Criblage de médicaments cellulaires pour les inhibiteurs de la cystéine 4B peptidase liée à l’autophagie

Résumé

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’utilisation d’un test rapporteur à base de luciférase dans un format de criblage semi-automatisé à haut débit.

Résumé

De plus en plus de preuves ont montré qu’un flux autophagique élevé est lié à la progression tumorale et à la résistance au traitement anticancéreux. Le dosage des protéines d’autophagie individuelles est une condition préalable aux stratégies thérapeutiques ciblant cette voie. Il a été démontré que l’inhibition de la protéase de l’autophagie ATG4B augmente la survie globale, ce qui suggère que l’ATG4B pourrait être une cible médicamenteuse potentielle pour le traitement du cancer. Notre laboratoire a mis au point un test sélectif à base de luciférase pour le suivi de l’activité de l’ATG4B dans les cellules. Pour ce test, le substrat d’ATG4B, LC3B, est marqué à l’extrémité C avec une luciférase sécrétée du copépode marin Gaussia princeps (GLUC). Ce rapporteur est lié au cytosquelette d’actine, le maintenant ainsi dans le cytoplasme des cellules lorsqu’il n’est pas clivé. Le clivage médié par l’ATG4B entraîne la libération de GLUC par sécrétion non conventionnelle, qui peut ensuite être surveillée en récoltant des surnageants de culture cellulaire en tant que corrélat de l’activité cellulaire de l’ATG4B. Cet article présente l’adaptation de ce test à base de luciférase au criblage automatisé à haut débit. Nous décrivons le flux de travail et l’optimisation pour une analyse exemplaire à haut débit de l’activité cellulaire ATG4B.

Introduction

L’autophagie est un processus métabolique conservé qui permet aux cellules de maintenir l’homéostasie intracellulaire et de répondre au stress en dégradant le contenu cellulaire vieilli, défectueux ou inutile via les lysosomes ^1,2,3. Dans certaines conditions physiopathologiques, ce processus agit comme une réponse cellulaire cruciale à la privation de nutriments et d’oxygène, ce qui se traduit par le recyclage des nutriments et des lipides, permettant aux cellules de s’adapter à leurs besoins métaboliques ^2,3,4. L’autophagie a également été identifiée comme une réponse cellulaire au stress liée à plusieurs maladies, telles que les troubles neurodégénératifs, les infections pathogènes et divers types de cancer. La fonction de l’autophagie dans le cancer est complexe et dépend du type, du stade et de l’état de la tumeur. Il peut supprimer la tumorigenèse par dégradation autophagique des cellules endommagées, mais peut également favoriser la survie des tumeurs avancées en améliorant la survie des cellules dans des conditions stressantes, telles que l’hypoxie, la privation de nutriments et les dommages cytotoxiques 2,4,5,6.

Plusieurs études ont montré que l’inhibition de l’autophagie offre un avantage en tant que stratégie anticancéreuse. Ainsi, l’inhibition d’étapes critiques, telles que la formation de l’autophagosome ou sa fusion avec le lysosome, pourrait être une méthode efficace pour le contrôle du cancer 2,4,5,6. De plus en plus de preuves ont montré que l’ATG4B est impliqué dans certaines conditions pathologiques, et il a attiré l’attention en tant que cible anticancéreuse potentielle ^2,3,4. Par exemple, il a été observé que les cellules cancéreuses colorectales et les cellules cancéreuses du sein positives pour le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2) avaient des niveaux d’expression d’ATG4B significativement plus élevés que les cellules normales adjacentes ^2,4. Dans les cellules cancéreuses de la prostate, l’inhibition de l’ATG4B a entraîné une susceptibilité spécifique de la lignée cellulaire à la chimiothérapie et à la radiothérapie⁷. Récemment, des preuves solides ont émergé que l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est particulièrement vulnérable à l’inhibition de l’ATG4B. Par exemple, dans un modèle murin génétiquement modifié, il a été démontré que la perte intermittente de la fonction ATG4B réduit la croissance tumorale de la PDAC et augmente la survie ^3,4. Dans l’ensemble, l’ATG4B est fortement surexprimé dans certains types de cancer, est lié à la progression de la tumeur et est lié à la résistance au traitement anticancéreux ^2,4,8.

