JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשימוש בבדיקת כתב מבוססת לוציפראז בפורמט סינון חצי אוטומטי, בתפוקה גבוהה.

Abstract

עדויות הולכות וגדלות הראו כי שטף אוטופגי גבוה קשור להתקדמות הגידול ולעמידות לטיפול בסרטן. בדיקת חלבוני אוטופגיה בודדים היא תנאי מוקדם לאסטרטגיות טיפוליות המכוונות למסלול זה. עיכוב של פרוטאז אוטופגיה ATG4B הוכח כמגביר את ההישרדות הכוללת, דבר המצביע על כך ש- ATG4B יכול להיות מטרה פוטנציאלית לטיפול בסרטן. המעבדה שלנו פיתחה בדיקה סלקטיבית מבוססת לוציפראז לניטור פעילות ATG4B בתאים. עבור בדיקה זו, המצע של ATG4B, LC3B, מתויג במסוף C עם לוציפראז סודי מהקופפוד הימי Gaussia princeps (GLUC). כתב זה מקושר לשלד הציטופלזמה של האקטין ובכך שומר אותו בציטופלסמה של תאים כאשר הוא משוחרר. מחשוף בתיווך ATG4B גורם לשחרור GLUC על ידי הפרשה לא קונבנציונלית, אשר לאחר מכן ניתן לנטר על ידי קצירת supernatants מתרבית תאים כמתאם של פעילות ATG4B תאית. מאמר זה מציג את ההתאמה של בדיקה מבוססת לוציפראז זו לסינון אוטומטי בתפוקה גבוהה. אנו מתארים את זרימת העבודה והאופטימיזציה לניתוח מופתי של תפוקה גבוהה של פעילות ATG4B סלולרית.

Introduction

אוטופגיה היא תהליך מטבולי שמור המאפשר לתאים לשמור על הומאוסטזיס תוך-תאי ולהגיב ללחץ על ידי פירוק תוכן תאי מיושן, פגום או מיותר באמצעות ליזוזומים 1,2,3. בתנאים פתופיזיולוגיים מסוימים, תהליך זה פועל כתגובה תאית חיונית למחסור בחומרים מזינים ובחמצן, וכתוצאה מכך חומרים מזינים ושומנים ממוחזרים, המאפשרים לתאים להסתגל לצרכים המטבוליים שלהם 2,3,4. אוטופגיה זוהתה גם כתגובת עקה תאית הקשורה למספר מחלות, כגון הפרעות נוירודגנרטיביות, זיהום פתוגן וסוגים שונים של סרטן. תפקידה של אוטופגיה בסרטן מורכב ותלוי בסוג, בשלב ובסטטוס של הגידול. זה יכול לדכא גידולים באמצעות פירוק אוטופגי של תאים פגומים, אבל יכול גם לקדם את ההישרדות של גידולים מתקדמים על ידי שיפור הישרדות התאים במהלך תנאי עקה, כגון היפוקסיה, חסך תזונתי, נזק ציטוטוקסי 2,4,5,6.

מספר מחקרים הראו כי עיכוב אוטופגיה מספק יתרון כאסטרטגיה נגד סרטן. לפיכך, עיכוב של צעדים קריטיים, כגון היווצרות אוטופגוזום או איחוי שלה עם הליזוזום, יכול להיות שיטה יעילה לשליטה בסרטן 2,4,5,6. עדויות הולכות וגדלות הראו כי ATG4B מעורב במצבים פתולוגיים מסוימים, והוא זכה לתשומת לב כיעד פוטנציאלי נגד סרטן 2,3,4. לדוגמה, נצפה כי תאי סרטן המעי הגס והחלחולת וקולטן גורם גדילה אפידרמיס אנושי 2 (HER2) חיובי לתאי סרטן השד היו בעלי רמות ביטוי ATG4B גבוהות משמעותית מאשר תאים נורמליים סמוכים 2,4. בתאי סרטן הערמונית, עיכוב ATG4B הביא לרגישות ספציפית לקו תאים לכימותרפיה והקרנות7. לאחרונה, התגלו ראיות חזקות לכך שאדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) פגיעה במיוחד לעיכוב ATG4B. לדוגמה, במודל עכבר מהונדס גנטית, הוכח כי אובדן לסירוגין של תפקוד ATG4B מפחית את צמיחת הגידול PDAC ומגביר את הישרדות 3,4. בסך הכל, ATG4B מתבטא יתר על המידה בכמה סוגי סרטן, קשור להתקדמות הגידול, והוא קשור לעמידות לטיפול בסרטן 2,4,8.

