JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لاستخدام مقايسة المراسل المستندة إلى luciferase في تنسيق فحص شبه آلي عالي الإنتاجية.

Abstract

أظهرت أدلة متزايدة أن التدفق الذاتي العالي مرتبط بتطور الورم ومقاومة علاج السرطان. يعد فحص بروتينات الالتهام الذاتي الفردية شرطا أساسيا للاستراتيجيات العلاجية التي تستهدف هذا المسار. ثبت أن تثبيط الأنزيم البروتيني ATG4B يزيد من البقاء على قيد الحياة بشكل عام ، مما يشير إلى أن ATG4B يمكن أن يكون هدفا دوائيا محتملا لعلاج السرطان. طور مختبرنا مقايسة انتقائية قائمة على اللوسيفيراز لمراقبة نشاط ATG4B في الخلايا. بالنسبة لهذا الفحص ، يتم وضع علامة على ركيزة ATG4B ، LC3B ، في المحطة C مع لوسيفيراز مفرز من مجدافيات الأرجل البحرية Gaussia princeps (GLUC). يرتبط هذا المراسل بالهيكل الخلوي للأكتين ، وبالتالي يبقيه في سيتوبلازم الخلايا عند فتحه. يؤدي الانقسام بوساطة ATG4B إلى إطلاق GLUC عن طريق إفراز غير تقليدي ، والذي يمكن مراقبته بعد ذلك عن طريق حصاد المواد الطافية من زراعة الخلايا كارتباط لنشاط ATG4B الخلوي. تقدم هذه الورقة تكييف هذا الفحص القائم على لوسيفيراز مع الفحص الآلي عالي الإنتاجية. نحن نصف سير العمل والتحسين للتحليل المثالي عالي الإنتاجية لنشاط ATG4B الخلوي.

Introduction

الالتهام الذاتي هو عملية أيضية محفوظة تسمح للخلايا بالحفاظ على التوازن داخل الخلايا والاستجابة للإجهاد عن طريق تدهور المحتويات الخلوية القديمة أو المعيبة أو غير الضرورية عبر الجسيمات الحالة1،2،3. في ظل بعض الظروف الفيزيولوجية المرضية ، تعمل هذه العملية كاستجابة خلوية حاسمة للحرمان من المغذيات والأكسجين ، مما يؤدي إلى إعادة تدوير العناصر الغذائية والدهون ، مما يسمح للخلايا بالتكيف مع احتياجاتها الأيضية2،3،4. كما تم تحديد الالتهام الذاتي على أنه استجابة إجهاد خلوي تتعلق بالعديد من الأمراض ، مثل الاضطرابات التنكسية العصبية ، وعدوى مسببات الأمراض ، وأنواع مختلفة من السرطان. وظيفة الالتهام الذاتي في السرطان معقدة وتعتمد على نوع الورم ومرحلته وحالته. يمكن أن يثبط تكوين الورم من خلال تدهور الالتهام الذاتي للخلايا التالفة ، ولكن يمكنه أيضا تعزيز بقاء الأورام المتقدمة عن طريق تحسين بقاء الخلايا أثناء الظروف العصيبة ، مثل نقص الأكسجة والحرمان من المغذيات والضرر السام للخلايا2،4،5،6.

أظهرت العديد من الدراسات أن تثبيط الالتهام الذاتي يوفر فائدة كاستراتيجية مضادة للسرطان. وبالتالي ، فإن تثبيط الخطوات الحرجة ، مثل تكوين البلعمة الذاتية أو اندماجها مع الليزوزوم ، يمكن أن يكون وسيلة فعالة للسيطرة على السرطان2،4،5،6. أظهرت الأدلة المتزايدة أن ATG4B متورط في بعض الحالات المرضية ، وقد اكتسب الانتباه كهدف محتمل مضاد للسرطان2،3،4. على سبيل المثال ، لوحظ أن خلايا سرطان القولون والمستقيم وخلايا سرطان الثدي الإيجابية لمستقبلات عامل نمو البشرة البشري 2 (HER2) لديها مستويات تعبير ATG4B أعلى بكثير من الخلايا الطبيعية المجاورة 2,4. في خلايا سرطان البروستاتا ، أدى تثبيط ATG4B إلى قابلية خاصة بخط الخلية للعلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي7. في الآونة الأخيرة ، ظهرت أدلة قوية على أن سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) عرضة بشكل خاص لتثبيط ATG4B. على سبيل المثال ، في نموذج فأر معدل وراثيا ، تبين أن الفقدان المتقطع لوظيفة ATG4B يقلل من نمو ورم PDAC ويزيد من البقاء على قيد الحياة 3,4. بشكل عام ، يتم التعبير عن ATG4B بشكل مفرط في بعض أنواع السرطان ، ويرتبط بتطور الورم ، ويرتبط بمقاومة علاج السرطان2،4،8.

