Zellbasiertes Wirkstoff-Screening auf Inhibitoren der Autophagie-verwandten 4B-Cystein-Peptidase

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines Luciferase-basierten Reporter-Assays in einem halbautomatischen Hochdurchsatz-Screening-Format.

Zusammenfassung

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass ein hoher autophagischer Fluss mit dem Fortschreiten des Tumors und der Resistenz gegen die Krebstherapie zusammenhängt. Der Nachweis einzelner Autophagie-Proteine ist eine Voraussetzung für therapeutische Strategien, die auf diesen Signalweg abzielen. Es wurde gezeigt, dass die Hemmung der Autophagie-Protease ATG4B das Gesamtüberleben erhöht, was darauf hindeutet, dass ATG4B ein potenzielles Angriffsziel für die Krebstherapie sein könnte. Unser Labor hat einen selektiven Luciferase-basierten Assay zur Überwachung der ATG4B-Aktivität in Zellen entwickelt. Für diesen Assay wird das Substrat von ATG4B, LC3B, am C-Terminus mit einer sekretierbaren Luciferase aus dem marinen Ruderfußkrebs Gaussia princeps (GLUC) markiert. Dieser Reporter ist mit dem Aktin-Zytoskelett verbunden, so dass es im Zytoplasma der Zellen verbleibt, wenn es unverschlossen ist. Die ATG4B-vermittelte Spaltung führt zur Freisetzung von GLUC durch unkonventionelle Sekretion, die dann durch die Ernte von Überständen aus Zellkulturen als Korrelat der zellulären ATG4B-Aktivität überwacht werden kann. In diesem Artikel wird die Anpassung dieses Luciferase-basierten Assays an das automatisierte Hochdurchsatz-Screening vorgestellt. Wir beschreiben den Workflow und die Optimierung für eine beispielhafte Hochdurchsatzanalyse der zellulären ATG4B-Aktivität.

Einleitung

Autophagie ist ein konservierter Stoffwechselprozess, der es den Zellen ermöglicht, die intrazelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten und auf Stress zu reagieren, indem sie gealterte, defekte oder unnötige Zellinhalte über die Lysosomen abbauen ^1,2,3. Unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen fungiert dieser Prozess als entscheidende zelluläre Reaktion auf Nährstoff- und Sauerstoffmangel, was zu recycelten Nährstoffen und Lipiden führt, die es den Zellen ermöglichen, sich an ihre Stoffwechselbedürfnisse anzupassen ^2,3,4. Autophagie wurde auch als zelluläre Stressreaktion im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten identifiziert, wie z. B. neurodegenerativen Erkrankungen, Infektionen mit Krankheitserregern und verschiedenen Krebsarten. Die Funktion der Autophagie bei Krebs ist komplex und hängt von der Art, dem Stadium und dem Status des Tumors ab. Es kann die Tumorentstehung durch autophagischen Abbau geschädigter Zellen unterdrücken, aber auch das Überleben fortgeschrittener Tumore fördern, indem es das Überleben der Zellen unter Stressbedingungen wie Hypoxie, Nährstoffmangel und zytotoxischen Schäden verbessert 2,4,5,6.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Hemmung der Autophagie einen Nutzen als Antikrebsstrategie bietet. Daher könnte die Hemmung kritischer Schritte, wie z.B. der Autophagosomenbildung oder deren Fusion mit dem Lysosom, eine wirksame Methode zur Krebskontrolle sein 2,4,5,6. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass ATG4B an bestimmten pathologischen Zuständen beteiligt ist, und es hat als potenzielles Ziel gegen Krebs Aufmerksamkeit erregt ^2,3,4. So wurde beispielsweise beobachtet, dass kolorektale Krebszellen und humane epidermale Wachstumsfaktorrezeptor 2 (HER2)-positive Brustkrebszellen signifikant höhere ATG4B-Expressionsniveaus aufwiesen als benachbarte normale Zellen ^2,4. In Prostatakarzinomzellen führte die Hemmung von ATG4B zu einer zelllinienspezifischen Empfindlichkeit gegenüber Chemo- und Strahlentherapie⁷. In jüngster Zeit gibt es starke Hinweise darauf, dass das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) besonders anfällig für eine ATG4B-Hemmung ist. In einem gentechnisch veränderten Mausmodell konnte beispielsweise gezeigt werden, dass ein intermittierender Verlust der ATG4B-Funktion das Wachstum von PDAC-Tumoren reduziert und das Überleben verlängert ^3,4. Insgesamt ist ATG4B bei einigen Krebsarten stark überexprimiert, hängt mit dem Fortschreiten des Tumors zusammen und ist mit der Resistenz gegen Krebstherapien verbunden ^2,4,8.

