Клеточный скрининг лекарственных препаратов на наличие ингибиторов аутофагии, связанной с 4B цистеин-пептидазой

Резюме

Здесь мы опишем подробный протокол использования репортерного анализа на основе люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга с высокой пропускной способностью.

Аннотация

Появляется все больше доказательств того, что высокий аутофагический поток связан с прогрессированием опухоли и резистентностью к терапии рака. Анализ отдельных белков аутофагии является необходимым условием для терапевтических стратегий, нацеленных на этот путь. Было показано, что ингибирование протеазы аутофагии ATG4B увеличивает общую выживаемость, что позволяет предположить, что ATG4B может быть потенциальной мишенью для терапии рака. Наша лаборатория разработала селективный анализ на основе люциферазы для мониторинга активности ATG4B в клетках. Для этого анализа субстрат ATG4B, LC3B, помечается на С-конце секретируемой люциферазой морского веслоногого рачка Gaussia princeps (GLUC). Этот репортер связан с актиновым цитоскелетом, таким образом, удерживая его в цитоплазме клеток при расщеплении. ATG4B-опосредованное расщепление приводит к высвобождению GLUC путем нетрадиционной секреции, которую затем можно контролировать путем забора надосадочной жидкости из клеточной культуры в качестве коррелята клеточной активности ATG4B. В данной статье представлена адаптация этого анализа на основе люциферазы к автоматизированному высокопроизводительному скринингу. Описан рабочий процесс и оптимизация для примерного высокопроизводительного анализа клеточной активности ATG4B.

Введение

Аутофагия — это консервативный метаболический процесс, который позволяет клеткам поддерживать внутриклеточный гомеостаз и реагировать на стресс путем разложения старого, дефектного или ненужного клеточного содержимого через лизосомы ^1,2,3. При некоторых патофизиологических условиях этот процесс действует как важнейшая клеточная реакция на недостаток питательных веществ и кислорода, что приводит к рециркуляции питательных веществ и липидов, позволяя клеткам адаптироваться к своим метаболическим потребностям ^2,3,4. Аутофагия также была идентифицирована как клеточная стрессовая реакция, связанная с несколькими заболеваниями, такими как нейродегенеративные расстройства, патогенные инфекции и различные виды рака. Функция аутофагии при раке сложна и зависит от типа, стадии и состояния опухоли. Он может подавлять опухолегенез путем аутофагической деградации поврежденных клеток, но также может способствовать выживанию прогрессирующих опухолей, улучшая выживаемость клеток во время стрессовых условий, таких как гипоксия, недостаток питательных веществ и цитотоксическое повреждение 2,4,5,6.

Несколько исследований показали, что ингибирование аутофагии обеспечивает преимущества в качестве противоопухолевой стратегии. Таким образом, ингибирование критических этапов, таких как образование аутофагосом или его слияние с лизосомой, может быть эффективным методом борьбы с раком 2,4,5,6. Растущее количество доказательств показало, что ATG4B участвует в определенных патологических состояниях, и он привлек внимание как потенциальная противораковая мишень ^2,3,4. Например, было замечено, что клетки колоректального рака и рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2)-положительные клетки рака молочной железы имели значительно более высокие уровни экспрессии ATG4B, чем соседние нормальные клетки ^2,4. В клетках рака предстательной железы ингибирование ATG4B приводило к специфической для клеточной линии восприимчивости к химиотерапии и лучевой терапии⁷. В последнее время появились убедительные доказательства того, что протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) особенно уязвима к ингибированию ATG4B. Например, на генетически модифицированной мышиной модели было показано, что периодическая потеря функции ATG4B снижает рост опухоли PDAC и увеличивает выживаемость ^3,4. В целом, ATG4B имеет высокую гиперэкспрессию при некоторых типах рака, связан с прогрессированием опухоли и связан с резистентностью к терапии рака ^2,4,8.