تحتوي بروتياز السيستين ATG4 في الثدييات على أربعة أفراد من العائلة ، ATG4A-ATG4D. تظهر هذه البروتينات بعض الانتقائية المستهدفة تجاه عائلة البروتيناتLC3 / GABARAP (ATG8) 9،10،11 وقد يكون لها وظائف إضافية غير مرتبطة بنشاط البروتياز12،13. علاوة على ذلك ، يعمل ATG4 في تنظيم نوع جديد من التعديل بعد الترجمة ، ATG8-ylation للبروتينات11,12. في حين أن ATG4B وركيزته الرئيسية LC3B هي الأكثر دراسة على نطاق واسع ، تظهر صورة تشير إلى دور معقد لكل فرد من أفراد الفصيلة الفرعية في تنظيم عمليات الالتهام الذاتي وغير الالتهام الذاتي. يتم تأكيد ذلك أيضا من خلال شبكة معقدة من التعديلات اللاحقة للترجمة التي تنظم نشاط ATG4B عن طريق الفسفرة ، والأستلة ، والجليكوزيل ، والنيتروسيل9،10،11،12،13.

تم نشر العديد من مثبطات ATG4B المعروفة2،4،14،15. في حين أن هذه مناسبة كأدوات بحثية ، إلا أن ملفها الدوائي أو انتقائيتها أو قوتها قد منعتها من التطوير كمرشحين قبل سريريين 4,16. بشكل عام ، هناك حاجة ملحة لتحديد مركبات أكثر فعالية وانتقائية. في كثير من الأحيان ، تكون المركبات مثبطات كيميائية حيوية جيدة لوظيفة البروتين ، ومع ذلك فإن فعاليتها في المقايسات القائمة على الخلايا ضعيفة. هناك العديد من المقايسات لمراقبة نشاط ATG4B ، بما في ذلك الطرق الكيميائية الحيوية والمقايسات الخلوية4. لقد طورنا سابقا مقايسة بسيطة قائمة على التلألؤ وعالية الإنتاجية لمراقبة نشاط ATG4B في الخلايا 8,17. يستخدم هذا الفحص بروتين لوسيفيراز من Gaussia princeps (GLUC) مستقر ونشط في الوسط خارج الخلية ويمكن إطلاقه بشكل مستحث من الخلايا استجابة لنشاط التحلل البروتيني ATG4B18,19.

في بناء هذا المراسل ، يرتبط dNGLUC بالهيكل الخلوي للأكتين للخلايا. يمكن إدخال رابط خاص بالبروتياز بين مرساة β-actin و dNGLUC ، مما يجعل الإفراز يعتمد على انقسام الرابط. استخدمنا إطار القراءة المفتوح الكامل الطول ل LC3B بين β-actin و dNGLUC ، حتى نتمكن من مراقبة انقسام LC3B17،18،19. على الرغم من أن آلية إفراز dNGLUC غير مفهومة بشكل جيد ، إلا أنها محددة لمراقبة نشاط ATG4B ، ولا تعتمد على الالتهام الذاتي الكلي كما يحدث في خلايا خروج المغلوب ATG5 ، ويتم بوساطة آليات غير تقليدية لا تتطلب ببتيد إشارة كلاسيكي4،18،19. لقد استخدمنا هذا المراسل بنجاح لفحص الجزيئات الصغيرة ومكتبات siRNA ، وحددنا منظمات جديدة لنشاط ATG4B ، مثل كينازات بروتين Akt8. تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لاستخدام مراسل luciferase هذا بتنسيق فحص شبه آلي عالي الإنتاجية.