Die ATG4-Cystein-Proteasen in Säugetieren haben vier Familienmitglieder, ATG4A-ATG4D. Diese Proteine weisen eine gewisse Zielselektivität gegenüber der LC3/GABARAP (ATG8)-Proteinfamilie 9,10,11 auf und können zusätzliche Funktionen haben, die nicht mit ihrer Proteaseaktivität verbunden sind ^12,13. Darüber hinaus reguliert ATG4 eine neuartige posttranslationale Modifikation, die ATG8-Ylierung von Proteinen^11,12. Während ATG4B und sein Hauptsubstrat LC3B am besten untersucht sind, zeichnet sich ein Bild ab, das auf eine komplexe Rolle jedes Mitglieds der Unterfamilie bei der Regulation autophagischer und nicht-autophagischer Prozesse hindeutet. Dies wird durch ein komplexes Netzwerk von posttranslationalen Modifikationen bestätigt, die die ATG4B-Aktivität über Phosphorylierung, Acetylierung, Glykosylierung und Nitrosylierung regulieren 9,10,11,12,13.

Mehrere bekannte ATG4B-Inhibitoren wurden veröffentlicht 2,4,14,15. Diese eignen sich zwar als Forschungsinstrumente, aber ihr pharmakodynamisches Profil, ihre Selektivität oder ihre Wirksamkeit haben sie bisher von der Entwicklung als präklinische Kandidaten ausgeschlossen ^4,16. Insgesamt besteht ein dringender Bedarf, wirksamere und selektivere Verbindungen zu identifizieren. Oft sind die Verbindungen gute biochemische Inhibitoren der Proteinfunktion, aber ihre Wirksamkeit in zellbasierten Assays ist schlecht. Es gibt mehrere Assays zur Überwachung der ATG4B-Aktivität, darunter biochemische Methoden und zellbasierte Assays⁴. Wir haben zuvor einen einfachen, Lumineszenz-basierten Hochdurchsatz-Assay zur Überwachung der ATG4B-Aktivität in Zellen entwickelt ^8,17. Dieser Assay verwendet ein Luciferase-Protein aus Gaussia princeps (GLUC), das im extrazellulären Milieu stabil und aktiv ist und als Reaktion auf die proteolytische Aktivität von ATG4B induzierbar aus Zellen freigesetzt werden kann^18,19.

In diesem Reporterkonstrukt ist dNGLUC mit dem Aktin-Zytoskelett von Zellen verbunden. Ein proteasespezifischer Linker kann zwischen dem β-Aktin-Anker und dNGLUC eingeführt werden, wodurch das Sekret von der Spaltung des Linkers abhängig wird. Wir haben den offenen Leserahmen von LC3B in voller Länge zwischen β-Aktin und dNGLUC verwendet, um die LC3B-Spaltung 17,18,19 überwachen zu können. Obwohl der Sekretionsmechanismus von dNGLUC nur unzureichend verstanden ist, ist er spezifisch für die Überwachung der ATG4B-Aktivität, hängt nicht von der allgemeinen Autophagie ab, wie sie in ATG5-Knockout-Zellen auftritt, und wird durch unkonventionelle Mechanismen vermittelt, die kein klassisches Signalpeptid^benötigen 4,18,19. Wir haben diesen Reporter erfolgreich verwendet, um kleine Moleküle und siRNA-Bibliotheken zu screenen und neue Regulatoren der ATG4B-Aktivität zu identifizieren, wie z.B. die Akt-Proteinkinasen⁸. In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung dieses Luciferase-Reporters in einem halbautomatischen Hochdurchsatz-Screening-Format beschrieben.