Цистеиновые протеазы ATG4 у млекопитающих имеют четыре члена семейства, ATG4A-ATG4D. Эти белки проявляют некоторую целевую селективность по отношению к семейству белков^LC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 и могут иметь дополнительные функции, не связанные с их протеазной активностью ^12,13. Кроме того, ATG4 функционирует в регуляции нового типа посттрансляционной модификации — ATG8-илирования белков^11,12. В то время как ATG4B и его основной субстрат LC3B являются наиболее широко изученными, вырисовывается картина, которая предполагает сложную роль каждого члена подсемейства в регуляции аутофагических и неаутофагических процессов. Это также подтверждается сложной сетью посттрансляционных модификаций, которые регулируют активность ATG4B посредством фосфорилирования, ацетилирования, гликозилирования и нитрозилирования 9,10,11,12,13.

Несколько известных ингибиторов ATG4B были опубликованы 2,4,14,15. Несмотря на то, что они пригодны в качестве исследовательских инструментов, их фармакодинамический профиль, селективность или эффективность пока не позволяют разрабатывать их в качестве кандидатов на доклиническую стадию ^4,16. В целом, существует острая необходимость в выявлении более мощных и селективных соединений. Часто эти соединения являются хорошими биохимическими ингибиторами функции белка, но их эффективность в клеточных анализах низкая. Существует несколько тестов для мониторинга активности ATG4B, включая биохимические методы и клеточные анализы⁴. Ранее мы разработали простой, основанный на люминесценции, высокопроизводительный анализ для мониторинга активности ATG4B в клетках ^8,17. В этом анализе используется белок люциферазы из Gaussia princeps (GLUC), который стабилен и активен во внеклеточной среде и может быть индуцированно высвобожден из клеток в ответ на протеолитическую активность ATG4B^18,19.

В этой репортерной конструкции dNGLUC связан с актиновым цитоскелетом клеток. Между β-актиновым якорем и dNGLUC может быть введен протеаза-специфический линкер, что делает секрецию зависимой от расщепления линкера. Мы использовали полноразмерную открытую рамку считывания LC3B между β-актином и dNGLUC, чтобы иметь возможность контролировать расщепление LC3B^17,18,19. Хотя механизм секреции dNGLUC плохо изучен, он специфичен для мониторинга активности ATG4B, не зависит от общей аутофагии, как это происходит в нокаут-клетках ATG5, и опосредован нетрадиционными механизмами, не требующими классического сигнального пептида ^4,18,19. Мы успешно использовали этот репортер для скрининга малых молекул и библиотек миРНК, а также идентифицировали новые регуляторы активности ATG4B, такие как протеинкиназы^{Akt 8}. В этой статье описывается подробный протокол использования этого репортера люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга с высокой пропускной способностью.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс анализа показан на рисунке 1. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и оборудованием, используемыми в этом протоколе.

1. Производство ретровирусов

ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмидой, кодирующей ActinLC3dNGLUC, является pMOWS-ActinLC3dNGLUC²⁰. Для производства вируса с высоким титром используйте малое число пассажей клеток (в идеале меньше, чем P20).

1. Культивирование клеток HEK293T в модифицированной орлиной среде (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина (P/S) при 37 °C во влажном инкубаторе с атмосферой 5%_CO2 до их слияния на 80%-90% перед посевом для трансфекции.
2. За сутки до трансфекции высевают клетки в 6-луночный планшет с плотностью 1 × 10⁶ клеток/лунку в 2 мл/лунку полной питательной среды. Инкубируют тарелку в течение ночи в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5%_СО2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям производителя при использовании реагента для трансфекции на липосомальной основе. Этот протокол описывает использование реагента на нелипосомальной основе. Перед началом трансфекции дайте реагенту для трансфекции ДНК, ДНК и среде уравновеситься до комнатной температуры (~15 мин).
3. Для каждой трансфекции добавляйте 200 мкл безсывороточной среды в пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл. В каждую пробирку добавьте следующее количество плазмид: 1 000 нг pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 нг GagPol; 100 нг VSV-G.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество плазмид и объем среды, указанные здесь, относятся к 12-луночной планшету. При использовании планшета другого типа отрегулируйте объем среды и количество плазмиды для достижения конечной концентрации 5 нг/мкл плазмиды переноса, 4,5 нг/мкл плазмиды упаковки и 0,5 нг/мкл плазмиды оболочки. Используйте любую упаковочную плазмиду, содержащую гены, экспрессирующие gag и pol, и любую плазмиду оболочки, содержащую ген, экспрессирующий VSV-G.
4. Встряхните флакон с реагентом для трансфекции ДНК в течение 30 с. Пипеткой 4 мкл реагента для трансфекции вводят непосредственно в среду, содержащую разбавленную ДНК. Аккуратно перемешайте, осторожно наклоняя тюбик.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь кончиками к стенкам пластиковых трубок. Не поднимайте и не опускайте пипетки и не вихрите.
5. Инкубируйте реакцию в течение 15 минут при комнатной температуре.
6. Во время инкубации реакции удалите старую среду из 6-луночного планшета и замените ее 2 мл/лунку свежей среды, не содержащей сыворотки.
7. Добавляйте каждый трансфекционный комплекс в каждую лунку по каплям.
8. Осторожно встряхните или покрутите пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение по всей поверхности лунки.
9. Инкубируют планшет в течение ночи при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5%_СО2.
10. Через 24 ч старую среду заменить свежей полной средой (2 мл/лунку) и вернуть клетки обратно в увлажненный инкубатор с атмосферой 5%_{СО2 в течение 72} ч.
11. Через 72 ч соберите надосадочную жидкость в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте в течение 10 мин при 4 000 × г при 4 °C для удаления мертвых клеток и мусора. Для дальнейшей очистки используйте большой шприц объемом 60 мл, чтобы пропустить надосадочную жидкость через фильтр 0,20 мкм. Немедленно приготовьте одноразовые аликвоты объемом 300 мкл и храните при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте цикла замораживания-оттаивания, чтобы поддерживать максимальную активность продукта.