לפרוטאזות ציסטאין ATG4 ביונקים יש ארבעה בני משפחה, ATG4A-ATG4D. חלבונים אלה מפגינים סלקטיביות מטרה מסוימת כלפי משפחת החלבוניםLC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 וייתכן שיש להם תפקידים נוספים שאינם קשורים לפעילות הפרוטאז שלהם 12,13. יתר על כן, ATG4 מתפקד בוויסות סוג חדש של שינוי לאחר תרגום, ATG8-ylation של חלבונים11,12. בעוד ATG4B והמצע העיקרי שלו LC3B הם הנחקרים ביותר, מתגבשת תמונה המצביעה על תפקיד מורכב עבור כל תת-משפחה בוויסות תהליכים אוטופגיים ולא אוטופגיים. הדבר מאושש עוד יותר על ידי רשת מורכבת של שינויים פוסט-תרגומיים המווסתים את פעילות ATG4B באמצעות זרחון, אצטילציה, גליקוזילציה וניטרוסילציה 9,10,11,12,13.

מספר מעכבי ATG4B ידועים פורסמו 2,4,14,15. בעוד אלה מתאימים ככלי מחקר, הפרופיל הפרמקודינמי שלהם, סלקטיביות או עוצמה עדיין מנעו מהם לפתח כמועמדים פרה-קליניים 4,16. באופן כללי, יש צורך דחוף לזהות תרכובות חזקות וסלקטיביות יותר. לעתים קרובות, התרכובות הן מעכבות ביוכימיות טובות של תפקוד החלבון, אך יעילותן בבדיקות מבוססות תאים נמוכה. ישנן בדיקות מרובות לניטור פעילות ATG4B, כולל שיטות ביוכימיות ובדיקות מבוססות תאים4. פיתחנו בעבר בדיקה פשוטה, מבוססת לומינסנציה ובעלת תפוקה גבוהה לניטור פעילות ATG4B בתאים 8,17. בדיקה זו משתמשת בחלבון לוציפראז מנסיך גאוסיה (GLUC) שהוא יציב ופעיל בסביבה החוץ-תאית ויכול להשתחרר באופן אינדוקטיבי מתאים בתגובה לפעילות פרוטאוליטית ATG4B18,19.

במבנה כתב זה, dNGLUC מקושר לשלד האקטין של תאים. ניתן להכניס מקשר ספציפי לפרוטאז בין עוגן β אקטין לבין dNGLUC, מה שהופך את ההפרשה לתלויה במחשוף של המקשר. השתמשנו במסגרת קריאה פתוחה באורך מלא של LC3B בין β-actin ו-dNGLUC, כדי להיות מסוגלים לנטר מחשוף LC3B17,18,19. למרות שמנגנון ההפרשה של dNGLUC אינו מובן היטב, הוא ספציפי לניטור פעילות ATG4B, אינו תלוי באוטופגיה כללית כפי שהיא מתרחשת בתאי נוקאאוט ATG5, ומתווך על ידי מנגנונים לא קונבנציונליים שאינם דורשים פפטיד אות קלאסי 4,18,19. השתמשנו בהצלחה בכתב זה כדי לסנן מולקולות קטנות וספריות siRNA, וזיהינו רגולטורים חדשים של פעילות ATG4B, כגון חלבון Akt קינאזות8. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לשימוש בכתב לוציפראז זה בפורמט סינון חצי אוטומטי, בתפוקה גבוהה.

Protocol

הערה: תהליך הבדיקה מתואר באיור 1. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.