Protokoll

HINWEIS: Der Analyseprozess ist in Abbildung 1 dargestellt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Produktion von Retroviren

HINWEIS: Das Plasmid, das für ActinLC3dNGLUC kodiert, ist pMOWS-ActinLC3dNGLUC²⁰. Verwenden Sie eine geringe Anzahl von Zellen für die Produktion von Viren mit hohem Titer (idealerweise weniger als P20).

1. Kultur HEK293T Zellen in Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO₂ , bis sie zu 80 % bis 90 % konfluent sind, bevor sie zur Transfektion ausgesät werden.
2. Am Tag vor der Transfektion werden die Zellen in eine 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/Well in 2 ml/Well des vollständigen Wachstumsmediums ausgesät. Inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO₂.
   HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, wenn Sie ein liposomales Transfektionsreagenz verwenden. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines nicht-liposomalen Reagenzes. Bevor Sie mit der Transfektion beginnen, lassen Sie das DNA-Transfektionsreagenz, die DNA und das Medium auf Raumtemperatur (~15 min) äquilibrieren.
3. Für jede Transfektion werden 200 μl serumfreies Medium in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Geben Sie in jedes Röhrchen die folgenden Mengen an Plasmiden: 1.000 ng pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 ng GagPol; 100 ng VSV-G.
   HINWEIS: Die Menge der Plasmide und das Volumen der hier aufgeführten Medien gelten für eine 12-Well-Platte. Wenn Sie einen anderen Plattentyp verwenden, passen Sie das Medienvolumen und die Plasmidmengen an, um die Endkonzentration von 5 ng/μl Transferplasmid, 4,5 ng/μl Packungsplasmid und 0,5 ng/μl Hüllplasmid zu erreichen. Es ist ein beliebiges Packungsplasmid zu verwenden, das gag- und polexprimierende Gene enthält, und ein beliebiges Hüllplasmid, das das VSV-G-exprimierende Gen enthält.
4. Das Durchstechflaschen mit dem DNA-Transfektionsreagenz 30 s lang vortexen. Pipettieren Sie 4 μl des Transfektionsreagenzes direkt in das Medium, das die verdünnte DNA enthält. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen vorsichtig kippen.
   HINWEIS: Berühren Sie mit den Spitzen nicht die Wände der Kunststoffröhrchen. Pipettieren Sie nicht auf und ab oder wirbeln Sie nicht.
5. Die Reaktion wird 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
6. Während der Inkubation der Reaktion wird das alte Medium von der 6-Well-Platte entfernt und durch 2 ml/Well frisches serumfreies Medium ersetzt.
7. Geben Sie jeden Transfektionskomplex tropfenweise in jede Vertiefung.
8. Schütteln oder schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung über die gesamte Well-Oberfläche zu gewährleisten.
9. Die Platte wird über Nacht bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO₂ inkubiert.
10. Nach 24 h wird das alte Medium durch ein frisches Komplettmedium (2 ml/Well) ersetzt und die Zellen für 72 h wieder in den befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO₂ zurückgeführt.
11. Nach 72 h wird der Überstand in einem konischen 50-ml-Röhrchen entnommen und 10 Minuten lang bei 4.000 × g bei 4 °C zentrifugiert, um abgestorbene Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Für die weitere Reinigung verwenden Sie eine große 60-ml-Spritze, um den Überstand durch einen 0,20-μm-Filter zu leiten. Sofort Einmal-Aliquots von 300 μl zubereiten und bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Vermeiden Sie einen Gefrier-Auftau-Zyklus, um die maximale Produktaktivität aufrechtzuerhalten.

