فحص الأدوية القائمة على الخلايا لمثبطات الالتهام الذاتي ذات الصلة 4B السيستين الببتيداز

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لاستخدام مقايسة المراسل المستندة إلى luciferase في تنسيق فحص شبه آلي عالي الإنتاجية.

Abstract

أظهرت أدلة متزايدة أن التدفق الذاتي العالي مرتبط بتطور الورم ومقاومة علاج السرطان. يعد فحص بروتينات الالتهام الذاتي الفردية شرطا أساسيا للاستراتيجيات العلاجية التي تستهدف هذا المسار. ثبت أن تثبيط الأنزيم البروتيني ATG4B يزيد من البقاء على قيد الحياة بشكل عام ، مما يشير إلى أن ATG4B يمكن أن يكون هدفا دوائيا محتملا لعلاج السرطان. طور مختبرنا مقايسة انتقائية قائمة على اللوسيفيراز لمراقبة نشاط ATG4B في الخلايا. بالنسبة لهذا الفحص ، يتم وضع علامة على ركيزة ATG4B ، LC3B ، في المحطة C مع لوسيفيراز مفرز من مجدافيات الأرجل البحرية Gaussia princeps (GLUC). يرتبط هذا المراسل بالهيكل الخلوي للأكتين ، وبالتالي يبقيه في سيتوبلازم الخلايا عند فتحه. يؤدي الانقسام بوساطة ATG4B إلى إطلاق GLUC عن طريق إفراز غير تقليدي ، والذي يمكن مراقبته بعد ذلك عن طريق حصاد المواد الطافية من زراعة الخلايا كارتباط لنشاط ATG4B الخلوي. تقدم هذه الورقة تكييف هذا الفحص القائم على لوسيفيراز مع الفحص الآلي عالي الإنتاجية. نحن نصف سير العمل والتحسين للتحليل المثالي عالي الإنتاجية لنشاط ATG4B الخلوي.

Introduction

الالتهام الذاتي هو عملية أيضية محفوظة تسمح للخلايا بالحفاظ على التوازن داخل الخلايا والاستجابة للإجهاد عن طريق تدهور المحتويات الخلوية القديمة أو المعيبة أو غير الضرورية عبر الجسيمات الحالة^1،2،3. في ظل بعض الظروف الفيزيولوجية المرضية ، تعمل هذه العملية كاستجابة خلوية حاسمة للحرمان من المغذيات والأكسجين ، مما يؤدي إلى إعادة تدوير العناصر الغذائية والدهون ، مما يسمح للخلايا بالتكيف مع احتياجاتها الأيضية²،^3،4. كما تم تحديد الالتهام الذاتي على أنه استجابة إ....

Protocol

ملاحظة: عملية الفحص موضحة في الشكل 1. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إنتاج الفيروسات القهقرية

ملاحظة: ترميز البلازميد ActinLC3dNGLUC هو pMOWS-ActinLC3dNGLUC²⁰. استخدم عددا منخفضا من الخلايا لإنتاج فيروس عالي العيار (من الناحية المثالية أقل من P20).

1. HEK293T الخلايا المستزرعة في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S) عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة ، مع جو من 5٪ CO₂ حتى ت....

النتائج

في منشور سابق⁸ ، استخدمنا هذا الاختبار بنجاح لفحص مكتبات الجزيئات الصغيرة و siRNA وحددنا منظمات جديدة ل ATG4B. هنا ، نصف البروتوكول والنتائج التمثيلية لمراسل luciferase هذا بتنسيق فحص شبه آلي عالي الإنتاجية. يوضح الشكل 8 مثالا على تحليل البيانات الخام لكل من نوى الخلية و.......

Discussion

يصف هذا البروتوكول مقايسة جين المراسل القائمة على الخلية لتحديد مثبطات ATG4B. يعتمد تحديد النتائج الأولية على نشاط لوسيفيراز عند معالجة الخلايا التي تعبر عن إطار القراءة المفتوح الكامل الطول ل LC3B بين β-actin و dNGLUC. بعض مزايا هذا الفحص هي أنه حساس وكمي للغاية وغير جراحي ، حيث يمكنه اكتشاف dNGLUC دو?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)	Tecan	30038609	Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFlo	BioTek		bulk dispenser
Coelenterazine	Santa Cruz Biotechnology	sc-205904	substrate
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Version 2.9.1	image analysis software
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile	Beckman Coulter	001-14555	384PP plate
EnVision II	Perkin Elmer		luminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL	Selleckchem	L3600	Selleckchem
FMK9A	MedChemExpress	HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates	Greiner Bio-One	781076	solid-black 384-well plates
Harmony Imaging software	Perkin Elmer	Version 5.1	imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570	Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software	Labcyte/Beckman Coulter		nanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q water			deionized water
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer		automated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids	Perkin Elmer	6057300	CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC			Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck	TR-1003-G	polybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher	J61278.ME	Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot	Tecan		liquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche	Merck	6366244001	DNA transfection reagent