1. ייצור רטרווירוס

הערה: הפלסמיד המקודד את ActinLC3dNGLUC הוא pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. השתמש במספר נמוך של תאים לייצור וירוסים בעלי טיטר גבוה (באופן אידיאלי פחות מ-P20).

  1. תרבית HEK293T תאים בתווך העיט המהונדס של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) ב-37°C באינקובטור לח, עם אטמוספירה של 5% CO2 עד שהם 80%-90% מתמזגים לפני הזריעה לטרנספקציה.
  2. יום לפני ההדבקה, זרעו את התאים לתוך צלחת 6 בארות בצפיפות של 1 × 106 תאים / באר ב 2 מ"ל / באר של מדיום צמיחה שלם. דוגרים על הצלחת למשך הלילה באינקובטור לח עם אטמוספירה של 5% CO2.
    הערה: בצע את הוראות היצרן אם אתה משתמש בריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפוזומלי. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בריאגנט שאינו מבוסס על ליפוזומלי. לפני תחילת הטרנספקציה, אפשרו למגיב הטרנספקציה של הדנ"א, לדנ"א ולמדיה להתאזן לטמפרטורת החדר (~ 15 דקות).
  3. עבור כל טרנספקציה, הוסף 200 μL של צינורות מיקרוצנטריפוגות ללא סרום עד 1.5 מ"ל. בכל צינור, הוסף את הכמויות הבאות של פלסמידים: 1,000 ng של pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 ng של GagPol; 100 ננוגרם של VSV-G.
    הערה: כמות הפלסמידים ונפח המדיה המפורטים כאן הם עבור צלחת של 12 בארות. אם אתם משתמשים בסוג צלחת שונה, התאימו את נפח המדיה ואת כמויות הפלסמיד כך שיגיעו לריכוז הסופי של 5 ננוגרם/מיקרוליטר של פלסמיד העברה, 4.5 נ"ג/מיקרוליטר של פלסמיד אריזה ו-0.5 נ"ג/מיקרוליטר של פלסמיד מעטפה. השתמש בכל פלסמיד אריזה המכיל גנים המבטאים gag ו- pol, ובכל פלסמיד מעטפת המכיל את הגן המבטא VSV-G.
  4. מערבולת בקבוקון מגיב טרנספקציה DNA במשך 30 שניות. פיפטה 4 μL של מגיב transfection ישירות לתוך המדיום המכיל את ה- DNA מדולל. מערבבים בעדינות על ידי הטייה עדינה של הצינור.
    הערה: אין לגעת בדפנות צינורות הפלסטיק עם הקצוות. אין לבצע פיפטה למעלה ולמטה או מערבולת.
  5. דגרו על התגובה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. בזמן הדגירה על התגובה, מוציאים את המדיום הישן מהצלחת בעלת 6 הקידוחים ומחליפים אותו ב-2 מ"ל/באר של מדיה טרייה נטולת סרום.
  7. הוסף כל קומפלקס טרנספקציה לכל באר בצורה טיפתית.
  8. נערו או ערבלו בעדינות את הצלחת כדי להבטיח פיזור אחיד על פני כל משטח הבאר.
  9. לדגור על הצלחת למשך הלילה ב 37 ° C באינקובטור לח עם אטמוספירה של 5% CO2.
  10. לאחר 24 שעות, החליפו את התווך הישן בתווך שלם טרי (2 מ"ל/באר) והחזירו את התאים חזרה לאינקובטור הלח עם אטמוספירה של 5% CO2 למשך72 שעות.
  11. לאחר 72 שעות, קצרו את הסופרנאטנט בצינור חרוטי של 50 מ"ל ובצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4,000 × גרם ב-4°C כדי להסיר תאים מתים ופסולת. לטיהור נוסף, השתמשו במזרק גדול של 60 מ"ל כדי להעביר את הסופרנאטנט דרך מסנן של 0.20 מיקרומטר. מיד להכין aliquots חד פעמי של 300 μL ולאחסן ב -80 °C.
    הערה: הימנע ממחזור הקפאה-הפשרה כדי לשמור על פעילות מרבית של המוצר.