2. Ретровирусная трансдукция

1. За день до трансдукции клеток высевают клетки-мишени средней плотности (PANC1 при 1 × 10 5 клеток/лунку) в 12-луночный планшет в 1 мл/лунку среды с добавлением 10% FBS и 1% P/S. Инкубируют планшет в течение ночи при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой⁵ % CO₂.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшая плотность клеток должна быть определена заранее, так как разные типы клеток имеют разную способность к прикреплению. В идеале используйте плотность ячеек для получения 40%-50% слияния.
2. Извлеките замороженные аликвоты ретровируса из морозильной камеры с температурой -80 °C и разморозьте на льду перед каждым использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не замораживайте повторно неиспользованные аликвоты.
3. В конической пробирке объемом 50 мл приготовьте смесь вирусной надосадочной жидкости и полибрена в конечной концентрации 8 мкг/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие объемы относятся к трансдукции 12-луночного планшета, содержащего конечный объем 500 мкл/лунка. Окончательный объем вирусной надосадочной жидкости может быть оценен путем тестирования ряда вирусных разведений в присутствии полибрена. Можно использовать более высокие или более низкие разведения в зависимости от желаемых уровней экспрессии трансгена и размера используемого сосуда.
4. Удалите старую среду из 12-луночной пластины и добавьте 500 мкл смеси в каждую лунку. Инкубируют клетки с вирусной надосадочной жидкостью в течение ночи при температуре 37 °C во влажном инкубаторе с атмосферой 5%_СО2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите две лунки с полной средой (без вирусной надосадочной жидкости) для использования в качестве контроля для отбора.
5. Замените вируссодержащую среду свежей полной питательной средой (1 мл/лунку). Поместите клетки обратно в увлажненный инкубатор с атмосферой 5%_СО2 на 48 ч.

3. Объединенный отбор и поддержание популяции

1. Замените питательную среду селективной средой (полная питательная среда с конечной концентрацией пуромицина 1 мкг/мл). Следите за ростом клеток и меняйте субстратик каждые 2-3 дня. При слиянии расширяют в чашку с 6 лунками, а затем в чашку для культуры тканей диаметром 10 см.
2. Держите клетки в селективной среде, по крайней мере, до тех пор, пока контрольные (нетрансдуцированные) клетки полностью не погибнут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения успешных результатов рекомендуется определить оптимальные концентрации пуромицина до начала экспериментального проекта. Для этого постройте кривую убийства пуромицина, чтобы определить минимальную концентрацию, необходимую для уничтожения нетрансдуцированных клеток в период от 3 до 10 дней.
3. После того, как клетки будут выращены в селекционной среде, разверните клетки на полную питательную среду и заморозьте исходные аликвоты для экспериментального проекта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите номер прохода и избегайте работы с объединенными популяциями из замороженного поголовья с номерами проходов выше пяти. Перед проведением анализа регулярно проверяйте наличие микоплазменного загрязнения. В идеале перед каждым анализом следует использовать свежую партию клеток, чтобы получить максимальный сигнал люциферазы.
4. Поддерживайте клетки в селективной среде и засейте достаточное количество клеток, чтобы достичь желаемой плотности за день до анализа.