2. Retrovirale Transduktion

1. Am Tag vor der Transduktion der Zellen werden die Zielzellen mit mittlerer Dichte (PANC1 bei 1 × 10 5 Zellen/Well) in eine 12-Well-Platte in 1 ml/Well Medium mit 10 % FBS und 1 % P/S ausgesät. Die Platte wird über Nacht bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von⁵ % CO₂ inkubiert.
   HINWEIS: Die beste Zelldichte muss im Voraus festgelegt werden, da verschiedene Zelltypen unterschiedliche Anheftungsfähigkeiten haben. Im Idealfall verwenden Sie eine Zelldichte, um eine Konfluenz von 40 % bis 50 % zu erreichen.
2. Die gefrorenen Retrovirus-Aliquots aus dem -80 °C-Gefrierschrank nehmen und vor jedem Gebrauch auf Eis auftauen.
   HINWEIS: Nicht verwendete Aliquots nicht wieder einfrieren.
3. In einem konischen 50-ml-Röhrchen wird eine Mischung aus viralem Überstand und Polybrene mit einer Endkonzentration von 8 μg/ml hergestellt.
   HINWEIS: Die nachfolgenden Volumina gelten für die Transduktion einer 12-Well-Platte, die ein Endvolumen von 500 μl/Well enthält. Das endgültige Volumen des viralen Überstandes kann abgeschätzt werden, indem eine Reihe von viralen Verdünnungen in Gegenwart von Polybren getestet werden. Höhere oder niedrigere Verdünnungen können verwendet werden, abhängig von den gewünschten Expressionsniveaus des Transgens und der Größe des verwendeten Gefäßes.
4. Entfernen Sie das alte Medium von der 12-Well-Platte und geben Sie 500 μl der Mischung in jede Well. Die Zellen werden mit dem viralen Überstand über Nacht bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO₂ inkubiert.
   HINWEIS: Bewahren Sie zwei Vertiefungen mit vollständigem Medium (kein viraler Überstand) auf, um sie als Kontrolle für die Auswahl zu verwenden.
5. Ersetzen Sie das virushaltige Medium durch ein frisches, vollständiges Wachstumsmedium (1 ml/Well). Legen Sie die Zellen für 48 Stunden zurück in den befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO₂ .

3. Gepoolte Populationsselektion und -pflege

1. Ersetzen Sie das Nährmedium durch ein Selektionsmedium (vollständiges Nährmedium mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml Puromycin). Überwachen Sie das Wachstum der Zellen und wechseln Sie die Selektionsmedien alle 2-3 Tage. Am Zusammenfluss expandieren Sie in eine 6-Well-Schale und dann in eine Gewebekulturschale mit 10 cm Durchmesser.
2. Halten Sie die Zellen mindestens so lange im Selektionsmedium, bis die Kontrollzellen (nicht transduziert) vollständig abgestorben sind.
   HINWEIS: Für erfolgreiche Ergebnisse wird empfohlen, vor Beginn des experimentellen Projekts die optimalen Konzentrationen von Puromycin zu bestimmen. Generieren Sie dazu eine Puromycin-Abtötungskurve, um die Mindestkonzentration zu bestimmen, die erforderlich ist, um nicht transduzierte Zellen zwischen 3 und 10 Tagen abzutöten.
3. Sobald die Zellen im Selektionsmedium wachsen, expandieren Sie die Zellen auf vollständigen Nährmedien und frieren Sie die Stammaliquoten für das experimentelle Projekt ein.
   HINWEIS: Notieren Sie sich die Durchgangsnummer und vermeiden Sie es, mit gepoolten Populationen aus gefrorenen Beständen mit mehr als fünf Durchgangszahlen zu arbeiten. Überprüfen Sie regelmäßig auf Mykoplasmenkontamination, bevor Sie den Test durchführen. Im Idealfall verwenden Sie vor jedem Assay eine frische Zellcharge, um das maximale Signal von Luciferase zu erhalten.
4. Halten Sie die Zellen im Selektionsmedium und säen Sie genügend Zellen aus, um die gewünschte Dichte am Tag vor dem Assay zu erreichen.