2. התמרה רטרו-ויראלית

  1. יום לפני התמרת התאים, זרעו את תאי המטרה בצפיפות בינונית (PANC1 ב 1 × 10 5 תאים / באר) בצלחת 12 בארות ב 1 מ"ל / באר של בינוני בתוספת 10% FBS ו 1% P / S. לדגור את הצלחת לילה ב 37 ° C באינקובטור לח עם אטמוספירה של5 % CO2.
    הערה: יש לקבוע מראש את צפיפות התאים הטובה ביותר, מכיוון שלסוגי תאים שונים יש יכולות התקשרות שונות. באופן אידיאלי, השתמש בצפיפות תאים כדי להשיג מפגש של 40%-50%.
  2. הסר את aliquots רטרווירוס קפוא מהמקפיא -80 ° C והפשיר על קרח לפני כל שימוש.
    הערה: אין להקפיא מחדש aliquots שאינם בשימוש.
  3. בצינור חרוטי של 50 מ"ל, הכינו תערובת של סופרנאטנט נגיפי ופוליברן בריכוז סופי של 8 מיקרוגרם/מ"ל.
    הערה: הכרכים הבאים חלים על התמרה של לוח בן 12 בארות המכיל נפח סופי של 500 μL/well. ניתן להעריך את נפח הסופרנאטנט הנגיפי הסופי על ידי בדיקת מגוון של דילולים נגיפיים בנוכחות פוליברן. ניתן להשתמש בדילולים גבוהים או נמוכים יותר בהתאם לרמות הביטוי הרצויות של הטרנסגן ולגודל הכלי המשמש.
  4. מוציאים את המדיום הישן מצלחת 12 הבארות ומוסיפים 500 μL של התערובת לכל באר. לדגור על התאים עם supernatant נגיפי במשך הלילה ב 37 ° C באינקובטור לח עם אטמוספירה של 5% CO2.
    הערה: שמור שתי בארות עם תווך מלא (ללא סופרנטנט ויראלי) לשימוש כבקרה לבחירה.
  5. החלף את המדיום המכיל וירוס במדיום גידול מלא טרי (1 מ"ל / באר). החזירו את התאים לאינקובטור הלח עם אטמוספירה של 5%CO2 למשך 48 שעות.

3. בחירת אוכלוסייה מאוגמת ותחזוקתה

  1. החלף את מדיום הגידול במדיום בחירה (מדיום גידול מלא עם ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל puromycin). עקוב אחר צמיחת התאים ושנה את מדיית הבחירה כל 2-3 ימים. במפגש, להרחיב לתוך צלחת 6 בארות, ולאחר מכן לתוך צלחת תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ.
  2. שמור את התאים במדיום הבחירה לפחות למשך הזמן שנדרש לתאי הבקרה (שאינם מותמרים) למות לחלוטין.
    הערה: לקבלת תוצאות מוצלחות, מומלץ לקבוע ריכוזים אופטימליים של פורומיצין לפני תחילת הפרויקט הניסיוני. לשם כך, ליצור עקומת להרוג puromycin כדי לקבוע את הריכוז המינימלי הדרוש להרוג תאים untransduced בין 3 ל 10 ימים.
  3. ברגע שהתאים גדלים במדיום הבחירה, הרחיבו את התאים על מצע גידול שלם והקפיאו מלאי עבור הפרויקט הניסיוני.
    הערה: רשום את מספר המעבר והימנע מעבודה עם אוכלוסיות מאוגמות ממלאי קפוא עם מספרי מעבר גבוהים מחמישה. בדוק באופן קבוע זיהום מיקופלסמה לפני ביצוע הבדיקה. באופן אידיאלי, השתמש אצווה תא טרי לפני כל בדיקה כדי לקבל את האות המרבי של luciferase.
  4. לשמור על התאים במדיום הבחירה ולזרוע מספיק תאים כדי להגיע לצפיפות הרצויה יום לפני הבדיקה.

4. תוספת מורכבת

הערה: ספריית המולקולות הקטנות של Selleckchem מורכבת מכ-4,000 תרכובות המסודרות בשמונה שורות ו-10 עמודות בחמישים לוחות של 96 בארות בריכוז מלאי של 10 מילימטר בדימתיל סולפוקסיד (DMSO).