4. Составное сложение

ПРИМЕЧАНИЕ: Библиотека малых молекул Selleckchem состоит примерно из 4000 соединений, расположенных в восемь рядов и 10 столбцов в пятидесяти 96-луночных планшетах с концентрацией 10 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО).

1. Эквивалент 30 мкл соединения в соответствующую лунку планшета-источника, совместимого с наноразмерным акустическим дозатором жидкости. Используйте полипропиленовую пластину на 384 лунки (пластина 384PP). Храните эти пластины запечатанными и храните при температуре -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол скрининга, описанный здесь, рассчитан в общей сложности на 10 пробирных планшетов в день; фиксированная концентрация 10 мкМ использовалась в качестве окончательной концентрации анализа вместе с 24-часовым инкубационным периодом.
2. Разморозьте библиотечные пластины при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что тарелка полностью разморожена и уравновешена до комнатной температуры. Температурный градиент на пластине может повлиять на работу с жидкостью.
3. Дозируйте 50 нл/лунку в 384-луночный планшет с помощью наноразмерного акустического дозатора жидкости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что выбранные в программе исходные и конечные пластины совпадают с теми, которые использовались для этого шага.
4. Создайте программу дозирования в электронной таблице.
5. Откройте программное обеспечение.
6. Откройте новый протокол. На вкладке «Протокол » выберите следующие параметры: Формат образца планшета, 384PP; Тип образца пластины, 384PP_DMSO2; и тип целевой пластины, CellCarrier-384 Ultra PN (Рисунок 2A).
7. В разделе Pick List (Список выбора) выберите опцию импорта (рис. 2B), чтобы импортировать электронную таблицу, содержащую программу дозирования (рис. 2C).
8. Выберите опцию Run protocol (рисунок 2D), проверьте правильность отображаемой информации и нажмите кнопку Run.
9. В новом окне под названием Run status (Состояние выполнения) (рисунок 2E) нажмите Start (Пуск) и следуйте инструкциям, отображаемым в окнах приглашений (Рисунок 2F,G).

5. Посев клеток

1. Трипсинизацию клеток из колбы для клеточных культур или чашек Петри для клеточных культур и нейтрализуют трипсин, добавляя ФБС-содержащие среды.
2. Переложите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугу при 390 × г на 5 мин при комнатной температуре. Затем осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл полной питательной среды.
3. Выполните подсчет ячеек.
4. Готовят клеточную суспензию с 4,6 × 10⁷ клеток в 230 мл полной питательной среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем и плотность клеток указаны для 10 384-луночных планшетов плюс мертвый объем из двух 384-луночных планшетов.
5. Дозируют 50 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 384-луночного планшета, приготовленного в разделе 4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Посев клеток можно выполнять как вручную, так и с помощью дозатора сыпучих материалов.
6. Клетки инкубируют при 37 °С в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5%_СО2 в течение 24 ч.

6. Получение клеточной надосадочной жидкости

ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая здесь роботизированная платформа для работы с жидкостями выполняет работу с жидкостями с помощью многоканального манипулятора на 96 наконечников. Если автоматизация работы с жидкостями недоступна, протокол можно адаптировать к формату с низкой пропускной способностью с помощью многоканальных пипеток.