Protocol

ملاحظة: عملية الفحص موضحة في الشكل 1. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إنتاج الفيروسات القهقرية

ملاحظة: ترميز البلازميد ActinLC3dNGLUC هو pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. استخدم عددا منخفضا من الخلايا لإنتاج فيروس عالي العيار (من الناحية المثالية أقل من P20).

  1. HEK293T الخلايا المستزرعة في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S) عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة ، مع جو من 5٪ CO2 حتى تتجمع 80٪ -90٪ قبل البذر للنقل.
  2. في اليوم السابق للانتقال ، قم بزرع الخلايا في صفيحة من 6 آبار بكثافة 1 × 106 خلايا / بئر في 2 مل / بئر من وسط النمو الكامل. احتضان اللوحة بين عشية وضحاها في حاضنة رطبة مع جو من CO5 ٪ 2.
    ملاحظة: اتبع تعليمات الشركة المصنعة في حالة استخدام كاشف نقل قائم على الليبوسومال. يصف هذا البروتوكول استخدام كاشف غير قائم على الليبوسومال. قبل البدء في النقل ، اسمح لكاشف نقل الحمض النووي والحمض النووي والوسائط بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة (~ 15 دقيقة).
  3. لكل عملية نقل ، أضف 200 ميكرولتر من أنابيب الطرد المركزي المتوسطة الخالية من المصل إلى 1.5 مل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. في كل أنبوب ، أضف الكميات التالية من البلازميدات: 1000 نانوغرام من pMOWS-ActinLC3dNGLUC ؛ 900 نانوغرام من GagPol ؛ 100 نانوغرام من VSV-G.
    ملاحظة: كمية البلازميدات وحجم الوسائط المدرجة هنا هي للوحة 12 بئرا. في حالة استخدام نوع لوحة مختلف ، اضبط حجم الوسائط وكميات البلازميد للوصول إلى التركيز النهائي البالغ 5 نانوغرام / ميكرولتر من بلازميد النقل ، و 4.5 نانوغرام / ميكرولتر من بلازميد التعبئة ، و 0.5 نانوغرام / ميكرولتر من بلازميد المغلف. استخدم أي بلازميد تعبئة يحتوي على جينات تعبر عن الكمامة والبوبول ، وأي بلازميد مغلف يحتوي على الجين المعبر عن VSV-G.
  4. دوامة قارورة كاشف نقل الحمض النووي لمدة 30 ثانية. ماصة 4 ميكرولتر من كاشف النقل مباشرة في الوسط الذي يحتوي على الحمض النووي المخفف. تخلط برفق عن طريق قلب الأنبوب برفق.
    ملاحظة: لا تلمس جدران الأنابيب البلاستيكية بالأطراف. لا ماصة صعودا وهبوطا أو دوامة.
  5. احتضان التفاعل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. أثناء احتضان التفاعل ، قم بإزالة الوسط القديم من اللوحة المكونة من 6 آبار واستبدله ب 2 مل / بئر من الوسائط الطازجة الخالية من المصل.
  7. أضف كل مجمع نقل إلى كل بئر بطريقة قطرة.
  8. هز اللوحة أو حركها برفق لضمان التوزيع المتساوي على سطح البئر بالكامل.
  9. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بجو من CO2٪ 2.
  10. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط القديم بوسط كامل طازج (2 مل / بئر) وأعد الخلايا إلى الحاضنة المرطبة بجو 5٪ CO2 لمدة 72 ساعة.
  11. بعد 72 ساعة ، احصد المادة الطافية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وأجهزة طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 4000 × جم عند 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا الميتة والحطام. لمزيد من التنقية ، استخدم حقنة كبيرة سعة 60 مل لتمرير المادة الطافية من خلال مرشح 0.20 ميكرومتر. قم بإعداد القسمة ذات الاستخدام الواحد على الفور من 300 ميكرولتر وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: تجنب دورة التجميد والذوبان للحفاظ على أقصى نشاط للمنتج.