  1. Aliquot 30 μL של תרכובת לתוך הבאר המתאימה של צלחת מקור התואמת מתקן נוזל אקוסטי בקנה מידה ננומטרי. השתמש בלוח פוליפרופילן 384 בארות (צלחת 384PP). יש לשמור על צלחות אלה אטומות ומאוחסנות בטמפרטורה של -20°C.
    הערה: פרוטוקול הסינון המתואר כאן הוא בסך הכל 10 לוחיות בדיקה ביום; ריכוז קבוע של 10 מיקרומטר שימש כריכוז הבדיקה הסופי יחד עם תקופת דגירה של 24 שעות.
  2. הפשירו את צלחות ספריית המתחם בטמפרטורת החדר.
    הערה: יש לוודא שהצלחת מופשרת לחלוטין ומאוזנת לטמפרטורת החדר. שיפוע טמפרטורה לרוחב הצלחת עלול להשפיע על הטיפול בנוזלים.
  3. יש לפזר 50 nL/well לתוך צלחת בדיקה של 384 בארות באמצעות מתקן נוזל אקוסטי ננומטרי.
    הערה: ודא שלוחיות המקור והיעד שנבחרו בתוכנית תואמות לאלה המשמשות לשלב זה.
  4. צור תוכנית חלוקה בגיליון אלקטרוני.
  5. פתח את התוכנה.
  6. פתח פרוטוקול חדש. בכרטיסיה פרוטוקול , בחר את האפשרויות הבאות: תבנית צלחת לדוגמה, 384PP; סוג צלחת לדוגמה, 384PP_DMSO2; וסוג לוחית היעד, CellCarrier-384 Ultra PN (איור 2A).
  7. תחת רשימת איסוף, בחר באפשרות הייבוא (איור 2B) כדי לייבא את הגיליון האלקטרוני המכיל את תוכנית החלוקה (איור 2C).
  8. בחר באפשרות Run protocol (איור 2D), ודא שהמידע המוצג נכון ולחץ על Run.
  9. בחלון החדש שנקרא מצב הפעלה (איור 2E), לחץ על התחל ובצע את השלבים המוצגים בחלונות ההנחיות (איור 2F,G).

5. זריעת תאים

  1. טריפסין את התאים מבקבוק תרבית תאים או תרבית תאים צלחות פטרי ולנטרל את הטריפסין על ידי הוספת מדיה המכילה FBS.
  2. מעבירים את מתלה התא לצינור חרוטי 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 390 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להסיר בעדינות את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מ"ל של מדיה צמיחה מלאה.
  3. ביצוע ספירת תאים.
  4. הכן את תרחיף התא עם 4.6 × 107 תאים ב 230 מ"ל של מדיה תרבית מלאה.
    הערה: נפח וצפיפות תאים אלה מיועדים ללוחות בדיקה של 10x 384 בארות בתוספת נפח מת של שני לוחות 384 בארות.
  5. יש לפזר 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת בדיקה של 384 בארות, שהוכנה בסעיף 4.
    הערה: זריעת תאים יכולה להיעשות באופן ידני או באמצעות מתקן בתפזורת.
  6. לדגור על התאים ב 37 ° C באינקובטור לח עם אטמוספירה של 5% CO2 במשך 24 שעות.

6. קצירת הסופרנאטנט התאי

הערה: הפלטפורמה הרובוטית לטיפול בנוזלים המשמשת כאן מבצעת טיפול בנוזלים עם זרוע רב ערוצית עבור 96 טיפים. אם אין אוטומציה זמינה לטיפול בנוזלים, ניתן להתאים את הפרוטוקול לפורמט תפוקה נמוכה באמצעות פיפטות רב-ערוציות.

