Atividade Adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis no Aumento da Imunogenicidade de Autoantígenos Durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo alternativo para induzir ativamente encefalomielite autoimune experimental em camundongos C57BL/6, usando o epítopo imunogênico mielina oligodendrocyte glycoprotein (MOG)_35-55 suspenso em adjuvante de Freund incompleto contendo a subespécie paratuberculosis de Mycobacterium avium morta pelo calor.

Resumo

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) induzida pela glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) requer imunização por um peptídeo MOG emulsionado em adjuvante de Freund completo (CFA) contendo Mycobacterium tuberculosis inativado. Os componentes antigênicos da micobactéria ativam células dendríticas para estimular as células T a produzir citocinas que promovem a resposta Th1 via receptores toll-like. Portanto, a quantidade e a espécie de micobactérias presentes durante o desafio antigênico estão diretamente relacionadas ao desenvolvimento das EAE. Este trabalho de método apresenta um protocolo alternativo para induzir EAE em camundongos C57BL/6 usando um adjuvante de Freund incompleto modificado contendo a cepa K-10 da subespécie Paratuberculosis de Mycobacterium avium morta pelo calor.

M. paratuberculosis, membro do complexo Mycobacterium avium, é o agente causador da doença de Johne em ruminantes e tem sido identificado como um fator de risco para várias doenças mediadas por células T humanas, incluindo esclerose múltipla. Em geral, camundongos imunizados com Mycobacterium paratuberculosis apresentaram início mais precoce e maior gravidade da doença do que camundongos imunizados com CFA contendo a cepa H37Ra de M. tuberculosis nas mesmas doses de 4 mg/mL. Os determinantes antigênicos da cepa K-10 de Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir uma forte resposta celular Th1 durante a fase efetora, caracterizada por números significativamente maiores de linfócitos T (CD4+ CD27+), células dendríticas (CD11c+ I-A/I-E+) e monócitos (CD11b+ CD115⁺) no baço em comparação com camundongos imunizados com CFA. Além disso, a resposta proliferativa de células T ao peptídeo MOG pareceu ser maior em camundongos imunizados com M. paratuberculosis. O uso de um encefalitogênio (por exemplo, MOG_35-55) emulsionado em um adjuvante contendo M. paratuberculosis na formulação pode ser um método alternativo e validado para ativar células dendríticas para priming de células T CD4⁺ específicas para epítopos de mielina durante a fase de indução do EAE.

Introdução

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo comum para o estudo de doenças desmielinizantes humanas¹. Existem vários modelos de EAE: imunização ativa usando diferentes peptídeos de mielina em combinação com adjuvantes potentes, imunização passiva por transferência in vitro de linfócitos CD4⁺ específicos da mielina e modelos transgênicos de EAE² espontâneo. Cada um desses modelos possui características específicas que permitem o estudo de diferentes aspectos do EAE, como o início, a fase efetora ou a fase crônica. O modelo de glicoproteína de miodendrócitos (MOG) de EAE é um bom modelo para estudar os mecanismos imunomediados de neuroinflamação crônica e desmielinização, pois é caracterizado por infiltrado inflamatório mononuclear, desmielinização na substância branca periférica e recuperação reduzida após o pico da doença¹.

O MOG-EAEA é induzido pela imunização de camundongos suscetíveis com o peptídeo MOG_35-55 em adjuvante de Freund completo (CFA), seguido por uma injeção intraperitoneal de toxina pertussis. Isso aumenta a permeabilidade da barreira hematoencefálica e permite que as células T mielina-específicas ativadas na periferia cheguem ao sistema nervoso central (SNC), onde serão reativadas³. O CFA desempenha um papel fundamental na indução de EAE, aumentando a captação de antígenos pelas células apresentadoras de antígenos e a expressão de citocinas relacionadas a respostas humorais e mediadas por células⁴. Esse mecanismo deve-se principalmente à presença de Mycobacterium tuberculosis morto emulsionado em óleo, cujos componentes fornecem um forte estímulo para o sistema imune⁵. De fato, a indução de EAE está diretamente relacionada à quantidade de micobactéria presente durante o desafio^antigênico6.

