont manifesté une maladie monophasique aiguë caractérisée par un seul pic d’incapacité observé à 14-17 jours, suivi d’une récupération partielle des symptômes au cours des 10 jours suivants (Figure 1A). Les souris immunisées ave...

Discussion

Nous avons démontré un protocole alternatif robuste pour induire activement une EAE sévère chez les souris C57BL/6J en utilisant le peptide MOG_35-55 émulsionné dans un adjuvant contenant M. paratuberculosis¹⁰. L’induction de l’EAE par cette méthode a entraîné une maladie plus sévère que celle induite par le protocole commun avec le CFA. Cette différence pourrait être due aux différents composants lipidiques dans la paroi cellulaire des mycobactéries

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-mouse CD115 antibody	Biolegend, USA	135505	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody	Biolegend, USA	101215	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody	Biolegend, USA	117313	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody	Biolegend, USA	101302	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody	Biolegend, USA	116004	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody	Biolegend, USA	100753	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend, USA	107635	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody	Biolegend, USA	128023	for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice	Charles River Laboratory, Japan		3 weeks old, male and female
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine	Eyela, Tokyo, Japan	FDU-1200	for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant	Difco Laboratories, MD, USA	263810	for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	for use in adjuvant
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution	Fujifilm Wako, Osaka Japan	168-22471	From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100	Kinematica		for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine	Gibco Life Techologies, USA	11875093	For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, USA	423105	cytofluorimetry, for cell viability