4. Zugabe von Verbindungen

HINWEIS: Die Kleinmolekülbibliothek von Selleckchem besteht aus etwa 4.000 Verbindungen, die in acht Reihen und 10 Spalten in fünfzig 96-Well-Platten mit einer Stammkonzentration von 10 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO) angeordnet sind.

1. Aliquot 30 μl der Verbindung in die entsprechende Vertiefung einer Ausgangsplatte, die mit einem nanoskaligen akustischen Flüssigkeitsspender kompatibel ist. Verwenden Sie eine 384-Well-Polypropylenplatte (384PP-Platte). Halten Sie diese Platten verschlossen und lagern Sie sie bei -20 °C.
   HINWEIS: Das hier beschriebene Screening-Protokoll gilt für insgesamt 10 Assay-Platten pro Tag; Als endgültige Assay-Konzentration wurde eine feste Konzentration von 10 μM zusammen mit einer Inkubationszeit von 24 Stunden verwendet.
2. Tauen Sie die Compound-Bibliotheksplatten bei Raumtemperatur auf.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Platte vollständig aufgetaut und auf Raumtemperatur ausgeglichen ist. Ein Temperaturgefälle über die Platte kann sich auf die Handhabung von Flüssigkeiten auswirken.
3. Geben Sie 50 nL/Well in eine 384-Well-Assay-Platte mit einem nanoskaligen akustischen Flüssigkeitsdispenser.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die im Programm ausgewählten Quell- und Zielplatten mit denen übereinstimmen, die für diesen Schritt verwendet wurden.
4. Erstellen Sie ein Dosierprogramm in einer Tabellenkalkulation.
5. Öffnen Sie die Software.
6. Öffnen Sie ein neues Protokoll. Wählen Sie auf der Registerkarte Protokoll die folgenden Optionen aus: Probenplattenformat, 384PP; Typ der Probenplatte, 384PP_DMSO2; und Zielplattentyp, CellCarrier-384 Ultra PN (Abbildung 2A).
7. Wählen Sie unter Auswahlliste die Importoption (Abbildung 2B) aus, um die Tabelle mit dem Dosierprogramm zu importieren (Abbildung 2C).
8. Wählen Sie die Option Protokoll ausführen (Abbildung 2D) aus, überprüfen Sie, ob die angezeigten Informationen korrekt sind, und klicken Sie auf Ausführen.
9. Klicken Sie im neuen Fenster mit dem Namen Ausführungsstatus (Abbildung 2E) auf Start und folgen Sie den Schritten, die in den Eingabeaufforderungsfenstern angezeigt werden (Abbildung 2F,G).

5. Zell-Seeding

1. Trypsinisieren Sie die Zellen aus einem Zellkulturkolben oder einer Zellkultur-Petrischale und neutralisieren Sie das Trypsin durch Zugabe von FBS-haltigen Medien.
2. Die Zellsuspension wird in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt und bei 390 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml vollständigem Wachstumsmedium.
3. Führen Sie eine Zellzählung durch.
4. Bereiten Sie die Zellsuspension mit 4,6 × 10⁷ Zellen in 230 ml vollständigem Nährmedium vor.
   HINWEIS: Dieses Volumen und die Zelldichte gelten für 10x 384-Well-Assay-Platten plus ein Totvolumen von zwei 384-Well-Platten.
5. Geben Sie 50 μl Zellsuspension in jede Vertiefung einer 384-Well-Assay-Platte, die in Abschnitt 4 vorbereitet ist.
   HINWEIS: Die Zellaussaat kann entweder manuell oder mit einem Großspender erfolgen.
6. Die Zellen werden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 %_CO2 für 24 h inkubiert.

6. Ernte des zellulären Überstandes

HINWEIS: Die hier verwendete Liquid-Handling-Roboterplattform führt das Liquid Handling mit einem Mehrkanalarm für 96 Spitzen durch. Wenn keine Liquid-Handling-Automatisierung verfügbar ist, kann das Protokoll durch den Einsatz von Mehrkanalpipetten an das Format mit niedrigem Durchsatz angepasst werden.