2. نقل الفيروسات القهقرية

  1. في اليوم السابق لتحويل الخلايا ، قم بزرع الخلايا المستهدفة بكثافة متوسطة (PANC1 عند 1 × 10 5 خلايا / بئر) في صفيحة 12 بئرا في 1 مل / بئر من الوسط مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بجو5 ٪ CO2.
    ملاحظة: يجب تحديد أفضل كثافة للخلايا مسبقا ، حيث أن أنواع الخلايا المختلفة لها قدرات ارتباط مختلفة. من الناحية المثالية ، استخدم كثافة الخلية للحصول على التقاء 40٪ -50٪.
  2. قم بإزالة قسامات الفيروسات القهقرية المجمدة من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج قبل كل استخدام.
    ملاحظة: لا تقم بإعادة تجميد الحصص غير المستخدمة.
  3. في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، قم بإعداد خليط من المادة الطافية الفيروسية والبوليبرين بتركيز نهائي قدره 8 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: تنطبق الأحجام اللاحقة على نقل صفيحة من 12 بئرا تحتوي على حجم نهائي قدره 500 ميكرولتر / بئر. يمكن تقدير الحجم النهائي للطاف الفيروسي عن طريق اختبار مجموعة من التخفيفات الفيروسية في وجود البوليبرين. يمكن استخدام التخفيفات الأعلى أو الأدنى اعتمادا على مستويات التعبير المطلوبة لجين التحوير وحجم الوعاء المستخدم.
  4. قم بإزالة الوسط القديم من لوحة 12 بئرا وأضف 500 ميكرولتر من الخليط إلى كل بئر. احتضان الخلايا مع طاف فيروسي بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة مع جو من CO5 ٪ 2.
    ملاحظة: احتفظ ببئرين بوسط كامل (بدون طاف فيروسي) لاستخدامهما كعنصر تحكم للاختيار.
  5. استبدل الوسط المحتوي على الفيروس بوسط نمو كامل جديد (1 مل / بئر). ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة المرطبة بجو 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة.

3. اختيار السكان المجمعة والحفاظ عليها

  1. استبدل وسط النمو بوسط الاختيار (وسط نمو كامل بتركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل بوروميسين). مراقبة نمو الخلايا وتغيير وسائط التحديد كل 2-3 أيام. عند التقاء ، قم بالتوسع إلى طبق من 6 آبار ، ثم إلى طبق زراعة الأنسجة بقطر 10 سم.
  2. احتفظ بالخلايا في وسط الاختيار على الأقل طالما أن الخلايا الضابطة (غير المحولة) تموت تماما.
    ملاحظة: للحصول على نتائج ناجحة ، يوصى بتحديد التركيزات المثلى للبوروميسين قبل بدء المشروع التجريبي. لهذا ، قم بإنشاء منحنى قتل بوروميسين لتحديد الحد الأدنى للتركيز المطلوب لقتل الخلايا غير المنقولة بين 3 و 10 أيام.
  3. بمجرد أن تنمو الخلايا في وسط الاختيار ، قم بتوسيع الخلايا على وسائط نمو كاملة وتجميد حصص المخزون للمشروع التجريبي.
    ملاحظة: سجل رقم الممر وتجنب العمل مع المجموعات المجمعة من المخزون المجمد بأرقام مرور أعلى من خمسة. تحقق بانتظام من تلوث الميكوبلازما قبل إجراء الفحص. من الناحية المثالية ، استخدم دفعة خلية جديدة قبل كل فحص للحصول على أقصى إشارة من luciferase.
  4. الحفاظ على الخلايا في وسط الاختيار والبذور ما يكفي من الخلايا للوصول إلى الكثافة المطلوبة في اليوم السابق للفحص.

4. إضافة مركب

ملاحظة: تتكون مكتبة الجزيئات الصغيرة Selleckchem من حوالي 4000 مركب مرتبة في ثمانية صفوف و 10 أعمدة في خمسين صفيحة من 96 بئرا بتركيز مخزون يبلغ 10 مللي متر في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).

