Actividad adyuvante de Mycobacterium paratuberculosis en la mejora de la inmunogenicidad de los autoantígenos durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo alternativo para inducir activamente encefalomielitis autoinmune experimental en ratones C57BL / 6, utilizando la glicoproteína oligodendrocitos de mielina inmunogénica epítopo (MOG) _35-55 suspendida en el adyuvante de Freund incompleto que contiene la subespecie paratuberculosis Mycobacterium avium muerta por calor.

Resumen

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inducida por la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) requiere la inmunización por un péptido MOG emulsionado en el adyuvante de Freund completo (CFA) que contiene Mycobacterium tuberculosis inactivada. Los componentes antigénicos de la micobacteria activan las células dendríticas para estimular a las células T a producir citoquinas que promueven la respuesta Th1 a través de receptores tipo toll. Por lo tanto, la cantidad y las especies de micobacterias presentes durante el desafío antigénico están directamente relacionadas con el desarrollo de EAE. Este documento de métodos presenta un protocolo alternativo para inducir EAE en ratones C57BL / 6 utilizando un adyuvante de Freund incompleto modificado que contiene la subespecie de paratuberculosis K-10 de Mycobacterium avium muerta por calor.

M. paratuberculosis, un miembro del complejo Mycobacterium avium, es el agente causal de la enfermedad de Johne en rumiantes y se ha identificado como un factor de riesgo para varios trastornos mediados por células T humanas, incluida la esclerosis múltiple. En general, los ratones inmunizados con Mycobacterium paratuberculosis mostraron un inicio más temprano y una mayor gravedad de la enfermedad que los ratones inmunizados con CFA que contenían la cepa de M. tuberculosis H37Ra a las mismas dosis de 4 mg / ml. Los determinantes antigénicos de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) cepa K-10 fueron capaces de inducir una fuerte respuesta celular Th1 durante la fase efectora, caracterizada por un número significativamente mayor de linfocitos T (CD4+ CD27+), células dendríticas (CD11c+ I-A/I-E+) y monocitos (CD11b+ CD115⁺) en el bazo en comparación con los ratones inmunizados con CFA. Además, la respuesta proliferativa de las células T al péptido MOG pareció ser más alta en ratones inmunizados con M. paratuberculosis. El uso de un encefalitógeno (por ejemplo, MOG_35-55) emulsionado en un adyuvante que contiene M. paratuberculosis en la formulación puede ser un método alternativo y validado para activar las células dendríticas para preparar las células T CD4⁺ específicas del epítopo de mielina durante la fase de inducción de la EAE.

Introducción

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo común para el estudio de los trastornos desmielinizantes humanos¹. Existen varios modelos de EAE: inmunización activa utilizando diferentes péptidos de mielina en combinación con potentes adyuvantes, inmunización pasiva mediante transferencia in vitro de linfocitos CD4⁺ específicos de mielina y modelos transgénicos de EAE² espontánea. Cada uno de estos modelos tiene características específicas que permiten estudiar diferentes aspectos de EAE, como el inicio, la fase efectora o la fase crónica. El modelo de glicoproteína oligodendrocitos de....

Protocolo

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Juntendo (Número de Aprobación 290238) y se llevaron a cabo de acuerdo con las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud para la Experimentación Animal.

1. Observaciones generales sobre el experimento

1. Alojar a los ratones en jaulas individuales en la instalación animal en condiciones controladas y libres de patógenos a 23 °C ± 2 °C con 50% ± 10% de humedad, y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso ad libitum a alimentos y agua.
2. Inye....

Discusión

Demostramos un protocolo alternativo robusto para inducir activamente EAE severa en ratones C57BL / 6J utilizando el péptido MOG_35-55 emulsionado en un adyuvante que contiene M. paratuberculosis¹⁰. La inducción de EAE por este método resultó en una enfermedad más grave que la inducida por el protocolo común con CFA. Esta diferencia podría deberse a los diferentes componentes lipídicos en la pared celular de las micobacterias¹¹. De hecho, a difere.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-mouse CD115 antibody	Biolegend, USA	135505	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody	Biolegend, USA	101215	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody	Biolegend, USA	117313	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody	Biolegend, USA	101302	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody	Biolegend, USA	116004	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody	Biolegend, USA	100753	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend, USA	107635	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody	Biolegend, USA	128023	for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice	Charles River Laboratory, Japan		3 weeks old, male and female
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine	Eyela, Tokyo, Japan	FDU-1200	for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant	Difco Laboratories, MD, USA	263810	for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	for use in adjuvant
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution	Fujifilm Wako, Osaka Japan	168-22471	From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100	Kinematica		for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine	Gibco Life Techologies, USA	11875093	For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, USA	423105	cytofluorimetry, for cell viability