副结核分枝杆菌增强实验性自身免疫性脑脊髓炎期间自身抗原免疫原的辅助活性

摘要

在这里，我们提出了一种替代方案，以积极诱导C57BL / 6小鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎，使用免疫原性表位髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）_35-55 悬浮在不完全弗氏佐剂中含有热杀灭的 鸟分枝杆菌 亚种副 结核。

摘要

由髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白 （MOG） 诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 需要通过在含有灭活结 核分枝杆菌的完全弗氏佐剂 （CFA） 中乳化的 MOG 肽进行免疫接种。分枝杆菌的抗原成分激活树突状细胞，刺激T细胞产生细胞因子，通过toll样受体 促进 Th1反应。因此，抗原激发期间存在的分枝杆菌的数量和种类与EAE的发展直接相关。该方法论文提出了一种替代方案，使用含有热杀灭的 鸟分枝杆菌 亚种副 结核 菌株K-10的改良的不完全弗氏佐剂在C57BL / 6小鼠中诱导EAE。

副结核分枝杆菌是鸟分枝杆菌复合体的成员，是反刍动物中 Johne 病的病原体，已被确定为几种人类 T 细胞介导的疾病的危险因素，包括多发性硬化症。总体而言，接种副结核分枝杆菌的小鼠比接种含有结核分枝杆菌H37Ra菌株的CFA的小鼠以4mg / mL的相同剂量表现出更早的起病和更大的疾病严重程度。鸟分枝杆菌亚种副结核（MAP）菌株K-10的抗原决定簇能够在效应期诱导强烈的Th1细胞反应，其特征在于T淋巴细胞（CD4+ CD27+）、树突状细胞（CD11c+ I-A/I-E+）和单核细胞（CD11b+ CD115⁺）的数量显着增加）与用CFA免疫的小鼠相比。此外，副结核分枝杆菌免疫小鼠对MOG肽的增殖性T细胞反应似乎最高。在制剂中使用在含有副结核分枝杆菌的佐剂中乳化的脑炎原（例如，MOG_35-55）可能是在EAE诱导阶段激活树突状细胞以启动髓鞘表位特异性CD4 ⁺ T细胞的替代和经过验证的方法。

引言

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究人类脱髓鞘疾病的常用模型¹。EAE有几种模型:使用不同的髓磷脂肽与强效佐剂联合进行主动免疫，通过髓鞘特异性CD4 ⁺淋巴细胞的体外转移进行被动免疫，以及自发EAE²的转基因模型。这些模型中的每一个都有特定的特征，可以研究EAE的不同方面，例如发病期，效应期或慢性期。EAE的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）模型是研究免疫介导的慢性神经炎症和脱髓鞘机制的良好模型，其特征是单核炎症浸润，外周白质脱髓鞘，^{疾病高峰后}恢复减少1。

MOG-EAE是通过在完全弗氏佐剂（CFA）中用肽MOG_35-55 对易感小鼠进行免疫，然后腹膜内注射百日咳毒素来诱导的。这增加了血脑屏障的通透性，并允许在外周激活的髓鞘特异性T细胞到达中枢神经系统（CNS），在那里它们将被重新激活³。CFA通过增强抗原呈递细胞的抗原摄取以及与体液和细胞介导的反应相关的细胞因子的表达，在诱导EAE中起关键作用⁴。这种机制主要是由于在油中乳化杀死的 结核分枝杆菌 的存在，其成分为免疫系统提供了强烈的刺激⁵。事实上，EAE的诱导与抗^{原激发期间}存在的分枝杆菌数量直接相关6。

在不完全的弗氏佐剂⁷中添加其他被杀死的分枝杆菌，例如丁酸分枝杆菌，以及辅助组合⁸的作用，可以调节EAE的临床过程，从而影响结果的可重复性。 鸟分枝杆菌亚种副结核 （MAP） 是反刍动物中 Johne 病的病原体，与人类 CNS 9 的炎症性疾病有关，因为其抗原成分能够在多发性硬化症和视神经脊髓炎谱系疾病患者中引起强烈的体液和细胞介导反应⁹。因此，在该协议中，我们展示了一种替代且可重复的方法，通过用副结核分枝杆菌代替CFA中的结核分枝杆菌来诱导MOG-EAE。

研究方案

所有小鼠实验均由顺天堂大学医学院机构动物护理和使用委员会批准（批准号290238），并按照美国国立卫生研究院动物实验指南进行。

1. 对实验的一般评论

1. 在23°C±2°C，50%±10%湿度的受控无病原体条件下，以及12小时光/暗循环， 随意获取食物 和水，将小鼠饲养在动物设施中的单个笼子中。
2. 向小鼠注射不含抗原和CFA的磷酸盐缓冲盐水（PBS），并分别将它们用作阴性和阳性对照。