  1. Aliquot 30 ميكرولتر من المركب في البئر المناسب للوحة المصدر المتوافقة مع موزع السائل الصوتي النانوي. استخدم صفيحة بولي بروبيلين 384 بئرا (لوحة 384PP). احتفظ بهذه الألواح محكمة الغلق وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: بروتوكول الفحص الموصوف هنا هو لما مجموعه 10 لوحات فحص في اليوم ؛ تم استخدام تركيز ثابت قدره 10 ميكرومتر كتركيز فحص نهائي مع فترة حضانة 24 ساعة.
  2. قم بإذابة أطباق المكتبة المركبة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تأكد من إذابة اللوحة تماما وموازنتها مع درجة حرارة الغرفة. قد يؤثر تدرج درجة الحرارة عبر اللوحة على معالجة السوائل.
  3. قم بتوزيع 50 nL / بئر في لوحة فحص 384 بئرا باستخدام موزع سائل صوتي نانوي.
    ملاحظة: تأكد من تطابق لوحات المصدر والوجهة المحددة في البرنامج مع اللوحات المستخدمة في هذه الخطوة.
  4. إنشاء برنامج توزيع على جدول بيانات.
  5. افتح البرنامج.
  6. افتح بروتوكولا جديدا. من علامة التبويب البروتوكول ، حدد الخيارات التالية: تنسيق لوحة العينة ، 384PP ؛ نوع لوحة العينة ، 384PP_DMSO2 ؛ ونوع لوحة الوجهة ، CellCarrier-384 Ultra PN (الشكل 2A).
  7. ضمن قائمة الانتقاء ، حدد خيار الاستيراد (الشكل 2 ب) لاستيراد جدول البيانات الذي يحتوي على برنامج التوزيع (الشكل 2 ج).
  8. حدد خيار تشغيل البروتوكول (الشكل 2D) ، وتحقق مما إذا كانت المعلومات المعروضة صحيحة ، وانقر فوق تشغيل.
  9. في النافذة الجديدة المسماة حالة التشغيل (الشكل 2E) ، انقر فوق ابدأ واتبع الخطوات المعروضة على نوافذ المطالبة (الشكل 2F ، G).

5. بذر الخلية

  1. التربسين الخلايا من قارورة زراعة الخلايا أو أطباق بتري ثقافة الخلية وتحييد التربسين عن طريق إضافة وسائط تحتوي على FBS.
  2. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 390 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية برفق وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من وسائط النمو الكاملة.
  3. إجراء عد الخلايا.
  4. تحضير تعليق الخلية مع 4.6 × 107 خلايا في 230 مل من وسائط الثقافة الكاملة.
    ملاحظة: هذا الحجم وكثافة الخلية مخصص للوحات فحص 10x 384 بئر بالإضافة إلى حجم ميت من لوحين 384 بئر.
  5. قم بتوزيع 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة فحص 384 بئرا ، محضرة في القسم 4.
    ملاحظة: يمكن إجراء بذر الخلايا إما يدويا أو باستخدام موزع سائب.
  6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بجو من 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.

6. حصاد الطاف الخلوي

ملاحظة: تقوم المنصة الروبوتية لمعالجة السوائل المستخدمة هنا بمعالجة السوائل بذراع متعدد القنوات ل 96 نصيحة. في حالة عدم توفر أتمتة معالجة السوائل ، يمكن تكييف البروتوكول مع تنسيق منخفض الإنتاجية باستخدام ماصات متعددة القنوات.