A adição de outras micobactérias mortas, como Mycobacterium butyricum, ao adjuvante de Freund^incompleto7, bem como o efeito de combinações adjuvantes8, podem modular o curso clínico das EAE e, consequentemente, influenciar a reprodutibilidade dos resultados. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), agente etiológico da doença de John em ruminantes, tem sido associado a doenças inflamatórias do SNC humano⁹, uma vez que seus componentes antigênicos são capazes de provocar forte resposta humoral e celular em pacientes com esclerose múltipla^{e desordem} do espectro da neuromielite óptica9. Portanto, neste protocolo, mostramos um método alternativo e reprodutível para induzir MOG-EAE substituindo M. tuberculosis em CFA por M. paratuberculosis.

Protocolo

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Juntendo (Aprovação Número 290238) e foram conduzidos de acordo com as Diretrizes do National Institutes of Health para Experimentação Animal.

1. Observações gerais sobre a experiência

1. Alojar os camundongos em gaiolas individuais no biotério sob condições controladas e livres de patógenos a 23 °C ± 2 °C com 50% ± 10% de umidade e um ciclo claro/escuro de 12 h com acesso ad libitum a alimentos e água.
2. Injetar os camundongos com solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem antígeno e CFA, e usá-los como controles negativos e positivos, respectivamente.

2. Preparação de antígenos micobacterianos

1. Cultivar a cepa K-10 de M. paratuberculosis em meio líquido Middlebrook 7H9 enriquecido com 10% de OADC (ácido oleico, albumina, dextrose, catalase), 0,005% Tween 80 e 2 mg/L de micobactina J por 2 semanas em frascos de cultura de tecidos T25 a 37 °C. Avaliar o crescimento da colônia regularmente por inspeção visual.
   CUIDADO: Manusear M. paratuberculosis em uma instalação de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2).
2. Cultivar a cultura de enriquecimento em um frasco de Erlenmeyer de 500 mL com uma suspensão de 1,7 × 10⁵ unidades formadoras de colônias (UFC)/mL em um volume final de 200 mL (mesmo meio do passo 2.1) em uma incubadora de agitação por 1 semana.
   NOTA: Como os organismos contaminantes podem afetar os resultados, as bactérias devem ser inoculadas em meio sólido Middlebrook 7H10 para determinar a morfologia da colônia e verificar a pureza por kits convencionais de detecção de reação em cadeia da polimerase (PCR) para M. paratuberculosis.
3. Inative as suspensões bacterianas por 5-10 min a 70 °C e centrifuja a 3.000 × g por 10 min. Lave o pellet pesado em PBS duas vezes, interrompa por sonicação e armazene a -20 °C.
4. Transfira o pellet para um recipiente estéril e congele-o com gelo seco ou nitrogênio líquido. Transfira imediatamente para uma câmara de liofilização.
5. Liofilizado (4 h a -50 °C sob vácuo) M. paratuberculosis de acordo com o manual da máquina.
6. Ao final da liofilização, retire o recipiente de aço inoxidável do liofilizador e transfira-o para uma bancada de biolimpeza. Use uma espátula de aço inoxidável para desalojar os grumos MAP secos aderidos à parede interna do recipiente de aço inoxidável e pulverizá-los o mais finamente possível.
7. Pesar as células pulverizadas utilizando uma balança electrónica e colocá-las manualmente num frasco asséptico de 10 ml na concentração de 10 mg/ml.
   NOTA: A densidade celular foi quantificada em gramas de peso seco por litro de amostra. Após 3 semanas, 1 mg (peso úmido) de pellet de células bacterianas contém aproximadamente 2,5 × 10⁸ UFC.

3. Preparação da emulsão MOG _35-55

1. Triturar o conteúdo de um frasco para injetáveis de M. paratuberculosis seco (10 mg) para um pó fino com uma argamassa e pilão e adicionar 10 ml ao adjuvante de Freund incompleto para obter uma solução-mãe de 10 mg/ml. Conservar a -4 °C.
2. Antes da imunização, diluir a solução-estoque até uma concentração final de 4 mg/mL.
3. Diluir o peptídeo MOG_35-55 em ddH 2 O até uma concentração final de₂mg/mL e armazenar a -20 °C.
4. Usando um homogeneizador, misturar a solução MOG_35-55 (2 mg/mL) com um volume igual de adjuvante (4 mg/mL) a partir do passo 3.2 em um tubo de 5 mL até formar uma emulsão espessa. Após cada 10 s de mistura, coloque a solução no gelo por 20 s e gire o tubo para recuperar toda a solução.
5. Transfira a emulsão para uma seringa de 1 mL, remova todo o ar e adicione uma agulha de 27 G. A emulsão está agora pronta para injeção.
   NOTA. Uma vez que alguma perda da emulsão viscosa de MOG_35-55 ocorre durante a preparação, é melhor preparar 1,5 vezes a quantidade necessária.