1. Konfigurieren Sie das Deck der Laborautomatisierungs-Workstation wie in Abbildung 3 dargestellt.
2. Platzieren Sie den Einwegstapel mit 96 Spitzen an Position P1 (Abbildung 3A).
   HINWEIS: Jeder Stapel mit 96 Spitzen besteht aus acht Einweg-Racks. Bei Verwendung eines Mehrkanalarms für 96 Spitzen wird die 384-Well-Platte in vier Quadranten unterteilt. Somit reicht jeder Spitzenstapel aus, um den Überstand von zwei Assay-Platten in zwei leere, festschwarze 384-Well-Platten zu übertragen. Der gesamte Spitzenstapel muss nach jedem Durchlauf von zwei Platten ausgetauscht werden.
3. Platzieren Sie die Assay-Platten an den Positionen P2 und P4 (Abbildung 3A).
4. Platzieren Sie die leeren, durchgehend schwarzen 384-Well-Platten an den Positionen P3 und P5 (Abbildung 3A).
   HINWEIS: Diese flexible und leistungsfähige Roboterplattform wurde für diesen Assay angepasst und es wurde ein spezielles Programm geschrieben (Abbildung 3B).
5. Holen Sie sich die Tipps von Position P1.
6. 10 μl Überstand von der Platte auf Position P2 absaugen und in die leere, durchgehend schwarze Platte an Position P3 überführen.
   HINWEIS: Die Spitzen sollten in angemessener Tiefe in den Vertiefungen positioniert werden, um den Überstand abzusaugen, ohne die Zellmonoschicht am Boden der Vertiefung zu stören.
7. Legen Sie die Spitzen in den Abfall an Position P6 (Abbildung 3A).
8. Wiederholen Sie die Schritte 6.5 bis 6.7 für die verbleibenden Vertiefungen der Platte an Position P2 und wiederholen Sie dann die gleichen Schritte, um den Überstand von Position P4 in Position P5 zu übertragen.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, den Überstand aufzufangen und in die entsprechenden Vertiefungen in die leere, durchgefärbte schwarze Platte zu geben (Abbildung 3C,D). Da sezerniertes dNGLUC in Zellkulturmedium sehr stabil ist, können die Platten versiegelt und bis zu 7 Tage bei 4 °C im Dunkeln aufbewahrt werden.

7. Luziferase-Assay

HINWEIS: Der im Reporter verwendete dNGLUC weist eine Blitzkinetik mit schnellem Signalabfall auf. Aufgrund des schnellen Abklingens der Lumineszenz nach Zugabe von Substrat (Coelenterazin) sollte der Plattenleser so eingestellt werden, dass er das Lumineszenzsignal in den Überständen misst; Injizieren Sie das Substrat in eine Vertiefung und lesen Sie diese nach einigen Sekunden gut ab. Verwenden Sie aus diesem Grund einen Plattenleser, der in der Lage ist, die Lumineszenz zu überwachen, und der mit einem Substratinjektor ausgestattet ist, um sicherzustellen, dass die Zeit zwischen den Injektions- und Leseschritten für alle Proben einheitlich ist. Die am Plattenleser verwendeten Einstellungen sind in Abbildung 4 zu finden.