2. 分枝杆菌抗原的制备

1. 在富含10%OADC（油酸，白蛋白，葡萄糖，过氧化氢酶），0.005%吐温80和2mg / L霉菌素J的Middlebrook液体培养基7H9中培养副 结核分枝杆菌 K-10菌株在37°C的T25组织培养瓶中2周。 通过目视检查定期评估菌落生长。
   注意:在生物安全2级（BSL-2）设施中处理 副结核分枝杆菌 。
2. 在振荡培养箱中以 200 mL（与步骤 2.1 相同的培养基）的最终体积在 200 mL（与步骤 2.1 相同的培养基）中以 1.7 × 10^{5 个菌} 落形成单位 （CFU）/mL 的悬浮液培养富集培养物 500 mL 锥形瓶培养 1 周。
   注意:由于污染生物可能会影响结果，因此必须将细菌接种到Middlebrook 7H10固体培养基上，以确定菌落形态并通过常规聚合酶链反应（PCR）检测试剂盒验证副 结核分枝杆菌的纯度。
3. 在70°C下灭活细菌悬浮液5-10分钟，并以3，000× g 离心10分钟。将称重的颗粒在PBS中洗涤两次，通过超声处理破碎，并储存在-20°C。
4. 将颗粒转移到无菌容器中，并用干冰或液氮冷冻。立即转移到冷冻干燥室。
5. 冷冻干燥（在真空下-50°C下4小时）副 结核分枝杆菌 根据机器手册。
6. 在冻干结束时，从冷冻干燥机中取出不锈钢容器并将其转移到生物清洁工作台上。使用不锈钢刮刀将粘附在不锈钢容器内壁上的干燥MAP块状物移开，并尽可能细地粉碎它们。
7. 使用电子天平称量粉碎的细胞，并手动将其放入浓度为10 mg / mL的无菌10 mL小瓶中。
   注意:细胞密度定量为每升样品的干重克数。3周后，1mg（湿重）细菌细胞沉淀含有约2.5×10^8CFU 。

3.MOG _35-55 乳液的制备

1. 用研钵和研杵将一瓶干燥的 副结核分枝杆菌 （10 mg）的内容物研磨成细粉，并向不完整的弗氏佐剂中加入 10 mL，以获得 10 mg/mL 储备溶液。储存在-4°C。
2. 免疫接种前，将储备溶液稀释至终浓度为4 mg/mL。
3. 将肽MOG_35-55 在ddH₂O中稀释至终浓度为2mg / mL并储存在-20°C。
4. 使用均质器，将MOG_35-55 溶液（2mg / mL）与步骤3.2中的等体积佐剂（4mg / mL）在5 mL管中混合，直到形成浓稠的乳液。每混合10秒后，将溶液放在冰上20秒，然后旋转管以回收所有溶液。
5. 将乳液转移到 1 mL 注射器中，除去所有空气，然后加入 27 G 针头。乳液现在已准备好注射。
   注意。由于在制备过程中会发生MOG_35-55 粘性乳液的一些损失，因此最好制备所需量的1.5倍。

4. 动物免疫

1. 用吸入异氟醚麻醉动物，以尽量减少对动物的压力。
2. 将乳液（200μL含有200μg/小鼠的MOG_35-55）皮下注射到下背部。
3. 在免疫接种后第 0 天和第 2 天腹膜内施用一定剂量的百日咳毒素（100 μL，含 200 ng/小鼠）。
   注意:百日咳毒素对免疫系统具有多重抑制作用;避免摄入和接触眼睛和皮肤。

5. 临床评估

1. 每天监测小鼠的体重和临床症状。使用以下评分系统:0 = 无临床症状;1 = 松弛的尾巴;2 = 矫正反射受损和后肢无力;3 = 后肢完全瘫痪;4 =后肢完全瘫痪，前肢部分瘫痪;5 = 奄奄一息。
   注意:在初步观察到临床症状后，为动物提供了更多的水和食物。将啮齿动物食物软化并润湿，然后从食物漏斗放在笼子地板上。对于脱水动物，给予皮下补液，或通过口服强饲法给予啮齿动物食物浆。如果小鼠需要这种类型的帮助超过 3 天，将进行安乐死。
2. 为了避免或尽量减少动物的疼痛和痛苦，请使用以下人类终点:体重减轻大于20%，临床评分≥4.0，得分3时没有扶正反射，以及当动物无法获得饲料或水时24小时。
   注意:小鼠在EAE诱导后第30天通过腹膜内注射戊巴比妥（≥150mg / kg）实施安乐死。

结果

C57BL / 6小鼠组（总n = 15 /组）在含有副结核分枝杆菌的乳剂中或通过CFA的常用方法用MOG_35-55免疫。所有组小鼠都表现出急性单相疾病，其特征在于在14-17天观察到的单个残疾高峰，随后在接下来的10天内症状部分恢复（图1A）。用含有副结核分枝杆菌的佐剂免疫的小鼠，无论性别如何，在免疫后8至9天显示出更早的起病，并且在急?...

讨论

我们展示了一种强大的替代方案，使用在含有副结核分枝杆菌¹⁰的佐剂中乳化的肽MOG_35-55在C57BL / 6J小鼠中积极诱导严重的EAE。通过这种方法诱导EAE导致比CFA共同方案诱导的疾病更严重。这种差异可能是由于分枝杆菌¹¹细胞壁中的脂质成分不同。事实上，与其他分枝杆菌不同，副结核分枝杆菌在细胞壁表面产生脂质肽抗原，而不是糖质

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-mouse CD115 antibody	Biolegend, USA	135505	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody	Biolegend, USA	101215	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody	Biolegend, USA	117313	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody	Biolegend, USA	101302	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody	Biolegend, USA	116004	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody	Biolegend, USA	100753	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend, USA	107635	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody	Biolegend, USA	128023	for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice	Charles River Laboratory, Japan		3 weeks old, male and female
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine	Eyela, Tokyo, Japan	FDU-1200	for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant	Difco Laboratories, MD, USA	263810	for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	for use in adjuvant
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution	Fujifilm Wako, Osaka Japan	168-22471	From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100	Kinematica		for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine	Gibco Life Techologies, USA	11875093	For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, USA	423105	cytofluorimetry, for cell viability