Les protéases de cystéine ATG4 chez les mammifères ont quatre membres de la famille, ATG4A-ATG4D. Ces protéines présentent une certaine sélectivité vis-à-vis de la famille des protéines LC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 et peuvent avoir des fonctions supplémentaires non liées à leur activité protéase^12,13. De plus, l’ATG4 fonctionne dans la régulation d’un nouveau type de modification post-traductionnelle, l’ATG8-ylation des protéines^11,12. Alors que l’ATG4B et son substrat principal LC3B sont les plus étudiés, une image émerge qui suggère un rôle complexe pour chaque membre de la sous-famille dans la régulation des processus autophagiques et non autophagiques. Ceci est en outre corroboré par un réseau complexe de modifications post-traductionnelles qui régulent l’activité de l’ATG4B via la phosphorylation, l’acétylation, la glycosylation et la nitrosylation 9,10,11,12,13.

Plusieurs inhibiteurs connus de l’ATG4B ont été publiés 2,4,14,15. Bien qu’ils conviennent comme outils de recherche, leur profil pharmacodynamique, leur sélectivité ou leur puissance les ont encore empêchés de se développer en tant que candidats précliniques ^4,16. Dans l’ensemble, il est urgent d’identifier des composés plus puissants et plus sélectifs. Souvent, les composés sont de bons inhibiteurs biochimiques de la fonction des protéines, mais leur efficacité dans les tests cellulaires est médiocre. Il existe plusieurs tests pour surveiller l’activité de l’ATG4B, y compris des méthodes biochimiques et des tests cellulaires⁴. Nous avons précédemment développé un test simple, basé sur la luminescence et à haut débit, pour surveiller l’activité de l’ATG4B dans les cellules ^8,17. Ce test utilise une protéine luciférase de Gaussia princeps (GLUC) qui est stable et active dans le milieu extracellulaire et peut être libérée de manière inductive par les cellules en réponse à l’activité protéolytique ATG4B^18,19.

Dans cette construction rapporteure, dNGLUC est lié au cytosquelette d’actine des cellules. Un agent de liaison spécifique de la protéase peut être introduit entre l’ancre β-actine et le dNGLUC, ce qui rend la sécrétion dépendante du clivage du liant. Nous avons utilisé le cadre de lecture ouvert sur toute la longueur de la LC3B entre la β-actine et le dNGLUC, afin de pouvoir surveiller le clivage de la LC3B^17,18,19. Bien que le mécanisme de sécrétion de dNGLUC soit mal compris, il est spécifique pour le suivi de l’activité de l’ATG4B, ne dépend pas de l’autophagie globale telle qu’elle se produit dans les cellules knock-out de l’ATG5, et est médié par des mécanismes non conventionnels qui ne nécessitent pas de peptide signal classique 4,18,19. Nous avons utilisé avec succès ce rapporteur pour cribler de petites molécules et des banques de siRNA, et avons identifié de nouveaux régulateurs de l’activité de l’ATG4B, tels que les protéines kinases^{Akt 8}. Cet article décrit un protocole détaillé pour l’utilisation de ce rapporteur de luciférase dans un format de criblage semi-automatisé à haut débit.

Protocole

REMARQUE : Le processus d’analyse est décrit à la figure 1. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.

1. Production de rétrovirus

NOTE : Le plasmide codant pour l’ActinLC3dNGLUC est pMOWS-ActinLC3dNGLUC²⁰. Utilisez un nombre de cellules à faible passage pour la production de virus à titre élevé (idéalement inférieur à P20).

1. Cultiver des cellules HEK293T dans le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S) à 37 °C dans un incubateur humidifié, avec une atmosphère de 5 % de CO₂ jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 80 % à 90 % avant d’être ensemencées pour la transfection.
2. La veille de la transfection, ensemencer les cellules dans une plaque à 6 puits à une densité de 1 × 10⁶ cellules/puits dans 2 mL/puits de milieu de culture complet. Incuber la plaque pendant une nuit dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO₂.
   REMARQUE : Suivez les instructions du fabricant si vous utilisez un réactif de transfection à base liposomale. Ce protocole décrit l’utilisation d’un réactif non liposomal. Avant de commencer la transfection, laissez le réactif de transfection d’ADN, l’ADN et le milieu s’équilibrer à température ambiante (~15 min).
3. Pour chaque transfection, ajouter 200 μL de milieu sans sérum dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Dans chaque tube, ajouter les quantités suivantes de plasmides : 1 000 ng de pMOWS-ActinLC3dNGLUC ; 900 ng de GagPol ; 100 ng de VSV-G.
   REMARQUE : La quantité de plasmides et le volume de milieux indiqués ici sont pour une plaque à 12 puits. Si vous utilisez un autre type de plaque, ajustez le volume du milieu et les quantités de plasmide pour atteindre la concentration finale de 5 ng/μL de plasmide de transfert, 4,5 ng/μL de plasmide d’emballage et 0,5 ng/μL de plasmide d’enveloppe. Utilisez n’importe quel plasmide d’emballage qui contient des gènes exprimant Gag et Pol, et tout plasmide d’enveloppe qui contient le gène exprimant VSV-G.
4. Vortex le flacon de réactif de transfection d’ADN pendant 30 s. Pipeter 4 μL du réactif de transfection directement dans le milieu contenant l’ADN dilué. Mélangez délicatement en basculant doucement le tube.
   REMARQUE : Ne touchez pas les parois des tubes en plastique avec les embouts. Ne pas pipeter de haut en bas ou de vortex.
5. Incuber la réaction pendant 15 min à température ambiante.
6. Pendant l’incubation de la réaction, retirez l’ancien milieu de la plaque à 6 puits et remplacez-le par 2 mL/puits de milieu frais sans sérum.
7. Ajouter chaque complexe de transfection à chaque puits de manière goutte à goutte.
8. Secouez ou faites tourner doucement la plaque pour assurer une répartition uniforme sur toute la surface du puits.
9. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO₂.
10. Après 24 h, remplacer l’ancien milieu par un milieu complet frais (2 mL/puits) et remettre les cellules dans l’incubateur humidifié avec une atmosphère de 5 % de CO₂ pendant 72 h.
11. Après 72 h, récolter le surnageant dans un tube conique de 50 mL et centrifuger pendant 10 min à 4 000 × g à 4 °C pour éliminer les cellules mortes et les débris. Pour une purification plus poussée, utilisez une grande seringue de 60 ml pour faire passer le surnageant à travers un filtre de 0,20 μm. Préparer immédiatement des aliquotes à usage unique de 300 μL et les conserver à -80 °C.
    REMARQUE : Évitez un cycle de gel-dégel pour maintenir une activité maximale du produit.

2. Transduction rétrovirale

1. La veille de la transduction des cellules, ensemencer les cellules cibles à densité moyenne (PANC1 à 1 × 10 5 cellules/puits) dans une plaque de 12 puits dans 1 mL/puits de milieu supplémenté en 10 % de FBS et 1 % de P/S. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de⁵ % de CO₂.
   REMARQUE : La meilleure densité cellulaire doit être établie à l’avance, car différents types de cellules ont des capacités de fixation différentes. Idéalement, utilisez une densité cellulaire pour obtenir une confluence de 40 % à 50 %.
2. Retirer les aliquotes de rétrovirus congelées du congélateur à -80 °C et les décongeler sur glace avant chaque utilisation.
   REMARQUE : Ne pas recongeler les aliquotes inutilisées.
3. Dans un tube conique de 50 mL, préparer un mélange de surnageant viral et de polybrène à une concentration finale de 8 μg/mL.
   NOTA : Les volumes suivants s’appliquent à la transduction d’une plaque à 12 puits contenant un volume final de 500 μL/puits. Le volume final du surnageant viral peut être estimé en testant une gamme de dilutions virales en présence de polybrène. Des dilutions plus ou moins élevées peuvent être utilisées en fonction des niveaux d’expression souhaités du transgène et de la taille du vaisseau utilisé.
4. Retirez l’ancien milieu de la plaque à 12 puits et ajoutez 500 μL du mélange dans chaque puits. Incuber les cellules avec le surnageant viral pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO₂.
   REMARQUE : Conservez deux puits avec un milieu complet (pas de surnageant viral) pour les utiliser comme témoin de la sélection.
5. Remplacer le milieu contenant le virus par un milieu de culture complet frais (1 ml/puits). Replacer les cellules dans l’incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO₂ pendant 48 h.

3. Sélection et maintien de la population groupée

1. Remplacer le milieu de culture par un milieu de sélection (milieu de culture complet avec une concentration finale de 1 μg/mL de puromycine). Surveillez la croissance des cellules et changez le milieu de sélection tous les 2-3 jours. À la confluence, étendez-le dans une boîte à 6 puits, puis dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm de diamètre.
2. Conservez les cellules dans le milieu de sélection au moins aussi longtemps qu’il le faut pour que les cellules témoins (non transduites) meurent complètement.
   REMARQUE : Pour obtenir de bons résultats, il est recommandé de déterminer les concentrations optimales de puromycine avant de lancer le projet expérimental. Pour cela, générez une courbe de destruction de la puromycine afin de déterminer la concentration minimale requise pour tuer les cellules non transduites entre 3 et 10 jours.
3. Une fois que les cellules se développent dans le milieu de sélection, étendre les cellules sur un milieu de culture complet et congeler les aliquotes pour le projet expérimental.
   NOTA : Noter le numéro de passage et éviter de travailler avec des populations regroupées provenant de stocks congelés dont le numéro de passage est supérieur à cinq. Vérifiez régulièrement la contamination par les mycoplasmes avant d’effectuer le test. Idéalement, utilisez un lot de cellules fraîches avant chaque test pour obtenir le signal maximal de luciférase.
4. Maintenir les cellules dans un milieu de sélection et ensemencer suffisamment de cellules pour atteindre la densité désirée la veille de l’essai.

4. Addition de composés

REMARQUE : La bibliothèque de petites molécules de Selleckchem se compose d’environ 4 000 composés disposés en huit rangées et 10 colonnes dans cinquante plaques de 96 puits à une concentration de 10 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).

1. Aliquote 30 μL de composé dans le puits approprié d’une plaque source compatible avec un distributeur de liquide acoustique à l’échelle nanométrique. Utilisez une plaque en polypropylène à 384 puits (plaque 384PP). Conservez ces plaques scellées et stockées à -20 °C.
   REMARQUE : Le protocole de dépistage décrit ici est pour un total de 10 plaques d’analyse par jour ; une concentration fixe de 10 μM a été utilisée comme concentration finale ainsi qu’une période d’incubation de 24 h.
2. Décongeler les plaques de la bibliothèque composée à température ambiante.
   REMARQUE : Assurez-vous que la plaque est complètement décongelée et équilibrée à température ambiante. Un gradient de température à travers la plaque peut affecter la manipulation des liquides.
3. Distribuer 50 nL/puits dans une plaque d’analyse de 384 puits à l’aide d’un distributeur de liquide acoustique à l’échelle nanométrique.
   REMARQUE : Assurez-vous que les plaques source et de destination sélectionnées dans le programme correspondent à celles utilisées pour cette étape.
4. Créez un programme de distribution sur une feuille de calcul.
5. Ouvrez le logiciel.
6. Ouvrez un nouveau protocole. Dans l’onglet Protocole , sélectionnez les options suivantes : Format de la plaque d’échantillonnage, 384PP ; Type de plaque d’échantillonnage, 384PP_DMSO2 ; et Type de plaque de destination, CellCarrier-384 Ultra PN (Figure 2A).
7. Sous Liste de sélection, sélectionnez l’option d’importation (Figure 2B) pour importer la feuille de calcul contenant le programme de distribution (Figure 2C).
8. Sélectionnez l’option Exécuter le protocole (Figure 2D), vérifiez si les informations affichées sont correctes, puis cliquez sur Exécuter.
9. Dans la nouvelle fenêtre intitulée État de l’exécution (Figure 2E), cliquez sur Démarrer et suivez les étapes affichées dans les fenêtres d’invite (Figure 2F,G).

5. Ensemencement cellulaire

1. Trypsiniser les cellules à partir d’une fiole de culture cellulaire ou d’une boîte de Pétri de culture cellulaire et neutraliser la trypsine en ajoutant un milieu contenant du FBS.
2. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 390 × g pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, retirez délicatement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu de culture complet.
3. Effectuez le comptage des cellules.
4. Préparer la suspension cellulaire avec 4,6 × 10⁷ cellules dans 230 mL de milieu de culture complet.
   REMARQUE : Ce volume et cette densité de cellules sont pour 10 plaques d’essai de 384 puits plus un volume mort de deux plaques de 384 puits.
5. Verser 50 μL de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque d’essai de 384 puits, préparée dans la section 4.
   REMARQUE : L’ensemencement des cellules peut être effectué manuellement ou à l’aide d’un distributeur en vrac.
6. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO₂ pendant 24 h.

6. Récolte du surnageant cellulaire

REMARQUE : La plate-forme robotique de manipulation de liquides utilisée ici effectue la manipulation de liquides avec un bras multicanal pour 96 pointes. Si aucune automatisation de la manipulation des liquides n’est disponible, le protocole peut être adapté au format à faible débit en utilisant des pipettes multicanaux.

1. Configurez la plate-forme du poste de travail d’automatisation de laboratoire comme illustré à la figure 3.
2. Placez la pile jetable de 96 embouts sur la position P1 (Figure 3A).
   REMARQUE : Chaque pile de 96 pointes est formée de huit racks jetables. Lors de l’utilisation d’un bras multicanal pour 96 pointes, la plaque de 384 puits est divisée en quatre quadrants. Ainsi, chaque pile de pointes est suffisante pour transférer le surnageant de deux plaques d’essai dans deux plaques vides, noires pleines, de 384 puits. L’ensemble de la pile de pointes doit être remplacé après chaque série de deux plaques.
3. Placez les plaques d’essai sur les positions P2 et P4 (Figure 3A).
4. Placez les plaques noires pleines de 384 puits sur les positions P3 et P5 (Figure 3A).
   NOTE : Cette plate-forme robotique flexible et performante a été adaptée pour ce test et un programme spécial a été rédigé (Figure 3B).
5. Obtenez les conseils de la position P1.
6. Aspirer 10 μL de surnageant de la plaque en position P2 et transférer dans la plaque noire unie vide en position P3.
   REMARQUE : Les pointes doivent être positionnées à une profondeur appropriée à l’intérieur des puits pour aspirer le surnageant sans perturber la monocouche cellulaire au fond du puits.
7. Déposez les embouts dans les déchets en position P6 (Figure 3A).
8. Répétez les étapes 6.5 à 6.7 pour les puits restants de la plaque en position P2, puis répétez les mêmes étapes pour transférer le surnageant de la position P4 à la position P5.
   REMARQUE : Assurez-vous de recueillir le surnageant et de le distribuer sur les puits correspondants dans la plaque noire unie vide (Figure 3C,D). Comme le dNGLUC sécrété est très stable dans le milieu de culture cellulaire, les plaques peuvent être scellées et conservées jusqu’à 7 jours à 4 °C dans l’obscurité.

7. Test de la luciférase

REMARQUE : Le dNGLUC utilisé dans le rapporteur présente une cinétique de flash avec une décroissance rapide du signal. En raison de la décroissance rapide de la luminescence après l’ajout de substrat (cœlentérazine), le lecteur de plaques doit être réglé pour mesurer le signal de luminescence dans les surnageants ; Injectez le substrat dans un puits et lisez-le bien après quelques secondes. Pour cette raison, utilisez un lecteur de plaques capable de surveiller la luminescence et équipé d’un injecteur de substrat pour vous assurer que le temps entre les étapes d’injection et de lecture sera uniforme pour tous les échantillons. Les réglages utilisés sur le lecteur de plaques sont illustrés à la figure 4.

1. Préparer la cœlenérazine native sous forme de solution mère de 1 mg/mL dans du méthanol acidifié (10 μL de HCl 3 M pour 1 mL de méthanol).
   REMARQUE : Suivez les directives locales en matière de santé et de sécurité concernant la manipulation du méthanol en laboratoire et évitez tout contact avec la peau. Préparez la solution de substrat de travail fraîche avant de commencer le dosage.
2. Initialisez la pompe d’injection (Figure 5A).
3. Rincez le tube avec de l’eau déminéralisée (Figure 5B-D).
4. Rincez le tube avec du méthanol.
5. Pendant le rinçage du tube, préparez la solution de substrat de travail en diluant le substrat 1 :100 (pour une plaque de 384 puits, ajoutez 220 μL de la solution mère de substrat dans 21,8 mL de solution saline tamponnée au phosphate 1x [PBS]).
6. Rincez le tube avec la solution de travail du substrat (Figure 5B-D).
7. Chargez la plaque dans le lecteur et démarrez la mesure à l’aide des paramètres décrits à la Figure 4.
8. Répétez les étapes 7.6 à 7.7 pour toutes les plaques d’essai.
9. Une fois que vous avez terminé avec toutes les plaques de dosage, rincez le tube avec du méthanol.
10. Rincez le tube avec de l’eau déminéralisée.
    REMARQUE : À la fin de cette étape, des valeurs brutes de luciférase sont obtenues qui sont corrélatives à l’activité cellulaire de l’ATG4B. Pour normaliser le nombre de cellules, les étapes suivantes sont nécessaires en comptant le nombre de cellules dans chaque puits par microscopie à fluorescence.

8. Fixation et coloration des cellules

REMARQUE : Cette étape peut être effectuée manuellement à l’aide d’une pipette multicanaux ou à l’aide d’un distributeur en vrac.

1. Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (dans 1x PBS) pendant 15 min.
   REMARQUE : Suivez les directives locales en matière de santé et de sécurité concernant la manipulation du paraformaldéhyde en laboratoire et évitez tout contact avec la peau. Effectuez cette étape dans une cagoule de sécurité si possible.
2. Laver trois fois avec 1x PBS.
3. Colorer les noyaux avec Hoechst 33342 dilué 1 :5 000 dans 1x PBS pendant 15 min.
4. Laver trois fois avec 1x PBS.

9. Acquisition d’images

REMARQUE : Effectuez l’acquisition d’images à l’aide d’un microscope automatisé. Comme alternative à l’acquisition d’images pour déterminer le nombre de cellules, l’activité intracellulaire de la luciférase peut également être déterminée. Il y a des avantages et des inconvénients à ce que l’on normalise le nombre de cellules ou l’activité intracellulaire de la luciférase, ce qui est discuté ci-dessous. Nous constatons que la détermination du nombre de cellules est moins invasive et entraîne une variabilité plus faible que la détermination des valeurs intracellulaires de la luciférase.

1. Lancez le logiciel d’exploitation du microscope (Figure 6).
2. Dans l’onglet Configuration , choisissez le type de plaque prédéfini approprié. Si le type de plaque n’est pas prédéfini, saisissez manuellement les dimensions de la plaque.
3. Chargez la plaque dans le microscope en cliquant sur l’option Éjecter et charger .
4. Ensuite, choisissez l’objectif 20x Air (ouverture numérique [NA] : 0,4).
   REMARQUE : Assurez-vous que le collier d’objectif est réglé sur la bonne valeur, ce qui permet une mise au point correcte avec différents types de plaques.
5. Sous Channel Selection (Sélection du canal), sélectionnez Hoechst 33342.
   REMARQUE : Les paramètres de canal pour le temps, la puissance et la hauteur doivent être optimisés en fonction du type de plaque utilisé.
6. Dans Définir la mise en page, sélectionnez tous les puits de la plaque et quatre champs du puits.
7. Sur Online Jobs, sélectionnez le dossier correspondant pour transférer les données vers le logiciel d’analyse.

10. Analyse d’images

REMARQUE : N’importe quel logiciel d’analyse d’images peut être utilisé pour segmenter et compter les noyaux cellulaires à partir des images acquises. Nous décrivons ici les étapes à suivre pour utiliser un logiciel en ligne spécifique compatible avec plusieurs fichiers de microscopes automatisés.

1. Lancez le logiciel d’analyse d’images.
2. Accédez à l’onglet Image Analysis (Analyse d’image ) pour lancer la segmentation de l’image (Figure 7A).
3. Dans l’onglet Image d’entrée , cliquez sur le signe + pour ajouter un nouveau bloc de construction (Figure 7A).
4. Dans la liste, sélectionnez l’option Find Nuclei (Rechercher les noyaux) (Figure 7A) et sélectionnez Hoechst 33342 comme option de canal (Figure 7B).
5. Inspectez visuellement les objets segmentés sur l’image et sélectionnez la méthode de segmentation la plus précise.
   REMARQUE : Pour cette expérience, nous avons utilisé la méthode C (Figure 7C). Chaque option de méthode comporte des sous-catégories qui peuvent être ajustées pour obtenir la meilleure segmentation possible.
6. Cliquez ensuite sur l’onglet Define Results (Définir les résultats ) (Figure 7C) et sélectionnez l’option Standard Output (Sortie standard ) comme Method (Méthode ).
7. Dans la sous-catégorie, sélectionnez Nombre de noyaux d’objets et Nombre d’objets (Figure 7C).
8. Enregistrez le pipeline d’analyse à l’aide de l’option Enregistrer l’analyse sur le disque ou Enregistrer l’analyse dans la base de données .
9. Sous l’onglet Analyse par lots , sélectionnez les données à analyser dans l’arborescence.
10. Sous Méthode, sélectionnez le pipeline d’analyse enregistré à l’étape 10.8.
    REMARQUE : Il est également possible de télécharger un fichier de script à partir de l’extérieur du logiciel référencé ou de télécharger une analyse existante enregistrée dans la base de données.
11. Cliquez sur Run Analysis (Exécuter l’analyse ) pour lancer l’analyse (Figure 7D). À la fin de ce processus, deux jeux de données sont générés : les valeurs brutes de luciférase des surnageants et le nombre de cellules dans chaque puits. Utilisez les deux pour normaliser la valeur de la luciférase par cellule.

Résultats

Dans une publication précédente⁸, nous avons utilisé avec succès ce test pour cribler de petites molécules et des banques de siRNA et identifié de nouveaux régulateurs de l’ATG4B. Nous décrivons ici le protocole et les résultats représentatifs de ce rapporteur de luciférase dans un format de criblage semi-automatisé à haut débit. La figure 8 montre un exemple d’analyse des données brutes pour les noyaux cellulaires et la luminescence. Un résultat t...

Discussion

Ce protocole décrit un test de gène rapporteur basé sur des cellules pour l’identification d’inhibiteurs de l’ATG4B. L’identification des hits primaires est basée sur l’activité de la luciférase lors du traitement des cellules exprimant le cadre de lecture ouvert sur toute la longueur de la LC3B entre la β-actine et le dNGLUC. Certains avantages de ce test sont qu’il est sensible, hautement quantitatif et non invasif, car il peut détecter le dNGLUC sans lyser les cellules. Cet article présente un pro...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)	Tecan	30038609	Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFlo	BioTek		bulk dispenser
Coelenterazine	Santa Cruz Biotechnology	sc-205904	substrate
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Version 2.9.1	image analysis software
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile	Beckman Coulter	001-14555	384PP plate
EnVision II	Perkin Elmer		luminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL	Selleckchem	L3600	Selleckchem
FMK9A	MedChemExpress	HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates	Greiner Bio-One	781076	solid-black 384-well plates
Harmony Imaging software	Perkin Elmer	Version 5.1	imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570	Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software	Labcyte/Beckman Coulter		nanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q water			deionized water
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer		automated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids	Perkin Elmer	6057300	CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC			Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck	TR-1003-G	polybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher	J61278.ME	Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot	Tecan		liquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche	Merck	6366244001	DNA transfection reagent