1. Natives Coelenterazin als 1 mg/ml Stammlösung in angesäuertem Methanol (10 μl 3 M HCl auf 1 ml Methanol) herstellen.
   HINWEIS: Befolgen Sie die örtlichen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien für den Umgang mit Methanol im Labor und vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut. Bereiten Sie die frische Arbeitssubstratlösung vor, bevor Sie mit dem Assay beginnen.
2. Initialisieren Sie die Injektorpumpe (Abbildung 5A).
3. Spülen Sie den Schlauch mit deionisiertem Wasser ab (Abbildung 5B-D).
4. Spülen Sie den Schlauch mit Methanol ab.
5. Während Sie den Schlauch spülen, bereiten Sie die Arbeitssubstratlösung vor, indem Sie das Substrat im Verhältnis 1:100 verdünnen (für eine 384-Well-Platte 220 μl aus der Substratstammlösung in 21,8 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS]) geben).
6. Spülen Sie den Schlauch mit der Substratarbeitslösung ab (Abbildung 5B-D).
7. Legen Sie die Platte in das Lesegerät ein und starten Sie die Messung mit den in Abbildung 4 beschriebenen Einstellungen.
8. Wiederholen Sie die Schritte 7.6 bis 7.7 für alle Assay-Platten.
9. Wenn Sie mit allen Assay-Platten fertig sind, spülen Sie den Schlauch mit Methanol.
10. Spülen Sie den Schlauch mit deionisiertem Wasser ab.
    HINWEIS: Am Ende dieses Schritts erhält man rohe Luciferase-Werte, die mit der zellulären ATG4B-Aktivität korrelieren. Für die Normalisierung auf Zellzahlen sind die nächsten Schritte notwendig, indem die Zellzahl in jedem Well mittels Fluoreszenzmikroskopie gezählt wird.

8. Zellfixierung und Färbung

HINWEIS: Dieser Schritt kann manuell mit Hilfe einer Mehrkanalpipette oder mit einem Großspender durchgeführt werden.

1. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (in 1x PBS) für 15 min.
   HINWEIS: Befolgen Sie die örtlichen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien für den Umgang mit Paraformaldehyd im Labor und vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut. Führen Sie diesen Schritt nach Möglichkeit in einer Schutzhaube durch.
2. Dreimal mit 1x PBS waschen.
3. Die Kerne werden mit Hoechst 33342 verdünnt 1:5.000 in 1x PBS für 15 min gefärbt.
4. Dreimal mit 1x PBS waschen.

9. Bildaufnahme

HINWEIS: Führen Sie die Bildaufnahme mit einem automatisierten Mikroskop durch. Alternativ zur Bildaufnahme zur Bestimmung der Zellanzahl kann auch die intrazelluläre Luciferase-Aktivität bestimmt werden. Es gibt Vor- und Nachteile in Bezug darauf, ob man sich auf die Zellzahl oder auf die intrazelluläre Luciferase-Aktivität normalisiert, was im Folgenden diskutiert wird. Wir stellen fest, dass die Bestimmung der Zellzahl weniger invasiv ist und zu einer geringeren Variabilität führt als die Bestimmung intrazellulärer Luziferase-Werte.

1. Starten Sie die Bediensoftware des Mikroskops (Abbildung 6).
2. Wählen Sie auf der Registerkarte Einstellungen den richtigen vordefinierten Plattentyp aus. Wenn der Plattentyp nicht voreingestellt ist, geben Sie die Plattenabmessungen manuell ein.
3. Laden Sie die Platte in das Mikroskop, indem Sie auf die Option Auswerfen und Laden klicken.
4. Wählen Sie dann das Objektiv 20x Air (numerische Apertur [NA]: 0,4).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Objektivring auf den richtigen Wert eingestellt ist, damit er mit verschiedenen Plattentypen richtig fokussieren kann.
5. Wählen Sie unter Kanalauswahl die Option Hoechst 33342 aus.
   HINWEIS: Die Kanaleinstellungen für Zeit, Leistung und Höhe müssen entsprechend dem verwendeten Plattentyp optimiert werden.
6. Wählen Sie unter Layout definieren alle Wells aus der Platte und vier Felder aus dem Well aus.
7. Wählen Sie unter Online-Jobs den entsprechenden Ordner aus, um die Daten an die Analysesoftware zu übertragen.

10. Bildanalyse

HINWEIS: Jede Bildanalysesoftware kann verwendet werden, um Zellkerne aus den aufgenommenen Bildern zu segmentieren und zu zählen. Hier beschreiben wir die Schritte zur Verwendung einer bestimmten Online-Software, die mit mehreren automatisierten Mikroskopdateien kompatibel ist.