1. Сконфигурируйте рабочую станцию автоматизации лаборатории, как показано на рисунке 3.
2. Поместите одноразовую стопку с 96 наконечниками в положение P1 (Рисунок 3A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая стопка из 96 наконечников состоит из восьми одноразовых стоек. При использовании многоканального манипулятора для 96-луночных наконечников 384-луночный планшет разделен на четыре квадранта. Таким образом, каждой стопки наконечников достаточно для переноса надосадочной жидкости из двух пробирных планшетов в две пустые, сплошные черные 384-луночные планшеты. Весь пакет наконечников необходимо заменять после каждого прогона двух пластин.
3. Установите пробирные планшеты в положения P2 и P4 (Рисунок 3A).
4. Поместите пустые, сплошные черные 384-луночные планшеты в положения P3 и P5 (Рисунок 3A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта гибкая и функциональная роботизированная платформа была адаптирована для этого анализа, и была написана специальная программа (рис. 3B).
5. Получите подсказки из позиции P1.
6. Аспирировать 10 мкл надосадочной жидкости из планшета в положении P2 и перенести в пустую сплошную черную пластину в положении P3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечники должны быть расположены на соответствующей глубине внутри лунок для аспирации надосадочной жидкости, не нарушая монослой клеток на дне лунки.
7. Опустите наконечники в отходы в положение P6 (Рисунок 3A).
8. Повторите шаги 6.5-6.7 для остальных лунок пластины в положении Р2, а затем повторите те же действия для перевода надосадочной жидкости из положения Р4 в положение Р5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно соберите надосадочную жидкость и распределите ее по соответствующим лункам в пустую сплошную черную пластину (Рисунок 3C, D). Поскольку секретируемый dNGLUC очень стабилен в среде клеточной культуры, планшеты можно запечатать и хранить до 7 дней при 4 °C в темноте.

7. Люциферазный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: dNGLUC, используемый в репортере, демонстрирует кинетику вспышки с быстрым затуханием сигнала. Из-за быстрого затухания люминесценции после добавления субстрата (целентеразина) планшетный ридер должен быть настроен на измерение сигнала люминесценции в надосадочной жидкости; Закачивайте субстрат в лунку и считывайте ее через несколько секунд. По этой причине используйте планшетный считыватель, способный контролировать люминесценцию и оснащенный инжектором подложки, чтобы гарантировать, что время между этапами впрыска и считывания будет одинаковым для всех образцов. Настройки, используемые на считывателе пластин, можно найти на рисунке 4.

1. Готовят нативный коэлентеразин в виде исходного раствора 1 мг/мл в подкисленном метаноле (от 10 мкл 3 М HCl до 1 мл метанола).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте местным рекомендациям по охране труда и технике безопасности при обращении с метанолом в лаборатории и избегайте контакта с кожей. Перед началом анализа приготовьте свежий рабочий раствор субстрата.
2. Инициализируйте инжекторный насос (Рисунок 5A).
3. Промойте трубку деионизированной водой (Рисунок 5B-D).
4. Промойте трубку метанолом.
5. При промывке трубки приготовьте рабочий раствор субстрата, разбавив субстрат 1:100 (для одной 384-луночной планшета добавьте 220 мкл из исходного раствора субстрата в 21,8 мл 1x фосфатно-солевого буфера [PBS]).
6. Промойте насосно-компрессорные трубки рабочим раствором субстрата (рисунок 5B-D).
7. Загрузите пластину в считыватель и запустите измерение, используя настройки, описанные на рисунке 4.
8. Повторите шаги 7.6-7.7 для всех пробирных планшетов.
9. После того, как все пробирные планшеты будут готовы, промойте трубки метанолом.
10. Промойте трубку деионизированной водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конце этого шага получаются необработанные значения люциферазы, которые коррелируют с клеточной активностью ATG4B. Для нормализации до номеров клеток необходимы следующие шаги, подсчет количества клеток в каждой лунке с помощью флуоресцентной микроскопии.

8. Фиксация и окрашивание клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно выполнить вручную с помощью многоканальной пипетки или с помощью дозатора для сыпучих материалов.

1. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом (в 1x PBS) в течение 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте местным рекомендациям по охране труда и технике безопасности при обращении с параформальдегидом в лаборатории и избегайте контакта с кожей. По возможности выполняйте этот шаг в защитном кожухе.
2. Постирайте три раза с 1 x PBS.
3. Окрасьте ядра препаратом Hoechst 33342, разбавленным 1:5 000 в 1x PBS, в течение 15 минут.
4. Постирайте три раза с 1 x PBS.

9. Получение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте получение изображения с помощью автоматизированного микроскопа. В качестве альтернативы получению изображений для определения количества клеток также может быть определена внутриклеточная активность люциферазы. Существуют преимущества и недостатки в отношении того, нормализуется ли количество клеток или внутриклеточная активность люциферазы, что обсуждается ниже. Мы обнаружили, что определение количества клеток является менее инвазивным и приводит к меньшей вариабельности, чем определение внутриклеточных значений люциферазы.