  1. قم بتكوين سطح محطة عمل أتمتة المختبر كما هو موضح في الشكل 3.
  2. ضع المكدس المكون من 96 طرفا القابل للتصرف في الموضع P1 (الشكل 3 أ).
    ملاحظة: يتكون كل مكدس ذو 96 طرفا من ثمانية رفوف يمكن التخلص منها. عند استخدام ذراع متعدد القنوات ل 96 نصيحة ، يتم تقسيم لوحة البئر 384 إلى أربعة أرباع. وبالتالي ، فإن كل كومة طرف تكفي لنقل المادة الطافية من لوحين للفحص إلى لوحين فارغين ، أسودين صلبين ، 384 بئرا. يجب استبدال مكدس الطرف بالكامل بعد كل تشغيل لوحين من لوحين.
  3. ضع لوحات الفحص في المواضع P2 و P4 (الشكل 3 أ).
  4. ضع الألواح الفارغة ذات اللون الأسود الصلب و 384 بئرا في المواضع P3 و P5 (الشكل 3A).
    ملاحظة: تم تكييف هذه المنصة الروبوتية المرنة والقادرة لهذا الفحص وتمت كتابة برنامج خاص (الشكل 3 ب).
  5. احصل على النصائح من الموضع P1.
  6. نضح 10 ميكرولتر من المادة الطافية من اللوحة الموجودة في الموضع P2 وانقلها إلى اللوحة السوداء الصلبة الفارغة في الموضع P3.
    ملاحظة: يجب وضع الأطراف على عمق مناسب داخل الآبار لشفط المادة الطافية دون إزعاج الطبقة الأحادية للخلية في قاع البئر.
  7. قم بإسقاط النصائح في النفايات في الموضع P6 (الشكل 3 أ).
  8. كرر الخطوات 6.5-6.7 للآبار المتبقية من اللوحة في الموضع P2 ، ثم كرر نفس الخطوات لنقل المادة الطافية من الموضع P4 إلى الموضع P5.
    ملاحظة: تأكد من جمع المادة الطافية وتوزيعها على الآبار المقابلة في اللوحة السوداء الصلبة الفارغة (الشكل 3C ، D). نظرا لأن dNGLUC المفرز مستقر جدا في وسط زراعة الخلايا ، يمكن إغلاق الألواح والاحتفاظ بها لمدة تصل إلى 7 أيام عند 4 درجات مئوية في الظلام.

7. مقايسة لوسيفيراز

ملاحظة: يظهر dNGLUC المستخدم في المراسل حركية الفلاش مع اضمحلال الإشارة السريع. بسبب الاضمحلال السريع للتلألؤ بعد إضافة الركيزة (coelenterazine) ، يجب ضبط قارئ اللوحة لقياس إشارة التلألؤ في المواد الطافية ؛ حقن الركيزة في بئر وقراءة ذلك جيدا بعد بضع ثوان. لهذا السبب ، استخدم قارئ لوحة قادر على مراقبة التلألؤ ومجهز بحاقن الركيزة لضمان أن الوقت بين خطوات الحقن والقراءة سيكون موحدا لجميع العينات. يمكن العثور على الإعدادات المستخدمة في قارئ اللوحة في الشكل 4.

  1. تحضير coelenterazine الأصلي كمحلول مخزون 1 ملغ / مل في الميثانول المحمض (10 ميكرولتر من 3 M HCl إلى 1 مل من الميثانول).
    ملاحظة: اتبع إرشادات الصحة والسلامة المحلية فيما يتعلق بالتعامل مع الميثانول في المختبر وتجنب ملامسة الجلد. قم بإعداد محلول ركيزة العمل الطازج قبل بدء الفحص.
  2. قم بتهيئة مضخة الحاقن (الشكل 5 أ).
  3. شطف الأنبوب بالماء منزوع الأيونات (الشكل 5B-D).
  4. شطف الأنبوب مع الميثانول.
  5. أثناء شطف الأنبوب ، قم بإعداد محلول الركيزة العاملة عن طريق تخفيف الركيزة 1: 100 (بالنسبة للوحة واحدة من 384 بئرا ، أضف 220 ميكرولتر من محلول مخزون الركيزة إلى 21.8 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات [PBS]).
  6. شطف الأنبوب مع حل عمل الركيزة (الشكل 5B-D).
  7. قم بتحميل اللوحة في القارئ وابدأ القياس باستخدام الإعدادات الموضحة في الشكل 4.
  8. كرر الخطوات 7.6-7.7 لجميع لوحات الفحص.
  9. بمجرد الانتهاء من جميع لوحات الفحص ، اشطف الأنبوب بالميثانول.
  10. شطف الأنبوب بالماء منزوع الأيونات.
    ملاحظة: في نهاية هذه الخطوة ، يتم الحصول على قيم luciferase الخام المرتبطة بنشاط ATG4B الخلوي. لتطبيع أرقام الخلايا ، تكون الخطوات التالية ضرورية عن طريق حساب رقم الخلية في كل بئر بواسطة المجهر الفلوري.

8. تثبيت الخلية وتلطيخها

ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة يدويا بمساعدة ماصة متعددة القنوات أو باستخدام موزع سائب.

  1. إصلاح الخلايا مع 4 ٪ بارافورمالدهيد (في 1x PBS) لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: اتبع إرشادات الصحة والسلامة المحلية فيما يتعلق بالتعامل مع بارافورمالدهيد في المختبر وتجنب ملامسة الجلد. نفذ هذه الخطوة في غطاء أمان إن أمكن.
  2. يغسل ثلاث مرات مع 1x PBS.
  3. تلطيخ النوى مع Hoechst 33342 المخفف 1: 5000 في 1x PBS لمدة 15 دقيقة.
  4. يغسل ثلاث مرات مع 1x PBS.

9. الحصول على الصور

ملاحظة: قم بإجراء التقاط الصور باستخدام مجهر آلي. كبديل للحصول على الصور لتحديد عدد الخلايا ، يمكن أيضا تحديد نشاط luciferase داخل الخلايا. هناك مزايا وعيوب فيما يتعلق بما إذا كان المرء طبيعيا لأرقام الخلايا أو نشاط لوسيفيراز داخل الخلايا ، والذي تمت مناقشته أدناه. نجد أن تحديد أعداد الخلايا أقل توغلا ويؤدي إلى تباين أقل من تحديد قيم لوسيفيراز داخل الخلايا.

  1. قم بتشغيل برنامج تشغيل المجهر (الشكل 6).
  2. في علامة التبويب إعداد ، اختر نوع اللوحة المعرفة مسبقا الصحيح. إذا لم يكن نوع اللوحة مضبوطا مسبقا ، فأدخل أبعاد اللوحة يدويا.
  3. قم بتحميل اللوحة في المجهر بالنقر فوق خيار الإخراج والتحميل.
  4. ثم اختر هدف 20x Air (الفتحة العددية [NA]: 0.4 ).
    ملاحظة: تأكد من ضبط طوق الهدف على القيمة الصحيحة ، مما يسمح بالتركيز المناسب مع أنواع اللوحات المختلفة.
  5. ضمن تحديد القناة، اختر Hoechst 33342.
    ملاحظة: يجب تحسين إعدادات القناة للوقت والطاقة والارتفاع وفقا لنوع اللوحة المستخدمة.
  6. في تحديد التخطيط، حدد كل الآبار من اللوحة وأربعة حقول من البئر.
  7. في الوظائف عبر الإنترنت، حدد المجلد المقابل لنقل البيانات إلى برنامج التحليل.

10. تحليل الصور

ملاحظة: يمكن استخدام أي برنامج لتحليل الصور لتقسيم نوى الخلايا وحسابها من الصور المكتسبة. هنا ، نصف خطوات استخدام برنامج معين عبر الإنترنت متوافق مع العديد من ملفات المجاهر الآلية.

  1. قم بتشغيل برنامج تحليل الصور.
  2. انتقل إلى علامة التبويب تحليل الصور لبدء تجزئة الصورة (الشكل 7 أ).
  3. في علامة التبويب صورة الإدخال ، انقر فوق علامة + لإضافة كتلة إنشاء جديدة (الشكل 7 أ).
  4. من القائمة ، حدد خيار البحث عن النوى (الشكل 7 أ) وحدد Hoechst 33342 كخيار القناة (الشكل 7 ب).
  5. افحص بصريا الكائنات المجزأة على الصورة وحدد طريقة التجزئة الأكثر دقة.
    ملاحظة: في هذه التجربة ، استخدمنا الطريقة C (الشكل 7C). يحتوي كل خيار طريقة على فئات فرعية يمكن تعديلها للحصول على أفضل تجزئة ممكنة.
  6. ثم ، انقر فوق تحديد النتائج علامة التبويب (الشكل 7C) وحدد الإخراج القياسي كخيار الطريقة.
  7. من الفئة الفرعية ، حدد عدد نوى الكائنات وعدد الكائنات (الشكل 7C).
  8. احفظ مسار التحليل باستخدام الخيار حفظ التحليل إلى القرص أو حفظ التحليل إلى قاعدة البيانات .
  9. ضمن علامة التبويب تحليل الدفعات ، حدد البيانات المراد تحليلها من الشجرة.
  10. ضمن الطريقة، حدد خط أنابيب التحليل المحفوظ في الخطوة 10.8.
    ملاحظة: من الممكن أيضا تحميل ملف برنامج نصي من خارج البرنامج المشار إليه أو تحميل تحليل موجود محفوظ في قاعدة البيانات.
  11. انقر فوق تشغيل التحليل لبدء التحليل (الشكل 7D). في نهاية سير العمل هذا ، يتم إنشاء مجموعتي بيانات: قيم luciferase الخام من المواد الطافية ورقم الخلية في كل بئر. استخدم كلاهما لتطبيع قيمة لوسيفيراز لكل خلية.