1. Starten Sie die Bildanalysesoftware.
2. Wechseln Sie zur Registerkarte Bildanalyse , um die Bildsegmentierung zu starten (Abbildung 7A).
3. Klicken Sie auf der Registerkarte Eingabebild auf das + -Zeichen, um einen neuen Baustein hinzuzufügen (Abbildung 7A).
4. Wählen Sie in der Liste die Option "Kerne suchen" (Abbildung 7A) und dann Hoechst 33342 als Kanaloption aus (Abbildung 7B).
5. Untersuchen Sie die segmentierten Objekte auf dem Bild visuell und wählen Sie die genaueste Segmentierungsmethode aus.
   HINWEIS: Für dieses Experiment haben wir Methode C verwendet (Abbildung 7C). Jede Methodenoption verfügt über Unterkategorien, die angepasst werden können, um die bestmögliche Segmentierung zu erhalten.
6. Klicken Sie dann auf die Registerkarte " Ergebnisse definieren " (Abbildung 7C) und wählen Sie " Standardausgabe " als Option "Methode " aus.
7. Wählen Sie in der Unterkategorie Kernanzahl der Objekte und Objektanzahl aus (Abbildung 7C).
8. Speichern Sie die Analyse-Pipeline mit der Option Analyse auf Festplatte speichern oder Analyse in Datenbank speichern .
9. Wählen Sie auf der Registerkarte Batch-Analyse die zu analysierenden Daten aus der Struktur aus.
10. Wählen Sie unter Methode die in Schritt 10.8 gespeicherte Analysepipeline aus.
    HINWEIS: Es ist auch möglich, eine Skriptdatei von außerhalb der referenzierten Software hochzuladen oder eine vorhandene Analyse hochzuladen, die in der Datenbank gespeichert ist.
11. Klicken Sie auf Analyse ausführen, um die Analyse zu starten (Abbildung 7D). Am Ende dieses Arbeitsablaufs werden zwei Datensätze generiert: rohe Luziferase-Werte aus den Überständen und die Zellzahl in jeder Vertiefung. Verwenden Sie beide, um den Luciferase-Wert pro Zelle zu normalisieren.

Ergebnisse

In einer früheren Veröffentlichung⁸ haben wir diesen Assay erfolgreich zum Screening von niedermolekularen und siRNA-Bibliotheken eingesetzt und neue Regulatoren von ATG4B identifiziert. Hier beschreiben wir das Protokoll und die repräsentativen Ergebnisse dieses Luciferase-Reporters in einem halbautomatischen Hochdurchsatz-Screening-Format. Abbildung 8 zeigt ein Beispiel für die Rohdatenanalyse sowohl für Zellkerne als auch für Lumineszenz. Ein typisches Ergebn...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen zellbasierten Reportergen-Assay zur Identifizierung von ATG4B-Inhibitoren. Die Identifizierung von primären Treffern basiert auf der Luciferase-Aktivität bei der Behandlung von Zellen, die den offenen Leserahmen von LC3B in voller Länge zwischen β-Aktin und dNGLUC exprimieren. Einige Vorteile dieses Assays sind, dass er empfindlich, hochquantitativ und nicht-invasiv ist, da er dNGLUC nachweisen kann, ohne die Zellen zu lysieren. In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll zur G...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)	Tecan	30038609	Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFlo	BioTek		bulk dispenser
Coelenterazine	Santa Cruz Biotechnology	sc-205904	substrate
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Version 2.9.1	image analysis software
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile	Beckman Coulter	001-14555	384PP plate
EnVision II	Perkin Elmer		luminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL	Selleckchem	L3600	Selleckchem
FMK9A	MedChemExpress	HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates	Greiner Bio-One	781076	solid-black 384-well plates
Harmony Imaging software	Perkin Elmer	Version 5.1	imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570	Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software	Labcyte/Beckman Coulter		nanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q water			deionized water
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer		automated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids	Perkin Elmer	6057300	CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC			Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck	TR-1003-G	polybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher	J61278.ME	Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot	Tecan		liquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche	Merck	6366244001	DNA transfection reagent