1. Запустите операционное программное обеспечение микроскопа (рисунок 6).
2. На вкладке "Настройка " выберите правильный стандартный тип пластины. Если тип пластины не задан, введите размеры пластины вручную.
3. Загрузите планшет в микроскоп, нажав на опцию «Извлечь и загрузить ».
4. Затем выберите объектив 20x Air (числовая апертура [NA]: 0,4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что воротник объектива установлен на правильное значение, что обеспечивает правильную фокусировку на различных типах пластин.
5. В разделе «Выбор канала» выберите Hoechst 33342.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки канала по времени, мощности и высоте должны быть оптимизированы в соответствии с типом используемой пластины.
6. В окне "Определить компоновку" выберите все лунки из пластины и четыре поля из колодки.
7. В разделе «Онлайн-задания» выберите соответствующую папку для передачи данных в аналитическое программное обеспечение.

10. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Любое программное обеспечение для анализа изображений может быть использовано для сегментации и подсчета клеточных ядер по полученным изображениям. Здесь мы опишем шаги по использованию специального онлайн-программного обеспечения, совместимого с несколькими файлами автоматических микроскопов.

1. Запустите программное обеспечение для анализа изображений.
2. Перейдите на вкладку Image Analysis , чтобы начать сегментацию изображения (рисунок 7A).
3. На вкладке Input Image нажмите на знак + , чтобы добавить новый стандартный блок (рисунок 7A).
4. В списке выберите опцию Find Nuclei (рисунок 7A) и выберите Hoechst 33342 в качестве опции канала (рисунок 7B).
5. Визуально осмотрите сегментированные объекты на изображении и выберите наиболее точный метод сегментации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента мы использовали метод C (рис. 7C). Каждый вариант метода имеет подкатегории, которые можно настроить для получения наилучшей сегментации.
6. Затем перейдите на вкладку Define Results (рисунок 7C) и выберите Standard Output в качестве опции Method .
7. В подкатегории выберите Nuclei-number of objects и Object count (рисунок 7C).
8. Сохраните конвейер анализа с помощью параметра Сохранить анализ на диск или Сохранить анализ в базе данных .
9. На вкладке Пакетный анализ выберите данные для анализа из дерева.
10. В разделе Метод выберите конвейер анализа, сохраненный на шаге 10.8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно загрузить файл скрипта из-за пределов указанного программного обеспечения или загрузить существующий анализ, сохраненный в базе данных.
11. Нажмите кнопку Run Analysis , чтобы начать анализ (рисунок 7D). В конце этого рабочего процесса генерируются два набора данных: необработанные значения люциферазы из надосадочной жидкости и номер ячейки в каждой лунке. Используйте оба для нормализации значения люциферазы на клетку.

Результаты

В предыдущей публикации⁸ мы успешно использовали этот анализ для скрининга библиотек малых молекул и миРНК и идентифицировали новые регуляторы ATG4B. Здесь мы опишем протокол и репрезентативные результаты этого репортера люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга ?...

Обсуждение

Этот протокол описывает клеточный анализ репортерных генов для идентификации ингибиторов ATG4B. Идентификация первичных попаданий основана на активности люциферазы при обработке клеток, экспрессирующих полноразмерную открытую рамку считывания LC3B между β-актином и dNGLUC. Некоторые преи?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)	Tecan	30038609	Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFlo	BioTek		bulk dispenser
Coelenterazine	Santa Cruz Biotechnology	sc-205904	substrate
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Version 2.9.1	image analysis software
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile	Beckman Coulter	001-14555	384PP plate
EnVision II	Perkin Elmer		luminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL	Selleckchem	L3600	Selleckchem
FMK9A	MedChemExpress	HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates	Greiner Bio-One	781076	solid-black 384-well plates
Harmony Imaging software	Perkin Elmer	Version 5.1	imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570	Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software	Labcyte/Beckman Coulter		nanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q water			deionized water
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer		automated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids	Perkin Elmer	6057300	CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC			Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck	TR-1003-G	polybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher	J61278.ME	Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot	Tecan		liquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche	Merck	6366244001	DNA transfection reagent