4. Imunização animal

1. Anestesiar os animais com inalação de isoflurano para minimizar o estresse sobre os animais.
2. Injectar a emulsão (200 μL contendo 200 μg/rato de MOG_35-55) por via subcutânea na parte inferior das costas.
3. Administrar uma dose de toxina pertussis (100 μL contendo 200 ng/rato) por via intraperitoneal nos dias 0 e 2 após a imunização.
   CUIDADO: A toxina pertussis tem um efeito supressor múltiplo no sistema imunológico; Evite a ingestão e o contato com os olhos e a pele.

5. Avaliação clínica

1. Monitore os camundongos diariamente quanto ao peso e sinais clínicos. Utilizar o seguinte sistema de pontuação: 0 = ausência de sinais clínicos; 1 = cauda flácida; 2 = comprometimento do reflexo de retificação e fraqueza dos membros pélvicos; 3 = paralisia completa dos membros pélvicos; 4 = paralisia completa dos membros pélvicos com paralisia parcial dos membros torácicos; 5 = moribundo.
   OBS: Após a observação inicial dos sinais clínicos, os animais recebem maior acesso a água e ração. A ração dos roedores é amolecida e umedecida, depois colocada no chão da gaiola a partir do funil de alimentos. No caso de animais desidratados, é administrada suplementação de fluido subcutâneo ou uma pasta de ração de roedores é administrada por gavagem oral. Se um rato necessitar deste tipo de assistência por mais de 3 dias, a eutanásia será realizada.
2. Para evitar ou minimizar a dor e o sofrimento do animal, utilizar os seguintes desfechos humanos: perda de peso corporal maior que 20%, escore clínico ≥4,0, ausência do reflexo de retificação no escore 3 e quando o animal não tiver acesso à ração ou água por 24 h.
   NOTA: Os camundongos foram eutanasiados no 30º dia após a indução de EAE por injeções intraperitoneais de pentobarbital (≥150 mg/kg).

Resultados

Grupos de camundongos C57BL/6 (n total = 15/grupo) foram imunizados com MOG_35-55 em emulsão contendo M. paratuberculosis ou pelo método comum com CFA. Todos os grupos de camundongos manifestaram uma doença monofásica aguda caracterizada por um único pico de incapacidade observado aos 14-17 dias, seguido por uma recuperação parcial dos sintomas nos 10 dias seguintes (Figura 1A). Camundongos imunizados com o adjuvante contendo M. ...

Discussão

Nós demonstramos um protocolo alternativo robusto para induzir ativamente EAE grave em camundongos C57BL/6J usando o peptídeo MOG_35-55 emulsionado em um adjuvante contendo M. paratuberculosis¹⁰. A indução de EAE por esse método resultou em uma doença mais grave do que a induzida pelo protocolo comum com CFA. Essa diferença pode ser devida aos diferentes componentes lipídicos na parede celular das^{micobactérias11}. De fato, ao contrário de outras ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-mouse CD115 antibody	Biolegend, USA	135505	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody	Biolegend, USA	101215	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody	Biolegend, USA	117313	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody	Biolegend, USA	101302	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody	Biolegend, USA	116004	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody	Biolegend, USA	100753	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend, USA	107635	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody	Biolegend, USA	128023	for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice	Charles River Laboratory, Japan		3 weeks old, male and female
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine	Eyela, Tokyo, Japan	FDU-1200	for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant	Difco Laboratories, MD, USA	263810	for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	for use in adjuvant
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution	Fujifilm Wako, Osaka Japan	168-22471	From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100	Kinematica		for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine	Gibco Life Techologies, USA	11875093	For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, USA	423105	cytofluorimetry, for cell viability