النتائج

في منشور سابق8 ، استخدمنا هذا الاختبار بنجاح لفحص مكتبات الجزيئات الصغيرة و siRNA وحددنا منظمات جديدة ل ATG4B. هنا ، نصف البروتوكول والنتائج التمثيلية لمراسل luciferase هذا بتنسيق فحص شبه آلي عالي الإنتاجية. يوضح الشكل 8 مثالا على تحليل البيانات الخام لكل من نوى الخلية و...

Discussion

يصف هذا البروتوكول مقايسة جين المراسل القائمة على الخلية لتحديد مثبطات ATG4B. يعتمد تحديد النتائج الأولية على نشاط لوسيفيراز عند معالجة الخلايا التي تعبر عن إطار القراءة المفتوح الكامل الطول ل LC3B بين β-actin و dNGLUC. بعض مزايا هذا الفحص هي أنه حساس وكمي للغاية وغير جراحي ، حيث يمكنه اكتشاف dNGLUC دو?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال التمويل الأساسي لمجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة لمنحة وحدة جامعة MRC-UCL المرجع MC_U12266B ، ومنحة منصة MRC للخرف في المملكة المتحدة MR / M02492X / 1 ، وسرطان البنكرياس في المملكة المتحدة (مرجع المنحة 2018RIF_15) ، ومخطط دعم التسريع العلاجي UCL ، بدعم من MRC الثقة في المفهوم 2020 UCL MC / PC / 19054. تم الحصول على ترميز البلازميد ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) من الدكتور روبن كيتلر (قسم الطب البشري ، كلية الطب في برلين).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)Tecan30038609Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFloBioTekbulk dispenser
CoelenterazineSanta Cruz Biotechnologysc-205904substrate
Columbus Image analysis softwarePerkin ElmerVersion 2.9.1image analysis software
DPBS (1x)Gibco14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterileBeckman Coulter001-14555384PP plate
EnVision IIPerkin Elmerluminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µLSelleckchemL3600Selleckchem
FMK9AMedChemExpressHY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well platesGreiner Bio-One781076solid-black 384-well plates
Harmony Imaging softwarePerkin ElmerVersion 5.1imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in WaterThermoFisherH3570Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick softwareLabcyte/Beckman Coulternanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q waterdeionized water
Opera Phenix High-Content Screening SystemPerkin Elmerautomated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lidsPerkin Elmer6057300CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUCObtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection ReagentMerckTR-1003-Gpolybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific ChemicalsThermoFisherJ61278.MEPuromycin
Tecan Freedom EVO 200 robotTecanliquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent RocheMerck6366244001DNA transfection reagent

References

  1. Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
  2. Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649 (2019).
  3. Towers, C. G., Thorburn, A. Therapeutic targeting of autophagy. EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).
  4. Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
  5. Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. Targeting autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).
  6. Kimmelman, A. C., White, E. Autophagy and tumor metabolism. Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).
  7. Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
  8. Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
  9. Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
  10. Tanida, I., Sou, Y. -. S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
  11. Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
  12. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
  13. Ketteler, R., Tooze, S. A. ATG4: More than a protease. Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).
  14. Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
  15. Fernández, &. #. 1. 9. 3. ;. F., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
  16. Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
  17. Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
  18. Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -. W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
  19. Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
  20. Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved