Zellbasiertes Wirkstoff-Screening auf Inhibitoren der Autophagie-verwandten 4B-Cystein-Peptidase

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines Luciferase-basierten Reporter-Assays in einem halbautomatischen Hochdurchsatz-Screening-Format.

Zusammenfassung

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass ein hoher autophagischer Fluss mit dem Fortschreiten des Tumors und der Resistenz gegen die Krebstherapie zusammenhängt. Der Nachweis einzelner Autophagie-Proteine ist eine Voraussetzung für therapeutische Strategien, die auf diesen Signalweg abzielen. Es wurde gezeigt, dass die Hemmung der Autophagie-Protease ATG4B das Gesamtüberleben erhöht, was darauf hindeutet, dass ATG4B ein potenzielles Angriffsziel für die Krebstherapie sein könnte. Unser Labor hat einen selektiven Luciferase-basierten Assay zur Überwachung der ATG4B-Aktivität in Zellen entwickelt. Für diesen Assay wird das Substrat von ATG4B, LC3B, am C-Terminus mit einer sekretierbaren Luciferase aus dem marinen Ruderfußkrebs Gaussia princeps (GLUC) markiert. Dieser Reporter ist mit dem Aktin-Zytoskelett verbunden, so dass es im Zytoplasma der Zellen verbleibt, wenn es unverschlossen ist. Die ATG4B-vermittelte Spaltung führt zur Freisetzung von GLUC durch unkonventionelle Sekretion, die dann durch die Ernte von Überständen aus Zellkulturen als Korrelat der zellulären ATG4B-Aktivität überwacht werden kann. In diesem Artikel wird die Anpassung dieses Luciferase-basierten Assays an das automatisierte Hochdurchsatz-Screening vorgestellt. Wir beschreiben den Workflow und die Optimierung für eine beispielhafte Hochdurchsatzanalyse der zellulären ATG4B-Aktivität.

Einleitung

Autophagie ist ein konservierter Stoffwechselprozess, der es den Zellen ermöglicht, die intrazelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten und auf Stress zu reagieren, indem sie gealterte, defekte oder unnötige Zellinhalte über die Lysosomen abbauen ^1,2,3. Unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen fungiert dieser Prozess als entscheidende zelluläre Reaktion auf Nährstoff- und Sauerstoffmangel, was zu recycelten Nährstoffen und Lipiden führt, die es den Zellen ermöglichen, sich an ihre Stoffwechselbedürfnisse anzupassen<....

Protokoll

HINWEIS: Der Analyseprozess ist in Abbildung 1 dargestellt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Produktion von Retroviren

HINWEIS: Das Plasmid, das für ActinLC3dNGLUC kodiert, ist pMOWS-ActinLC3dNGLUC²⁰. Verwenden Sie eine geringe Anzahl von Zellen für die Produktion von Viren mit hohem Titer (idealerweise weniger als P20).

1. Kultur HEK293T Zellen in Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälbe....

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen zellbasierten Reportergen-Assay zur Identifizierung von ATG4B-Inhibitoren. Die Identifizierung von primären Treffern basiert auf der Luciferase-Aktivität bei der Behandlung von Zellen, die den offenen Leserahmen von LC3B in voller Länge zwischen β-Aktin und dNGLUC exprimieren. Einige Vorteile dieses Assays sind, dass er empfindlich, hochquantitativ und nicht-invasiv ist, da er dNGLUC nachweisen kann, ohne die Zellen zu lysieren. In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll zur G.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)	Tecan	30038609	Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFlo	BioTek		bulk dispenser
Coelenterazine	Santa Cruz Biotechnology	sc-205904	substrate
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Version 2.9.1	image analysis software
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile	Beckman Coulter	001-14555	384PP plate
EnVision II	Perkin Elmer		luminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL	Selleckchem	L3600	Selleckchem
FMK9A	MedChemExpress	HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates	Greiner Bio-One	781076	solid-black 384-well plates
Harmony Imaging software	Perkin Elmer	Version 5.1	imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570	Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software	Labcyte/Beckman Coulter		nanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q water			deionized water
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer		automated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids	Perkin Elmer	6057300	CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC			Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck	TR-1003-G	polybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher	J61278.ME	Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot	Tecan		liquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche	Merck	6366244001	DNA transfection reagent