  1. הגדר את הסיפון של תחנת העבודה לאוטומציה במעבדה כפי שמוצג באיור 3.
  2. הניחו את הערימה החד-פעמית של 96 קצוות במיקום P1 (איור 3A).
    הערה: כל ערימה של 96 קצוות מורכבת משמונה מתלים חד-פעמיים. בעת שימוש בזרוע רב ערוצית עבור 96 קצוות, צלחת 384 באר מחולקת לארבעה רבעים. לפיכך, כל ערימת קצה מספיקה כדי להעביר את הסופרנאטנט משני לוחות בדיקה לשני לוחות ריקים, שחורים-מוצקים, 384 בארות. יש להחליף את כל ערימת החוד לאחר כל הפעלה של שתי צלחות.
  3. מקמו את לוחות הבדיקה במיקומים P2 ו-P4 (איור 3A).
  4. הניחו את הלוחות הריקים, השחורים-מוצקים, בעלי 384 הקידוחים במיקומים P3 ו-P5 (איור 3A).
    הערה: פלטפורמה רובוטית גמישה ובעלת יכולות זו הותאמה לבדיקה זו ונכתבה תוכנית מיוחדת (איור 3B).
  5. קבל את הטיפים ממיקום P1.
  6. שאפו 10 מיקרוליטר של סופרנאטנט מהצלחת במיקום P2 והעבירו לצלחת השחורה-מוצקה הריקה במיקום P3.
    הערה: יש למקם את הקצוות בעומק מתאים בתוך הבארות כדי לשאוף את הסופרנאטנט מבלי להפריע לחד-שכבה התאית בתחתית הבאר.
  7. השליכו את הקצוות לפסולת על מיקום P6 (איור 3A).
  8. חזור על שלבים 6.5-6.7 עבור הבארות הנותרות של הצלחת במיקום P2, ולאחר מכן חזור על אותם צעדים כדי להעביר את הסופרנאטנט ממיקום P4 למיקום P5.
    הערה: הקפידו לאסוף את הסופרנאטנט ולחלק על הבארות המתאימות לתוך הלוח השחור-מוצק הריק (איור 3C,D). מכיוון ש- dNGLUC המופרש יציב מאוד בתווך תרבית תאים, ניתן לאטום את הלוחות ולשמור אותם עד 7 ימים ב -4 מעלות צלזיוס בחושך.

7. בדיקת לוציפראז

הערה: dNGLUC המשמש את הכתב מציג קינטיקה פלאש עם דעיכת אות מהירה. בשל הדעיכה המהירה של ההארה לאחר הוספת מצע (coelenterazine), יש להגדיר את קורא הלוחות למדידת אות ההארה בסופרנאטנטים; הזריקו את המצע לבאר וקראו אותו היטב לאחר מספר שניות. מסיבה זו, השתמש בקורא לוחות המסוגל לנטר את עוצמת האור ומצויד במזרק מצע כדי להבטיח שהזמן בין שלבי ההזרקה והקריאה יהיה אחיד לכל הדגימות. ניתן למצוא את ההגדרות המשמשות בקורא הלוחות באיור 4.

  1. הכינו קולנטרזין טבעי כתמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל במתנול חומצי (10 מיקרוליטר של 3 M HCl עד 1 מ"ל מתנול).
    הערה: יש לעקוב אחר הנחיות הבריאות והבטיחות המקומיות בנוגע לטיפול במתנול במעבדה ולהימנע ממגע עם העור. הכינו את תמיסת מצע העבודה הטרי לפני תחילת הבדיקה.
  2. אתחל את משאבת המזרק (איור 5A).
  3. שטפו את הצינורית במים שעברו דה-יוניזציה (איור 5B-D).
  4. שוטפים את הצינורית במתנול.
  5. בעת שטיפת הצינור, הכינו את תמיסת המצע העובדת על ידי דילול המצע בקנ"מ 1:100 (עבור צלחת אחת של 384 בארות, הוסיפו 220 μL מתמיסת מלאי המצע ל-21.8 מ"ל של מלח חוצץ פוספט 1x [PBS]).
  6. שטפו את הצינורית בתמיסת העבודה של המצע (איור 5B-D).
  7. טען את הלוח לתוך הקורא והתחל את המדידה באמצעות ההגדרות המתוארות באיור 4.
  8. חזור על שלבים 7.6-7.7 עבור כל לוחות הבדיקה.
  9. לאחר שסיימנו עם כל צלחות המבחן, שטפו את הצינור במתנול.
  10. שטפו את הצינורית במים שעברו דה-יוניזציה.
    הערה: בסוף שלב זה, מתקבלים ערכי לוציפראז גולמיים הנמצאים בקורלציה לפעילות ATG4B התאית. עבור נורמליזציה למספרי תאים, השלבים הבאים נחוצים על ידי ספירת מספר התא בכל באר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

8. קיבוע תאים והכתמה

הערה: שלב זה יכול להתבצע באופן ידני בעזרת פיפטה רב ערוצית או באמצעות מתקן בתפזורת.

  1. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (ב 1x PBS) במשך 15 דקות.
    הערה: יש לעקוב אחר הנחיות הבריאות והבטיחות המקומיות בנוגע לטיפול בפרפורמאלדהיד במעבדה ולהימנע ממגע עם העור. בצעו שלב זה במכסה מנוע במידת האפשר.
  2. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS.
  3. הכתימו את הגרעינים עם Hoechst 33342 מדולל 1:5,000 ב-1x PBS למשך 15 דקות.
  4. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS.

9. רכישת תמונות

הערה: בצע רכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי. כחלופה לרכישת תמונה כדי לקבוע את מספר התאים, ניתן לקבוע גם את פעילות הלוציפראז התוך-תאי. ישנם יתרונות וחסרונות לגבי האם אחד מנרמל למספרי תאים או לפעילות לוציפראז תוך תאי, אשר נדון להלן. אנו מוצאים כי קביעת מספר התאים היא פחות פולשנית וגורמת לשונות נמוכה יותר מאשר קביעת ערכי לוציפראז תוך תאי.

  1. הפעל את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ (איור 6).
  2. בכרטיסייה Setup , בחר את סוג הצלחת הנכון שהוגדר מראש. אם סוג הלוח אינו מוגדר מראש, הזינו ידנית את מידות הלוחה.
  3. טען את הצלחת למיקרוסקופ על ידי לחיצה על האפשרות הוצא וטען.
  4. לאחר מכן, בחר את היעד 20x Air (צמצם מספרי [NA]: 0.4).
    הערה: ודא שהצווארון האובייקטיבי מוגדר לערך הנכון, המאפשר מיקוד נכון עם סוגי לוחות שונים.
  5. תחת בחירת ערוץ, בחר Hoechst 33342.
    הערה: יש למטב את הגדרות הערוץ עבור זמן, הספק וגובה בהתאם לסוג הצלחת שבה נעשה שימוש.
  6. בתיבה הגדר פריסה, בחר את כל הבארות מהלוח וארבעה שדות מהבאר.
  7. במשרות מקוונות, בחר את התיקיה המתאימה כדי להעביר את הנתונים לתוכנת הניתוח.

10. ניתוח תמונות

הערה: ניתן להשתמש בכל תוכנה לניתוח תמונות כדי לפלח ולספור גרעיני תאים מהתמונות שנרכשו. כאן, אנו מתארים את השלבים לשימוש בתוכנה מקוונת ספציפית התואמת למספר קבצי מיקרוסקופים אוטומטיים.

  1. הפעל את תוכנת ניתוח התמונות.
  2. עברו אל הכרטיסייה 'ניתוח תמונות ' כדי להתחיל את פילוח התמונות (איור 7A).
  3. בכרטיסייה Input Image , לחץ על הסימן + כדי להוסיף אבן בניין חדשה (איור 7A).
  4. מהרשימה, בחר באפשרות חפש גרעינים (איור 7A) ובחר Hoechst 33342 כאפשרות הערוץ (איור 7B).
  5. בדקו ויזואלית את העצמים המפולחים בתמונה ובחרו את שיטת הפילוח המדויקת ביותר.
    הערה: לצורך הניסוי הזה השתמשנו בשיטה C (איור 7C). לכל אפשרות שיטה יש קטגוריות משנה שניתן להתאים כדי לקבל את הפילוח הטוב ביותר האפשרי.
  6. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה הגדרת תוצאות (איור 7C) ובחר פלט רגיל כאפשרות שיטה.
  7. מתוך קטגוריית המשנה, בחר מספר גרעינים של עצמים וספירת אובייקטים (איור 7C).
  8. שמור את צינור הניתוח באמצעות האפשרות שמור ניתוח בדיסק או שמור ניתוח במסד נתונים .
  9. תחת הכרטיסיה ניתוח אצווה , בחר את הנתונים לניתוח מהעץ.
  10. תחת שיטה, בחר את צינור הניתוח שנשמר בשלב 10.8.
    הערה: ניתן גם להעלות קובץ script מחוץ לתוכנה שאליה מתבצעת הפניה או להעלות ניתוח קיים שנשמר במסד הנתונים.
  11. לחץ על הפעל ניתוח כדי להתחיל את הניתוח (איור 7D). בסוף זרימת עבודה זו, נוצרים שני מערכי נתונים: ערכי לוציפראז גולמיים מהסופרנאטנטים ומספר התא בכל באר. השתמש בשניהם כדי לנרמל את ערך luciferase לכל תא.

תוצאות

בפרסום קודם8, השתמשנו בהצלחה בבדיקה זו כדי לסנן ספריות מולקולות קטנות וספריות siRNA וזיהינו רגולטורים חדשים של ATG4B. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול ואת התוצאות המייצגות של כתב luciferase זה בפורמט סינון חצי אוטומטי, תפוקה גבוהה. איור 8 מציג דוגמה לניתוח נתונים גולמיים הן ?...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר בדיקת גן דיווח מבוססת תאים לזיהוי מעכבי ATG4B. זיהוי פגיעות ראשוניות מבוסס על פעילות לוציפראז בטיפול בתאים המבטאים את מסגרת הקריאה הפתוחה באורך מלא של LC3B בין β-אקטין ל-dNGLUC. כמה יתרונות של בדיקה זו הם שזה רגיש, כמותי מאוד, ולא פולשני, כפי שהוא יכול לזהות dNGLUC מבלי לשקר את התאים. מ...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מימון ליבה של המועצה הבריטית למחקר רפואי ליחידת MRC-UCL University Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (מענק 2018RIF_15), ותוכנית UCL Therapeutic Acceleration Support Scheme, הנתמכת על ידי מימון מ- MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. הפלסמיד המקודד ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) התקבל מד"ר רובין קטלר (המחלקה לרפואה אנושית, בית הספר לרפואה בברלין).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)Tecan30038609Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFloBioTekbulk dispenser
CoelenterazineSanta Cruz Biotechnologysc-205904substrate
Columbus Image analysis softwarePerkin ElmerVersion 2.9.1image analysis software
DPBS (1x)Gibco14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterileBeckman Coulter001-14555384PP plate
EnVision IIPerkin Elmerluminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µLSelleckchemL3600Selleckchem
FMK9AMedChemExpressHY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well platesGreiner Bio-One781076solid-black 384-well plates
Harmony Imaging softwarePerkin ElmerVersion 5.1imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in WaterThermoFisherH3570Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick softwareLabcyte/Beckman Coulternanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q waterdeionized water
Opera Phenix High-Content Screening SystemPerkin Elmerautomated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lidsPerkin Elmer6057300CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUCObtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection ReagentMerckTR-1003-Gpolybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific ChemicalsThermoFisherJ61278.MEPuromycin
Tecan Freedom EVO 200 robotTecanliquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent RocheMerck6366244001DNA transfection reagent

References

  1. Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
  2. Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649 (2019).
  3. Towers, C. G., Thorburn, A. Therapeutic targeting of autophagy. EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).
  4. Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
  5. Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. Targeting autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).
  6. Kimmelman, A. C., White, E. Autophagy and tumor metabolism. Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).
  7. Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
  8. Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
  9. Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
  10. Tanida, I., Sou, Y. -. S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
  11. Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
  12. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
  13. Ketteler, R., Tooze, S. A. ATG4: More than a protease. Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).
  14. Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
  15. Fernández, &. #. 1. 9. 3. ;. F., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
  16. Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
  17. Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
  18. Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -. W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
  19. Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
  20. Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved